斑茅抗旱cDNA表達譜晶片及其應用的製作方法
2024-04-05 15:15:05
專利名稱：：斑茅抗旱cDNA表達譜晶片及其應用的製作方法斑茅抗旱cDNA表達譜晶片及其應用
技術領域：
本發明涉及一種基因晶片及其應用，特別是一種斑茅抗旱cDNA表達譜晶片及其應用。
背景技術：
：我國人均水資源佔有量僅2300立方米，只有相當於世界人均佔有量的四分之一，每公頃耕地水資源佔有量約為世界公頃均佔有量的五分之四。乾旱成為制約我國農業生產的關鍵因素之一，嚴重影響我國農業的國際競爭力和糧食安全。根據發達國家的生產實踐證明，選育抗旱性強、水分利用率高的作物或品種是提高農業水分效率的最有效措施之一。克隆分離抗旱功能基因並遺傳轉化優異農作物品種以提高抗旱性具有重要的意義。植物對乾旱等逆境的適應是一複雜的生理生化過程，涉及眾多基因的表達和代謝途徑的啟動，如信號因子、防禦相關蛋白、滲透調節物質、DNA結構及轉錄調節蛋白等。植物抗旱cDNA表達譜晶片是一種高通量、高效率研究植物抗旱機制和篩選抗旱基因的重要載體。抑制消減雜交技術是由Diatchenko等於1996年以mRNA差別顯示技術為基礎建立起來的篩選未知差異表達基因的新技術。它主要基於最近出現的抑制PCR，並結合標準化(normalization或equalization)和消減雜交(substractivehybridization)。抑制PCR通過利用含引物序列的雙連結頭(adaptor)充當引物模板，使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段具有反向末端重複序列，PCR中不能擴增，從而達到抑制非目的片段而選擇性擴增目的片段的目的。標準化步驟平衡了目的基因群中cDNA的豐度，即低豐度差異表達的基因不會丟失，而高豐度差異表達的基因又不會被過量分離。消減雜交則扣除了目的基因群(tester)與驅趕基因群(driver)間的同源序列(DiatchenkoLetal.iVocAto/1996;93:6025)。通過消減雜交過程使不同豐度的cDNA拷貝數趨於平衡，保證了低豐度cDNA得到有效富集，而雜交後採用的兩次巢式PCR可有效降低假陽性，因而在分離差異表達基因的相關研究中得到廣泛應用。在消減文庫構建後，如何進行大量候選基因的鑑定與表達分析是後續實驗中關鍵的技術問題。cDNA晶片技術採用的是mRNA反轉錄標記探針，因而相當程度上反映了mRNA原來的真實豐度，具有高通量和高效率的優點。YangGP等(1999)的研究表明，SSH克隆經cDNA微陣列鑑定與經Northern鑑定的結果符合率高達90%，將SSH文庫和cDNA表達譜晶片技術相結合，是差異表達基因分離、鑑定的理想策略。目前基因克隆的常用技術為同源PCR克隆和圖位克隆。由於生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高於非編碼區的序列，因此同源克隆是在其它種屬的同源基因被克隆的前提下,構建cDNA文庫或基因組文庫,然後以已知的基因序列為探針篩選目的克隆；或者根據已知基因的序列設計併合成一對引物,從植物中提取DNA進行PCR擴增，擴增的片段純化後連接到合適的載體上,用酶切分析和序列分析檢測重組子,並與已知基因序列進行比較，如目前己在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分離出富含甲硫氨酸的蛋白及其編碼基因(MasumuraTetal，1989.PlantMolBiol，12:123130)。而圖位克隆是根據遺傳連鎖分析，染色體步移將基因定位到染色體的一個具體位置上後不斷縮小篩選區域進而克隆該基因，研究該基因的功能或抗性的生化機制,這樣一種策略叫圖位克隆(MonacoAP，1994.CurrentopiiiGenetDev，4:360~365)。同源克隆技術是在近緣物種已分離同源基因的基礎上，通過設計引物進行PCR擴增，進而結合cDNA末端快速擴增技術分離基因，無法一次獲得大量系列基因片段，也無法分離植物新基因；圖位克隆技術需要有植物遺傳群體，並要求有較完整的分子標記技術體系，一次只能分離一個基因。