核酸配基組晶片及其製備方法
2024-04-05 14:35:05
專利名稱：核酸配基組晶片及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種核酸配基的生物晶片檢測技術，尤K:涉及一種採用配體和配基作用原理，通過固載相關系列特異性寡核苷酸配 基，並行集成捕捉混合物中靶分子配體，再對靶分子配體實施定性和定量檢 測的核酸配基組晶片；本發明同時涉及一種核酸配基組晶片的製備和使用。
背景技術：
生物晶片技術是近年來興起的一項綜合性的高技術，它以微機電系統技 術和生物技術為依託，將生命科學研究中的許多不連續過程(如樣品製備、々-:化反應、檢測等步驟)集成並移植到一塊普通郵票大小的晶片上去，並使 這^分散的過程連續化、微型化，以實現對大量生物信息進行快速、並行處理.的耍求。1-:物晶片概念的提出受到了計算機晶片的啟發。狹義的生物晶片是指包塊在固相載體(如矽片、玻璃和塑料等)上的高密度DNA、蛋白質、細胞等 微陣列晶片，如cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列和蛋白質微陣列等。這些微 陣列由生物活性物質以點陣的形式有序地固定在固相載體上形成。在一定的 條件f進行生化反應，將反應結果用化學螢光法、酶標法、電化學法顯示， 然後用專用的生物晶片掃描儀或電子信號檢測儀採集數據，最後通過專門的 計算機軟體進行數據分析。廣義的生物晶片是指任何能對生物分子進行快速 並行處理和分析的微型固體薄型器件。自從1991年福多爾(S.P.A.Fodor)等人提出DNA晶片至今，以DNA 晶片為代表的生物晶片技術已經得到了快速的發展。生物晶片則是在很小几 何尺度的表面積上，裝配一種或集成多種生物活性，僅用微量生理或生物採 樣，即可以同時檢測和研究不同的生物細胞、生物分子和DNA的特性，以 及它們之間的相互作用，獲得生命微觀活動的規律。生物晶片可以粗略地分 為細胞晶片、蛋白質晶片(生物分子晶片)和基因晶片(即DNA晶片)等 兒類，都有集成、並行和快速檢測的優點。隨著人類基因工程的發展，基因晶片(即DNA晶片)得到迅速的發展。 DNA晶片又稱為寡核苷酸陣列或雜交陣列分析，它是根據DNA雙螺旋原理 而發展的核酸鏈間分子雜交的技術。它的基本結構是在晶片表面能夠製備成 千上萬的基因單元作為配基，對待測基因進行篩選。待測基因通過PCR擴增 技術得到數量放大，再進行螢光標記，使其在篩選過程中產生可識別的螢光 發射或光譜轉移。此螢光信號被螢光顯微鏡檢出，達到基因識別的目的。將 已知的DNA (探針)和未知的核酸序列之間的一方以有序的陣列固定到載玻 片或矽片上，再與螢光標記的另一方進行雜交。當螢光標記的--方在DNA 晶片上發現互補序列時即發生雜交，雜交的結果以螢光和模式識別分析來檢 測。DNA晶片技術可以快速分析大量的基因信息，從而使生物醫學工作者可 以研究並收集基因表達和變異信息。目前國內外已有公司生產並銷售的DNA 晶片有兩類， 一類是在晶片上原位合成待測的寡核苷酸，再與螢光標記的 DNA探針放在一起，當DNA探針雜交到寡核苷酸陣列上後，互補序列通過 螢光掃描確定。該寡核苷酸陣列格式可用於檢測變異，在基因中定位目標區 域，和基因表達的研究，以及確定基因功能。另一類DNA晶片利用微量點樣技術在晶片上製作互補DNA (cDNA) 陣列再與螢光標記的DNA探針雜交。cDNA陣列格式用於快速篩選。