一種水培液中微生物基因組dna的提取方法
2024-04-06 01:04:05
一種水培液中微生物基因組dna的提取方法
【專利摘要】本發明涉及一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，屬於生物【技術領域】。本發明的提取方法先將水培液中的雜質通過定性濾紙進行過濾去除，進一步0.22μm的濾膜收集水體微生物，用液氮/65℃水浴的凍融方法破碎微生物細胞，再加入SDS及溶菌酶裂解細胞，CTAB結合蛋白質及多聚糖、游離核酸，加入酚、氯仿混合物萃取後，萃取液用異丙醇沉澱，最終獲得水體微生物基因組DNA。利用該方法提取的核酸純度較高，且產量較高。試驗證明，此法提取的水體微生物DNA，完整性好，純度較高，進一步純化後可用於下遊的基因組文庫構建、qPCR、高通量測序等。
【專利說明】一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 水培種植法作為無土栽培的重要形式，具有節肥、節水、省工、省藥、高產、優質、潔 淨等優點。由於其不受時間限制，可供植物利用的營養充分、均勻等優點，因而在現代農業 設施生產過程中逐漸被大範圍採用。在這些水培種植系統中，微生物也廣泛存在於水培液 中，這些微生物能夠對溶液中的礦質營養元素以及植物根系釋放的次生物質進行轉化，在 植物與礦質養分之間起到了重要的媒介作用，因而是水培種植條件下，植物能夠正常生長 發育的重要因子。因此，研究水培液中微生物的結構組成與數量分布，能夠為優化植物的最 佳水培種植條件提供重要基礎。然而，由於傳統的微生物研究方法存在著無法獲得環境中 全部微生物的限制因素，由此導致對相應環境中微生物遺傳背景信息的了解也不全面，從 而也限制了水體微生物宏基因組信息的深入發掘。利用現代生物技術，如高通量測序技術， 以及基於PCR的末端限制性長度態性（T-RFLP)技術、單鏈構型多態性（SSCP)、變性/溫度 梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE)技術，長度多態性（AFLP)技術則克服了傳統培養方法所造成的 土壤微生物信息大量丟失的弊端，更加全面、精確地揭示出水體微生物群落結構和功能的 多樣性。
[0003] 對於此，如何簡便快捷地從水培液中獲得微生物的DNA是深入研究水培液中微生 物組成的關鍵，由於水培液的相對體積大，微生物分布分散，直接提取往往會因為樣品初始 體積、微生物數量低而導致提取效率低下，因此需要研製適用於水體微生物DNA提取的方 便、快捷、實用的方法，解決使用常規方法所獲得的微生物總量少、細胞裂解率低、DNA產量 低的問題。
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，利用該方法提取的核酸 純度較高，且產量較高。
[0005] -種水培液微生物基因組DNA的提取方法，包括以下步驟： (1) 水體樣品雜質的去除：取l〇(T250ml的水培液用定性濾紙過濾:Γ5次，並收集濾 液；進一步用孔徑為〇. 22 μ m的濾膜進行超濾，通過濾膜收集水體中的菌體，剪碎濾膜並置 於10ml的離心管中； (2) 水體微生物細胞裂解：往步驟（l)10ml的離心管中加入500 μ 1無菌水，漩渦震蕩， 然後在液氮2?3 min和65°C水浴5min中反覆凍融:Γ5次，凍融結束後，於4°C 13000rpm 下離心lOmin，棄上清，收集沉澱，加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉澱，加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴1?3h，再加入500 μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴 T2h ； (3) 核酸游離及沉澱：步驟（2)溫浴結束後加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C 預熱的3XCTAB/NaCl，65°C溫浴lh，待冷卻後，加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的體 積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心lOmin，取上清，再加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯 仿的體積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心lOmin，將上清移至新管並加入等體積預冷的異 丙醇，-20°C放置lh，然後4°C llOOOrpm離心20min，棄上清，沉澱用70%乙醇重懸並於 4°C llOOOrpm下離心lOmin，棄上清，沉澱於超淨工作檯中吹乾後溶於3(T50ul的無菌水 中，-80°C保存。
[0006] 所述水培液微生物基因組DNA的提取方法，優選的步驟如下： (1)水體樣品雜質的去除：取l〇〇ml的水溶液用定性濾紙重複過濾3次，以去除水體中 含有的雜質，並收集濾液；進一步用孔徑為〇. 22 μ m的濾膜進行超濾，通過濾膜收集水體中 的菌體，剪碎濾膜並置於l〇ml的離心管中。
[0007] 水體微生物細胞裂解：往離心管中加入500 μ 1無菌水，漩渦震蕩，液氮凍2min後 置於65°C水浴鍋中溫浴5min，如此反覆凍融3次。凍融結束後，樣品於4°C 13000rpm下離 心10min，棄上清，收集沉澱。加入100μ1 1XTE，重懸沉澱。加入30μ1 50mg/ml的溶菌 酶，37°C溫浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴lh。
[0008] 核酸游離及沉澱：加入200μ 1 5M的NaCl，加入100μ 1 65°C預熱的3XCTAB/ NaCl，65°C溫浴lh。待冷卻後，加入等體積酚氯仿，酚、氯仿的體積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心10min，取上清，再加入等體積的酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，將上清 移至新管。加入等體積的預冷異丙醇，_20°C放置lh，4°C llOOOrpm離心20min，棄上清。 沉澱用70%乙醇於4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉澱於超淨工作檯中吹乾後溶於 30ul的無菌水中。
