枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用的製作方法

2024-02-29 11:41:15

枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用，具體為枸杞（LyciumchinenseMiller）中犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的克隆。通過提取新鮮枸杞葉片中的總RNA，克隆了枸杞中的犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPS2，得到基因完整的序列為1246bp；構建了大腸桿菌表達載體pET28a-LmGGPS2，通過大腸桿菌異源表達系統，得到了LmGGPS2表達蛋白；並構建了雙元植物表達載體pCAMBIA2300-LmGGPS2，電擊法將載體轉入農桿菌C58細胞，用這種細胞轉化菸草，得到轉基因菸草，通過測試，發現轉基因菸草大大提高了植物西紅柿紅素的含量，類胡蘿蔔素的含量也有所提高。
【專利說明】枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用，具體為枸杞chinense Miller)中犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因
的克隆。
【背景技術】
[0002]犛牛兒基犛牛兒焦磷酸(GGPP)是生物界普遍存在的重要中間代謝產物.在植物中，GGPP參與葉綠素、類胡蘿蔔素、赤黴素、質體醌、維生素Ε、單萜和苯醌等產物的合成，對植物光合作用、生長發育和產品品質等有重要影響。該產物由GGPS直接催化合成。GGPP不僅是類胡蘿蔔素生物合成的最直接的前體物質，還是植物體內赤黴素、葉綠素和質體醌等前體物質。GGPP的合成是類胡蘿蔔素合成中的限速過程。通過一系列的酶促反應，產生的西紅柿紅素不僅賦予西紅柿鮮豔的色澤，而且具有重要的營養保健價值。醫學研究表明，血清中高含量的西紅柿紅素可顯著地降低各種癌症的發病率，血液中的西紅柿紅素含量與前列腺癌、消化道癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、皮膚癌等多種癌症的發生機率呈負相關，研究表明人體中高西紅柿紅素含量能顯著的降低前列腺癌的發生機率。西紅柿紅素保護心腦血管的作用主要是通過其抗氧化作用，降低血清脂質和低密度脂蛋白的過氧化作用，從而減少動脈硬化和冠心病的發病率，高西紅柿紅素的攝入能顯著的降低心腦血管疾病的發病機率。西紅柿紅素還具有提高免疫力、延緩衰老等作用。
[0003]西紅柿紅素能夠猝滅單線態氧、清除自由基，防止蛋白質和DNA受到氧的破壞等作用。西紅柿紅素清除單線態氧的能力是目前常用抗氧化劑維生素E的10倍，β-胡蘿蔔素的2倍。西紅柿紅素分子在所有類胡蘿蔔素中含有的共軛雙鍵的數量最多，其淬滅單線態氧速率常數是維生素E的100倍，是抗氧化能力最強的類胡蘿蔔素。西紅柿紅素的化學結構決定了其具有很強的去除活性氧和`自由基的能力，是一種有效的抗氧化劑。而且類胡蘿蔔素，尤其是β_胡蘿蔔素能抑制、清除體內自由基，可以延緩衰老和預防腫瘤、血栓、動脈粥樣硬化等疾病。類胡蘿蔔素能增加免疫系統中B細胞的活力、消滅外源入侵的病原菌，能提高淋巴輔助T細胞的活力，協助B細胞產生抗體，並提高其它免疫組分的活性；還能增加自然殺傷細胞的數目，以消除機體內被感染的細胞或癌細胞。
[0004]在植物中，GGPS基因與其它酶共同作用下生成二萜、四萜和多萜化合物。GGPS是合成二萜、四萜和多萜的關鍵酶。菸草萜類化合物與菸葉香氣密切相關，它們不但作為重要的菸草香氣前體物存在於菸葉中，而且在煙氣中也發現了菸葉中具有的大部分類萜化合物。如二萜是葉面腺體膠質分泌物的主要組成成分，其主要成分是西柏三烯二醇，它的降解產物茄酮及其衍生物是重要的香味物質；四萜化合物類胡蘿蔔素是菸葉中重要的致香物前體物，其降解產物如大馬酮、紫羅蘭酮、巨豆三烯酮等是菸葉中重要致香成分。在我國菸葉生產中，增加菸葉萜類化合物含量，特別是與香氣品質密切相關的香氣前體物質如二萜、類胡蘿蔔素等在菸葉中的積累，可增加菸葉香氣量，改善菸葉香氣品質。因此，研究轉基因GGPS菸草具有重要意義。
[0005]植物類胡蘿蔔素合成的步驟如下:3-甲基_3，5-二羥基戊酸(MVA)在酶的催化作用下合成異戊烯焦磷酸(IPP)，異戊烯焦磷酸(IPP)首先在異戊烯焦磷酸異構酶(IPI)的作用下生成帶有丙烯基結構的同分異構體二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)，它是異戊稀合成途徑中必需的前體物質，DMAPP和IPP經過連續的縮合依次生成犛牛兒基焦磷酸(GPS)、法呢基焦磷酸(FPP)、犛牛兒基犛牛兒基焦磷酸(GGPP)。兩分子的GGPP由八氫西紅柿紅素合成酶(PSY)催化聚合成八氫西紅柿紅素。八氫西紅柿紅素經過連續的脫氫反應生成順式結構的原西紅柿紅素(prolycopene),原西紅柿紅素在胡蘿蔔素異構酶(CRTISO)的作用下異構成反式結構西紅柿紅素。西紅柿紅素隨後相應環化酶的催化下，生成a、胡蘿蔔素，並進一步生成其它類型的色素(Tanaka et al., 2008)。
[0006]隨著人類對西紅柿紅素和類胡蘿蔔素藥用價值及醫療保健作用的不斷發現，對西紅柿紅素和類胡蘿蔔素的種類和產量的需求也將越來越大，然而，西紅柿紅素類胡蘿蔔素很難用化學方法合成。現代分子生物學研究手段的發展，使得西紅柿紅素和類胡蘿蔔素生物合成途徑中的一系列關鍵酶的基因被陸續分離鑑定，為通過DNA重組技術和遺傳工程調控生產西紅柿紅素和類胡蘿蔔素開闢了道路，特別是通過類胡蘿蔔素基因工程獲得「金色水稻」和「金油菜」，極大地增強了人們開展植物類胡蘿蔔素基因工程的信心。