劉文榮等(2007)在《作物學報》2007.33(6)上發表了"乾旱脅迫下斑茅消減文庫的構建及分析"的文章，介紹了乾旱脅迫下斑茅消減文庫的構建方法。中國實用新型專利ZL01214517.3公開了一種用於轉基因產品鑑定的基因檢測晶片，在平面型支承載體的平面上被覆有帶正電荷材料的膜層，在該膜層的表面以微點陣方式排布有供轉基因植物判斷用的外源基因探針。專利號為01104063.7的發明專利"聚合酶鏈式反應基因晶片製作方法"，介紹了一種基因晶片的製作方法，在體積很小的晶片內一次可進行大量的聚合酶鏈式反應(PCR)。斑茅是一種抗旱、耐瘠的野生植物。本發明針對上述
背景技術：
，通過構建斑茅乾旱脅迫抑制消減文庫印製cDNA表達譜晶片，應用所印製的cDNA表達譜晶片分析植物旱脅迫響應基因，進而分離系列抗旱全長基因，為植物抗旱基因工程奠定良好的技術基礎。
發明內容本發明的目的是提供一種斑茅抗旱cDNA表達譜晶片，並提供利用其大量快速分離植物抗旱基因的方法。本發明涉及一種應用抑制消減雜交技術(SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)結合cDNA表達譜晶片分析，分離抗旱基因的方法，包括乾旱脅迫消減文庫的構建、應用消減文庫製備cDNA表達譜晶片、晶片雜交篩選乾旱脅迫響應基因片段以及cDNA末端快速擴增(RACE)獲得抗旱關鍵基因。所解決的技術問題是製備斑茅抗旱cDNA表達譜晶片，並利用其大量快速分離甘蔗抗旱基因。具體內容是，以乾旱脅迫下斑茅葉片組織的cDNA為目的基因群(tester)，正常生長條件下斑茅葉片組織cDNA為驅趕基因群(driver)，利用抑制性消減雜交技術構建斑茅乾旱脅迫消減文庫；應用PCR技術擴增所獲得消減文庫克隆，同時利用同源克隆分離看家基因片段作為基因晶片的陽性參照，製備斑茅抗旱cDNA表達譜晶片；應用製備的cDNA表達譜晶片對甘蔗乾旱脅迫下的基因表達進行分析，篩選乾旱脅迫下上調表達的uniqueEST，並對若干個ESTs表達進行實時螢光PCR驗證；應用cDNA表達譜晶片篩選到的上調表達的uniqueEST片段結合RACE技術分離系列抗旱功能基因。本發明的斑茅抗旱cDNA表達譜晶片，具有平面型支撐載體的平面，其上被覆有帶正電荷材料的膜，在該膜的表層設有點陣，點陣上排布樣點，其特徵在於所述的樣點來源於斑茅抗旱消減文庫中克隆的PCR產物，其長度不大於500bp，並含有陽性參照和陰性參照；樣點一般為矩陣排布，單個矩陣排布12X16個樣點，每個樣點在晶片矩陣內設置2次重複，共48個亞矩陣。所述抗旱消減文庫按劉文榮等(2007)在《作物學報》上介紹的方法構建；所述的陽性參照，是以看家基因04^屍//和^^71乍為基因晶片的陽性參照；所述的陰性參照，指DMSO點樣液和POLYA80。本發明的一種利用斑茅抗旱cDNA表達譜晶片大量快速分離甘蔗抗旱基因的方法，包括以下步驟1、RNA的提取、純化和線性放大；2、螢光探針的製備、純化和定量；3、晶片雜交；4、雜交後晶片清洗；5、cDNA表達譜晶片的數據分析；6、抗旱關鍵基因的實時PCR驗證；7、抗旱關鍵基因的克隆。本發明的斑茅抗旱cDNA表達譜晶片及利用其大量快速分離甘蔗抗旱基因的方法，是建立在乾旱消減文庫的基礎上，再經cDNA表達譜晶片雜交篩選，可保證候選基因的精確，對相關植物的研究背景要求不高，可以一次大量分離抗旱相關基因；本發明所分離的基因與植物水分脅迫響應機制緊密相關，可能分離到低豐度基因，同時可能在植物上獲得首次分離的基因；由於設立了檢測的質量控制系統如陰陽對照、空白對照，保證了檢測結果的特異性，達到高效、靈敏、準確、高通量平行檢測的效果。圖1為斑茅抗旱cDNA表達譜晶片單個cDNA矩陣排列圖；其中A處的4個質控點，前2個分別為陽性質控點和^Pir，後2個分別為陰性質控點DMSO點樣液和POLYA80;圖2為斑茅抗旱cDNA表達譜晶片的掃描全圖；圖3為EA09-063的晶片表達與實時定量PCR結果比較；圖4為利用斑茅抗旱cDNA表達譜晶片分離的甘蔗鳥氨酸轉氨酶編碼基因核苷酸序列和推演的胺基酸序列。