[0009] 本發明的提取方法先將水培液中的雜質通過定性濾紙進行過濾去除，進一步 0. 22 μ m的濾膜收集水體微生物，用液氮/65°C水浴的凍融方法破碎微生物細胞，再加入 SDS及溶菌酶裂解細胞，CTAB結合蛋白質及多聚糖、游離核酸，加入酚、氯仿混合物萃取後， 萃取液用異丙醇沉澱，最終獲得水體微生物基因組DNA。所得的核酸的純度可達1.758,濃 度達15. 3 μ g/ μ 1。對提取的DNA進行純化，可進行16srDNA的擴增和螢光定量PCR分析， 結果見圖3、4、5,證實本發明的方法提取水體微生物DNA的有效性。反覆試驗證明，此法提 取的水體微生物DNA，完整性好，純度較高，進一步純化後可用於下遊的基因組文庫構建、 qPCR、高通量測序等。
[0010] 本發明的顯著優點： 1.適合於不同來源的水培液以及水體，具有廣譜適用性。
[0011] 2.所得的DNA完整性好、純度較高。
[0012] 3.提取便捷、無需複雜的處理工藝，提取的條件不嚴格。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為不同水稻水培液中微生物DNA的電泳檢測結果，其中1-4泳道為水稻品種 Lemont水培液中的微生物DNA; 5-8為水稻品種PI312777水培液中的微生物DNA。
[0014] 圖2為稗草水培液中水體微生物DNA的電泳檢測結果，其中1-3泳道為稗草的酚 酸水培液中的微生物DNA; 4-6為稗草的萜類水培液中的微生物DNA。
[0015] 圖3為以水培液微生物DNA為模板進行16srDNA的PCR擴增產物電泳檢測結果， 其中1表示以水稻品種Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴增產物，2表示以水稻 品種PI312777水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴增產物，3表示lOObp DNA Marker， 4表示以稗草Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴增產物。
[0016] 圖4為以水稻水培液微生物DNA為模板進行16srDNA的定量PCR檢測結果。
[0017] 圖4 (1)表示定量PCR的擴增曲線。
[0018] 圖4 (2)表示定量PCR的熔解曲線。
[0019] 圖5為以水稻水培液微生物DNA為模板進行ITS的定量PCR檢測結果。
[0020] 圖5 (1)表示定量PCR的擴增曲線。
[0021] 圖5 (2)表示定量PCR的熔解曲線。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1 本發明的水培液微生物基因組DNA的提取方法，具體步驟如下： (1) 原料：水稻的水培液，來自福建福州(福建農林大學教學農場）； (2) 水體樣品雜質的去除：取100ml的水稻水溶液用定性濾紙進行過濾，以去除水體中 含有的雜質，重複過濾3次，收集濾液；進一步用孔徑為0. 22 μ m的濾膜進行超濾，通過濾膜 收集水體中的菌體，剪碎濾膜並置於l〇ml的離心管中，用於提取基因組DNA。
[0023] ⑶水體微生物細胞裂解：往離心管中加入500 μ 1無菌水，漩渦震蕩，液氮凍2min 後置於65°C水浴鍋中溫浴5min，如此反覆凍融3次。凍融結束後，樣品於4°C 13000rpm下 離心lOmin，棄上清，收集沉澱。加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉澱。加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴lh。
[0024] (4)核酸游離及沉澱：加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C預熱的CTAB/ NaCl(3X)，65°C溫浴lh。待冷卻後，加入等體積酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，取上 清，再加入等體積的酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，將上清移至新管。加入等體積的 預冷異丙醇，-2〇°C放置lh，4°C llOOOrpm離心20min，棄上清。沉澱用70%乙醇於4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉澱於超淨工作檯中吹乾後溶於30ul的無菌水中。取 5μ1 DNA水溶液，於1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。檢測結果見圖1，其中1-4泳道均為水稻 品種Lemont水培液中的微生物DNA; 5-8均為水稻品種ΡΙ312777水培液中的微生物DNA， 從圖中可見各個泳道中的DNA條帶清晰，條帶亮度，泳道中的雜質背景淡，重複性好，提取 效果佳。以此DNA模板，利用qPCR對細菌、真菌的數量進行檢測，其中細菌16srDNA的qPCR 擴增曲線見圖4(1)，圖中A箭頭指示以水稻品種PI312777水培液DNA為模板進行qPCR的 擴增曲線，B箭頭指示以水稻品種Lemont水培液DNA為模板進行qPCR的擴增曲線，兩種 DNA模板的擴增過程中CT值重複性好。圖4(2)表示細菌16srDNA熔解曲線，箭頭C指示 16srDNA熔解曲線形成的峰。真菌ITS的qPCR擴增曲線見圖5(1)，圖中D箭頭指示以水 稻品種PI312777水培液DNA為模板進行qPCR的擴增曲線，E箭頭指示以水稻品種Lemont 水培液DNA為模板進行qPCR的擴增曲線，兩種DNA模板的擴增過程中CT值重複性好。圖 5(2)表示細菌ITS熔解曲線，箭頭F指示ITS熔解曲線形成的峰。從圖中可以看出各熔解 曲線主峰單一，並明顯高於基線。上述試驗結果表明運用此方法提取得到的DNA能夠用於 下遊的試驗，進一步對水培液中的微生物數量進行計算，結果顯示每毫升PI312777水培液 中約有細菌1200個，真菌1465個；每毫升Lemont水培液中約有細菌490個，真菌190個。