[0007]萜類化合物是植物代謝物中數量最多的一類化合物，由異戊二烯為結構單元組成。在植物體的呼吸作用、光合作用，以及生長、發育、繁殖、信號轉導和防禦中發揮著重要作用。某些萜類化合物具有重要的經濟價值，還有些可被用作天然香料和香味化合物或抗腫瘤化療藥。在植物中，萜類化合物的生物合成發生在細胞質和質體中，其前體物質是C5
結構的異戍烯基焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate , IPP )及其同分異構體-二甲
基烯丙基焦憐酸酯(Dimethylal`lyl pyrophosphate ,DMAPP)。經由甲輕戍酸(Mevalonicacid, MVA)途徑合成的IPP是合成法呢基焦憐酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP，C15)的前體物，FPP最終在細胞質中合成為倍半萜、三萜以及留醇。在質體中甲基赤蘚糖醇憐酸(methyl-erythritol-phosphate, MEP)途徑合成的IPP和DMAPP是生成猶牛兒基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate ,GPP ,C10)的前體物。GPP在單職合成酶的作用下生成單職；在物牛兒基物牛兒焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate Synthase,GGPPS)作用下生成物牛兒基物牛兒焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP，C20)，進而在酶的作用下生成二萜、四萜和多萜化合物。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在於提供一種枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因。
[0009]本發明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。
[0010]本發明的目的還在於提供含有該基因的重組載體和宿主細胞。
[0011]本發明的另一個目的在於提供該基因的用途。
[0012]本發明提供了一種枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因如序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列構成。
[0013]本發明提供了一種上述枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因編碼的蛋白質，如序列表中SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列的蛋白質。[0014]本發明提供了一種上述枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因重組克隆載體 pMD18-T-ZM^P5^。
[0015]含有上述的枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的重組載體，這些重組載體包括質粒。
[0016]所述的質粒表達載體大腸桿菌表達載體mHGGPS2。
[0017]含有上述的枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的重組載體，這些重組載體包括質粒。
[0018]所述的質粒表達載體大腸桿菌表達載體pET28a_LmGGPS2。
[0019]所述的質粒表達載體雙元植物表達載體pCAMBIA2300-LmGGPS2。
[0020]含有上述枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的完整編碼閱讀框序列的宿主細胞，如含有上述重組載體的宿主細胞也屬於本發明的保護範圍。
[0021]所述的宿主細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或菸草細胞。
[0022]本發明提供了一種含有LmGGPS2基因的工程菌。
[0023]上述枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的應用包括該基因編碼的蛋白在植物中的應用；用所述的重組載體，如植物表達載體轉化玉米細胞；或者用所述含有該基因的農桿菌與玉米、大豆、向日葵、馬鈴薯、棉花、穀子、大麥以及花卉和蔬菜等細胞共培養，得到轉基因的再生植株；或者用所述的遺傳轉化獲得上述物種轉基因植株。
[0024]本發明的技術方案具體概述如下:` 本發明的克隆方法包括下述步驟:
從枸杞新鮮葉片中提取總RNA,根據轉錄組Unigene序列中枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的核苷酸序列設計上遊引物LmGGPS2_Yl: 5』 -GTCATGTCTATGCTAATAGGTGT-3，, LmGGPS-Rl: 5，-GGTCA
GTTTCTGATGGAGAAATT-3』，PCR擴增獲得該基因全長序列1246bp。
[0025]本發明構建含有犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的大腸桿菌表達載體pET28a-和植物表達載體pCAMBIA2300-ZM^/^^，由下述步驟組成:
O構建含有犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的中間載體pMD18-T-ZM^/^J?。
[0026]以LmGGPS-Fl/ LmGGPS-Rl為引物，以枸杞cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物連接於PMD18-T載體，獲得含有序列表中SEQ ID N0.1所示的LmGGPS2基因的中間載體 pMD18-T-LmGGPS2。
[0027]2)構建大腸桿菌表達載體pET28a- LmGGPS2
以LmGGPS-Fl/ LmGGPS-Rl為引物，以枸杞cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物連接於PMD18-T載體，並轉化到感受態大腸桿菌T0P10中，菌落PCR驗證後，提取質粒，用BamHI和SalI雙酶切該質粒，將pET28a空載體用BamHI和SalI雙酶切，分別純化後進行連接，得到大腸桿菌表達載體pET28a- LmGGPS2。
[0028]3)構建植物表達載體 pCAMBIA2300-LmGGPS2
以LmGGPS-Fl/ LmGGPS-Rl為引物，以枸杞cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物連接於PMD18-T載體，並轉化到感受態大腸桿菌T0P10中，菌落PCR驗證後，提取質粒，用BamHI和SalI雙酶切該質粒，將pCAMBIA2300-35S_0CS空載體用BamHI和SalI雙酶切，分別純化後進行連接，得到植物表達載體pCAMBIA2300-LmGGPS2。
[0029]本發明提供了一種枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用。首次從枸杞中分離出編碼犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的完整cDNA，連接到大腸桿菌表達載體上，利用外源表達系統驗證枸杞基因的表達蛋白；然後連接到植物表達載體上，利用農桿菌侵染法轉化菸草，獲得轉基因植株，通過研究表明轉基因植株的類胡蘿蔔素含量有所提高，即本發明在增強植物類胡蘿蔔素含量等方面具有廣泛應用。
[0030]本發明所述的枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因ZM^/^^可望用於製備轉基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、穀子、大麥以及花卉和蔬菜植株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031 ] 圖1.為LmGGPS2全長PCR擴增電泳圖。
[0032]圖2.為 pMD18-T_LmGGPS2 載體示意圖。
[0033]圖3.為 pET-28a_LmGGPS2 載體示意圖。
[0034]圖4.為 pCAMBIA2300-LmGGPS2 載體示意圖。
[0035]圖5.為轉基因菸草基因組PCR。
[0036]圖6.為轉基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、穀子、小麥、棉花基因組PCR。
[0037]圖7.為轉基因月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶蘭基因組PCR。
[0038]圖8.為轉基因楊樹基因組PCR。
[0039]【具體實施方式】
[0040]實施例1
枸杞中犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的克隆
從枸杞新鮮葉片中提取總 RNA，利用 3』FULLRACE Core Set Ver.2.0 (TaKaRa, Japan)
試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA,具體步驟參照說明書,反應體系如下:
【權利要求】
1.一個枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因，其特徵在於該基因為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因編碼的蛋白質，其特徵在於所述的蛋白質為SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列。
3.—種重組載體，其特徵在於含有權利要求1所述的枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因的全序列或部分片段。
4.一種權利要求3所述的重組載體，其特徵在於它是質粒表達載體大腸桿菌表達載體pET28a-LmGGPS0
5.一種權利要求3所述的重組載體，其特徵在於它是重組植物表達載體pCAMBIA2300-LmGGPS。
6.一種宿主細胞，其特徵在於含有權利要求1所述的犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因全序列或部分片段。
7.—種權利要求6所述的宿主細胞，其特徵在於它是農桿菌細胞，菸草細胞。
8.—種權利要求1所述的枸杞犛牛兒基犛牛兒焦磷酸合成酶基因應用於製備轉基因玉米、大豆、水稻、花生 、向日葵、馬鈴薯、棉花、穀子、大麥以及花卉和蔬菜植株。
【文檔編號】C12N15/82GK103820475SQ201310555823
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】季靜, 王罡, 賈翠翠, 吳電雲, 曹海燕 申請人:天津大學