具體實施方式為進一步更詳細地闡明本發明而不是限制本發明，以下結合實施例加以說明。本發明所使用的儀器和試劑如下1、主要儀器Eppendorfcentrifuge5417c型離心機、Eppendorfcentrifuge5810型離心機、EppendorfmastercyclerPCR儀、Ultrospec2100pro核酸蛋白測定儀、NarigatorTMN34120電子天平、MDF-U4086S超低溫冰箱、晶片點樣儀(GeneMachine公司的OmniGrid100)、凝膠成像系統、晶片掃描儀為AxonGenepix4000BScanner2、生化試劑TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0;SMARTPCRcDNASynthesisKit、Avantage2PCRKit禾口PCR-Selectc腿SubtractionKit(Clontech);QIAEXIIGelExtractionKit(Qiagen);pMD18-Tvector(TaKaRa);TRIZOL試劑(Invitrogen);MessageAmpaRNAKit(Ambion);Cy5和Cy3(Amersham);RACE試劑盒購自Clontech公司；所有限制性內切酶、克隆載體pMD18-T、T4連接酶、LATaq和EXTaqSYBGREENI購自TaKaRa;螢光定量PCR擴增引物由TaKaRa公司合成；T叫PlusIDNAPolymerase、DNAMarker、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒和一些常規試劑購自上海生工、廈門泰京及寶生物等公司。實施例一種斑茅抗旱cDNA表達譜晶片的製備方法，包括利用消減文庫所獲得的克隆，通過晶片雜交、實時PCR驗證以及RACE技術分離甘蔗抗旱功能基因，具體包括以下步驟一、乾旱脅迫下斑茅抗旱消減文庫的構建以不同乾旱脅迫下斑茅(5"acc/wrwmarwrnZ/wacewwiefe)口十片組織的cDNA為Tester,正常生長條件下斑茅葉片組織cDNA為Driver,利用抑制性消減雜交技術構建斑茅乾旱脅迫消減文庫。抑制消減雜交採用CLONTECH公司PCR-SelectTMcDNASubtractionKit提供的試劑並完全按照試劑盒說明書進行。巢式PCR產物直接連接到pMD18-T載體中，16。C連接過夜，然後再將連接產物轉化至E.coliDH5a菌株中，用含有200uLX-Gal(20mg.mL")、100nLIPTG(100mmoLL")禾卩100uLAmp+(80mg.mL")的LB培養皿(平皿直徑為150mm)37"C倒置培養過夜，然後根據藍白斑篩選陽性克隆。隨機挑取16個陽性克隆，重新活化，用Btype:PlasmidIsolationKit提取質粒DNA，以T載體克隆位點兩端的HindIII和EcoRI雙酶切，以質粒DNA為模板對插入片斷進行PCR擴增和檢測。二、斑茅抗旱cDNA表達譜晶片的製備斑茅抗旱cDNA表達譜晶片選取耙標GL4PZ)//、^P/r片段和含3858個抗旱消減文庫的克隆片段，長度在189400bp之間。以POLYA80為陰性對照，G^PZ)//和v4屍Wr作為陽性對照，50%DMSO點樣溶液為空白對照。調整各靶基因濃度0.25ug.uU1。圖l所示為單個矩陣排布為i2X16的晶片；圖2所示為抗旱消減文庫的克隆在矩陣內重複2次，共48個亞矩陣，陽性參照04PZ)//禾n^wr的PCR片段在每個亞陣內1個，共48個重複。所用點樣儀為GeneMachine公司的OmniGrid100。三、利用斑茅抗旱cDNA表達譜晶片大量快速分離甘蔗抗旱基因的方法正常供水和斷水15d後(中度乾旱脅迫)甘蔗葉片提取的RNA分別經由Cy5-dUTP和Cy3-dUTP標記，混合後與上述印製的包含3858個克隆的斑茅抗旱cDNA表達譜晶片進行雜交，用AgilentScanner進行晶片掃描，掃描結果如圖2所示，並用Genespring6.0軟體分析晶片數據(見圖2)。