[0025] 實施例2 (1) 原料：稗草的水培液，來自福建福州(福建農林大學教學農場）； (2) 水體樣品雜質的去除：取100ml的稗草水溶液用定性濾紙進行過濾，以去除水體中 含有的雜質，重複過濾3次，收集濾液；進一步用孔徑為0. 22 μ m的濾膜進行超濾，通過濾膜 收集水體中的菌體，剪碎濾膜並置於l〇ml的離心管中，用於提取基因組DNA。
[0026] ⑶水體微生物細胞裂解：往離心管中加入500 μ 1無菌水，漩渦震蕩，液氮凍2min 後置於65°C水浴鍋中溫浴5min，如此反覆凍融3次。凍融結束後，樣品於4°C 13000rpm下 離心lOmin，棄上清，收集沉澱。加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉澱。加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴lh。
[0027] (4)核酸游離及沉澱：加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C預熱的CTAB/ NaCl(3X)，65°C溫浴lh。待冷卻後，加入等體積酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，取上 清，再加入等體積的酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，將上清移至新管。加入等體積的 預冷異丙醇，-2〇°C放置lh，4°C llOOOrpm離心20min，棄上清。沉澱用70%乙醇於4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉澱於超淨工作檯中吹乾後溶於30ul的無菌水中。取 5 μ 1 DNA水溶液，於1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。檢測結果見圖2,其中1-3泳道為稗草的酚 酸水培液中的微生物DNA; 4-6為稗草的萜類水培液中的微生物DNA，從圖中可見DNA的條 帶清晰，條帶亮度，泳道中的雜質背景淡，重複性好，提取效果佳。以此DNA模板，利用qPCR 對其中粘細菌的數量進行檢測，結果顯示稗草的酚酸水培液中每毫升最高含有粘細菌800 個，稗草的萜類水培液中每毫升最高含有粘細菌260個。
[0028] 此外，分別以實例1、實例2中的水稻品種PI312777、Lemont以及稗草水培液中微 生物的DNA為模板進行細菌16srDNA的PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如 圖3,其中泳道1是以水稻品種Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴增產物，泳道 2是以水稻品種PI312777水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴增產物，泳道是4以稗草 Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴增產物，從圖中可以看出16srDNA條帶清晰， 亮度高，此結果再次說明了運用此方法提取得到的DNA能夠用於下遊的試驗。
【權利要求】
1. 一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，其特徵在於：所述方法具體包括以下 步驟： (1) 水體樣品雜質的去除：取l〇(T250ml的水培液用定性濾紙過濾:Γ5次，並收集濾 液；進一步用孔徑為〇. 22 μ m的濾膜進行超濾，通過濾膜收集水體中的菌體，剪碎濾膜並置 於10ml的離心管中； (2) 水體微生物細胞裂解：往步驟（l)10ml的離心管中加入500 μ 1無菌水，漩渦震蕩， 然後在液氮2?3 min和65°C水浴5min中反覆凍融:Γ5次，凍融結束後，於4°C 13000rpm 下離心lOmin，棄上清，收集沉澱，加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉澱，加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴1?3h，再加入500μ1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴 T2h ； (3) 核酸游離及沉澱：步驟（2)溫浴結束後加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C 預熱的3XCTAB/NaCl，65°C溫浴lh，待冷卻後，加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的體 積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心10min，取上清，再加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯 仿的體積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心10min，將上清移至新管並加入等體積預冷的異 丙醇，-20°C放置lh，然後4°C llOOOrpm離心20min，棄上清，沉澱用70%乙醇重懸並於 4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉澱於超淨工作檯中吹乾後溶於3(T50ul的無菌水 中，-80°C保存。
【文檔編號】C12N15/10GK104087573SQ201410270513
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】方長旬, 林文雄, 李程勳, 李穎哲, 林威鵬 申請人:福建農林大學