計算Cy3螢光信號的平均強度與Cy5螢光信號平均強度的比值，比值大於2.0的克隆為表達上調的差異基因，小於0.5為表達下調的差異基因，介於兩者之間的為沒有明顯差異表達的基因。具體步驟如下1、總RNA的提取、純化和線性放大採用Invitrogen的TRIZOL試劑盒提取正常供水和水分脅迫處理的甘庶葉片總RNA，試驗嚴格按說明書操作；RNA的純化採用QIAGENRneasy試劑盒純化總RNA，嚴格按試劑盒說明書操作；RNA的線性放大採用AmbionMessageAmpaRNA試劑盒，嚴格按試劑盒說明書操作。2、螢光探針的製備、純化和定量(O螢光探針的製備*從-85'C冰箱中取出RNA，在室溫下解凍，然後在0.2mLPCR管中配製反應溶液。總RNA50-100ngRandomPrimer(6mer)3ng無核酸酶的水XnL總體積10(iL*7(TC預變性510分鐘，變性反應結束後在PCR管中配製cDNA第一鏈合成反應體系4.02.01.01.01.01.0205Xfirst-strandbufferO.lmol/LDTTUnlabeleddNTPmixCy3/Cy5dCTP(1mmol/L)RNA抑制劑SuperscriptII(200U/L)總體積注意從此步驟開始要避光操作。*42。C溫育2小時，7。C變性5分鐘。在PCR管中加入2jiL2.5mol/L的NaOH水解RNA終止反應，37。C溫育15分鐘，加入IO)iL2mol/LHEPES中和。(2)螢光探針的純化純化步驟採用QIAGENRneasy試劑盒純化總RNA，嚴格按試劑盒說明書操作。(3)螢光探針的定量*將純化好的探針轉入酶標板，分別測定A260、A550、A650。*定量Cy3probe(pmol)=A550洗脫體積/0.15Cy5probe(pmol)=A650洗脫體積/0.25*定量完後的探針吸回PCR管，真空加熱抽乾，避光保存於-2(TC，待雜交。注通常lng的mRNA反轉錄標記可以得到30pmol左右的螢光探針。3、晶片雜交*取出經定量的Cy3和Cy5標記的探針，各取出約30pmo1，共用9pL水充分溶解混合於0.2mLPCR管內。*將溶解的探針置於PCR儀中94r變性3分鐘左右，取出加入HumanCot-1DNA1-2ng，放回PCR儀中，70°C保溫45分鐘。*反應結束後，加入10pL4倍雜交緩衝液和2(^L甲醯胺，總體積達至廿4(VL，充分混勻。*取雜交液滴加於晶片上，蓋上蓋玻片。將雜交晶片水平放入加有PBS的雜交盒或者溼盒，置42"C雜交箱中避光雜交1618小時。4、雜交後晶片清洗*雜交結束後，用鑷子取出片子，浸入經過55"C預熱的洗液I(IXSSC/0.SDS)中，上下抽動，使蓋玻片從晶片上自然脫離，然後在55°C洗液I中洗滌10分鐘。*從洗液I中取出片子，浸入55'C預熱的洗液II(0.1XSSC/0.2^SDS)中，洗滌10分鐘，然後再轉入新的洗液n中，重複2次。*從洗液II中取出片子，室溫洗液III(0.1XSSC)洗滌5分鐘，重複2次。*取出晶片於去離子水中室溫洗滌2分鐘。*用鑷子小心將片子取出，迅速轉入50mL空離心管中，1500rpm離心5分鐘，乾片。*最後將晶片取出立即掃描或放入晶片盒，避光保存於乾燥器中。5、cDNA表達譜晶片的數據分析*通過使用Genepix4000bScanner來獲取圖像掃描像素值10pm，PMT(。/。)數值:100。圖像是16-bittiff文件。*數據讀取使用Axon掃描儀，所得到的圖像為兩種螢光的複合圖，經過自動和人工定位與排列，確定雜交點的範圍，過濾背景噪音，提取得到基因表達的螢光信號強度值，最後以列表形式輸出，從而完成將掃描得到的圖像定量轉化為數值。輸出的數據通常需要包括信號強度、背景、信噪比等參數，通常為文本文件。*標準化處理由於樣本差異、螢光標記效率和檢出率的不平衡，需對cy3和cy5的原始提取信號進行均衡和修正才能進一步分析實驗數據，Normalization正是基於此種目的。數據導入分析軟體Genespring7.2(http〃www.agilent.com)，用Backgroundsubtractionbasedonnegativecontrols禾口perspotandperchipIntensitydependentnormalization(non-linearorLOWESSnormalization)'方法標準化，計算得到ratio值(兩種螢光cy3與cy5的比值)。*Ratio分析認為ratio值在0.5-2.0範圍內的基因不存在顯著的表達差異，而在該範圍之外的基因則被認為表達出現顯著改變。以信號Cy5和Cy3的信號強度分別為橫軸和縱軸作散點圖。以各重複Ratio值取log2值來製作相關係分析圖和計算相關係數。*檢出率的計算方法:計算陰性點DMSO的Cy3,Cy5平均強度與2倍平均方差的和x，所有Cy3，Cy5—signal大於x且Cy3—S/N和Cy5—S/N都大於2的信號點為檢出點，檢出點個數與全部基因點個數的比為檢出率。6、抗旱關鍵基因的實時PCR驗證根據斑茅抗旱cDNA表達譜晶片雜交分析，獲得的EST序列，設計定量PCR引物(見表l)。如表1所示，PCR反應體系為25nl:SYBRPrimixExTaqTM(2x)12.5pL，上遊(OAT-F)和下遊(OAT-R)引物各0.5pl，cDNA模板2.5^1，無菌水9pl。每個樣品設置3個重複。反應條件如下95"C下預變性10s，94。C下變性5s、60"C下退火25s、讀取螢光值，40次循環，循環後設置6(TC至90每隔0.2t:讀熒值生成融解曲線。所有設定保存後運行程序。反應完成後，選擇PCRbaselinesubstrated模式進行數據分析和修正。在調整baselinecycles和計算thresholdvalue(閾值)後，得出cyclethreshold(Ct值)。在樣品擴增的同時，以實驗中不同處理的cDNA模板混合樣進行IO倍梯度稀釋製作標準曲線。以目的基因和25sriA^特異引物進行擴增來獲得標準曲線，縱坐標為f臨界循環值Ct，橫坐標為稀釋濃度的對數值。根據標準曲線所得的線性計算公式，將樣品的值代入公式，得到其相對濃度。同一模板中目的基因和持家基因的相對濃度的比值即可作為目的基因相對表達水平。表l螢光定量PCR引物序列表tableseeoriginaldocumentpage12EA09-063的晶片表達與實時定量PCR結果比較如圖3所示。7、抗旱關鍵基因的克隆以斑茅抗旱cDNA表達譜晶片分析所獲得EST(Ea09-63)序列的全長克隆為例。EST(Ea09-63)通過NCBI比對分析表明為S-鳥氨酸轉氨酶基因。根據斑茅抗旱cDNA表達譜晶片分析所獲得EST(Ea09-63)序列，用PrimerPrimier5.0設計S-鳥氨酸轉氨酶基因3'端特異引物，而後根據所獲3'端序列和cDNA微陣列分析所獲得EST(Ea09-63)的拼接結果，設計5'RACE引物GSP2，結合試劑盒引物UPM進行RT-PCR反應；人工拼接上述所獲序列，結合測序峰圖進行校正，獲得其全長序列；最後根據所拼接的全長序列，在5'端設計一條引物GSP3同TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0的Ml3PrimerM4配對，利用反轉錄試劑盒擴增出OAT全長cDNA片段。具體實驗方法參照SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit說明書。甘蔗OAT基因克隆的引物及相關信息如表2所示。表2甘蔗04r基因克隆的引物及相關信息表引物名稱;l物序列(方向均為5'至3')PCR程序備註GSP1試劑盒UPMCCAGATGGCTATTTGAAAGGTGLong(0.4CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTShort(2(iM):CTAATACGACTCACTATAGGGC(94°C30s,66。C30s,72°C3min，)2個循環；(94。C30s，65。C30s,72。C3min，),2個循環；(94°C30s，63。C30s，72°C3min，)4個循環；(94°C30s，60'C30s,72°C3min，)23個循環；4'C保溫。3'RACEGSP2GTAACTCGTCCCTAAACTCCTGTCCT(94°C30s,68°C45s)2個循環；試劑盒Long(0.4,:CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACG(94°C30s,65°C30s,72。C3min，)，2個循環；(94°C30s,64。C30s,72°C35'RACEUPMCAGAGTShort(2nM):CTAATACGACTCACTATAGGGCmin，)4個循環；(94。C30s,62。C30s，72°C3min，)25個循環；4'C保溫。GSP3M13primerTTGCGCAGGATGTGCTCGAGCTCGGGTTTTCCCAGTCACGAC94.(TC3min;(94.0。C30s，65.0。C45s，72.0。C55s)35個循環;72.0。C2min;4.0。C保溫。全長擴增3'RACEPCR擴增體系PCR-GradeWater34.5(xl10*Advantage2PCRBuffer5(xldNTPMix(lOmmol/L)1^150*Advantage2PolymeraseMixlplGSP1(10,ol/L)UPM5pl3'反轉錄產物cDNA2.5plTotal50pl5'RACEPCR擴增體系PCR-GradeWater34.5^110xAdvantage2PCRBuffer5^1dNTPMix(10mmol/L)50Advantage2PolymeraseMixGSP2(lOpmol/L)UPM5nl5'反轉錄產物cDNA2，Total5(^1所獲得鳥氨酸轉氨酶編碼基因如圖4所示，cDNA全長1782bp，5'端非編碼區150bp，GC含量高；包含一個1362bp編碼454個胺基酸的開放讀碼框(ORF)，3端非編碼區270bp，poly(A)上遊有兩個聚腺苷酸五鹼基AATAAA。將基因編碼區序列在GenBank中進行BLAST分析，發現其與玉米(Zeawa_ys,BT024061)的同源性達96%，與水稻(0_yzas^/va，NM—001057288)同源性達87%，與擬南芥(Jra6Wo/w/;Aa//awa，NM—123987)和葡萄(Wfev/m/era，AF1775卯)的同源性均為74%。權利要求1、一種斑茅抗旱cDNA表達譜晶片，具有平面型支撐載體的平面，其上被覆有帶正電荷材料的膜，在該膜的表層設有點陣，點陣上排布樣點，其特徵在於所述的樣點來源於斑茅抗旱消減文庫中克隆的PCR產物，其長度不大於500bp，並含有陽性參照和陰性參照。2、根據權利要求l所述的一種斑茅抗旱cDNA表達譜晶片，其特徵在於所述的樣點為矩陣排布，單個矩陣排布12X16個樣點，每個樣點在晶片矩陣內設置2次重複，共48個亞矩陣。3、一種利用斑茅抗旱cDNA表達譜晶片大量快速分離甘蔗抗旱基因的方法，包括以下步驟-(1)RNA的提取、純化和線性放大；(2)螢光探針的製備、純化和定量；(3)晶片雜交；(4)雜交後晶片清洗；(5)cDNA表達譜晶片的數據分析；(6)抗旱關鍵基因的實時PCR驗證；(7)抗旱關鍵基因的克隆。全文摘要本發明的一種斑茅抗旱cDNA表達譜晶片及其應用，涉及一種運用抑制消減雜交技術結合cDNA晶片分析為基礎來快速分離抗旱基因，其方法包括旱脅迫消減文庫的構建、應用消減文庫的製備cDNA晶片、晶片雜交篩選乾旱脅迫響應基因片段以及cDNA末端快速擴增(RACE)。利用本發明的利用斑茅抗旱cDNA表達譜晶片大量快速分離植物抗旱基因的方法克隆抗旱基因具有效率高，可以分離植物抗旱相關新基因和低豐度基因優點，已利用該方法分離獲得系列與植物抗旱緊密相關的基因全長。文檔編號C12Q1/68GK101235420SQ20081007062公開日2008年8月6日申請日期2008年2月5日優先權日2008年2月5日發明者張木清,張積森,陳如凱申請人:福建農林大學