如位 於Santa Clara CA的Affymetrix公司生產的GeneChip，含高密度的DNA探 針陣列，可以用於人類基因組中遺傳信息的分析。具特殊用途的DNA探針 陣列可以在人類基因組中快速篩選已知的DNA序列。DNA晶片還可用於監 測不同的人體細胞和組織基因表達，以檢測癌症或其它疾病所對應的基因的 變化。隨著DNA晶片及雜交技術的發展，DNA晶片將有可能直接應用於臨 床診斷，藥物開發和人類遺傳診斷。寡核苷酸晶片的主要原理與cDNA晶片類似，主要通過鹼基互補配對原 則進行雜交，來檢測對應片段是否存在、存在量的多少。它與cDNA晶片的 本質差別在於寡聚核苷酸晶片固定的探針為特定的DNA寡聚核苷酸片段(探 針)，而後者為cDNA。基因表達晶片的兩個重要參數是檢測的靈敏度和特異 性。cDNA晶片由於基因長短不同以至Tm值各異，眾多的基因在同一張芯 片上雜交，使得雜交條件很難同一，使得傳統的cDNA晶片的分辨能力受到 限制。寡聚核苷酸晶片序列選擇經過優化，利用合成的一定長度(如20， 30， 70-mer等)的寡核苷酸單鏈探針代替全長cDNA點樣，製成晶片。其優點 無需擴增，防止擴增失敗影響實驗；減少非特異雜交，能有效區分有同源序 列的基因；雜交溫度均一，提高雜交效率；減少二級結構。此外，寡核苷酸晶片還可以通過原位合成法製備，而cDNA晶片只能通過後者製備。上述特 點使得寡核苷酸晶片的應用日益廣泛。但是當寡核苷酸序列較短時，單一的 序列不足以代表整個基因，需要用多段序列。蛋白質晶片的發展已經經歷了約十年的時間，現己出現了相對成熟的技 術，如瑞典的BIACORE的單元晶片，中科院力學所的多元蛋白質光學晶片 和美國的SELDI質譜晶片等。它們的共同特點都是將生物分子(蛋白和DNA)作為配基，固定在固體晶片表面或表面微單元上，以單一、或面陣、或序列 式。利用生物分子間的特異結合的自然屬性，待測分子與配基分子在晶片表 面會形成生物分子複合物。然後，檢測此複合物的存在與否，達到對蛋白質 的探測、識別和純化的目的。以上不同技術的差異僅在探測方法的不同。 BIACORE技術利用表面等離子體共振技術檢測晶片，進行單一蛋白質檢測； 多元蛋白質光學晶片是光學成象法，可以同時檢測多種混合的蛋白質；SELDI 技術則採用質譜法，以時間順序檢測序列蛋白質。指數級富集的配基進化體系(SELEX技術)是在九十年代初發展起來的 一種新的組合化學技術。它是應用大容量的隨機寡核苷酸庫，並結合PCR體 外擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過幾輪或數十輪 篩選過程，獲得高親和力、高特異性的核酸配基(aptamer)。它適應近代分 子生物學大規模、快速、系統篩選的要求，具有較多的優點，如庫容量大、 篩選周期短、適用靶分子範圍廣、篩選的配基與靶分子親和力強，特異性高 等。自1990年Ellington和Gold.首先利用此技術成功的篩選出有機染料分子 和噬菌體T4DNA聚合酶的特異配基以來，SELEX技術得到了迅猛發展。應 用SELEX技術篩選的靶分子已從開始的一些核酸結合蛋白如DNA聚合酶、 HIV-1反轉錄酶等，擴展到非核酸結合蛋白如細胞生長因子、激素、小肽、 抗體以及ATP、胺基酸等小分子有機物(如ATP)，甚至金屬離子、糖、有 機染料，以及完整的細胞、病毒、孢子等。另外，消減SELEX (subtractive SELEX)可將與兩個複合耙中非目的相同靶分子作用的寡核苷酸先行去除， 提高篩選效率，迅速獲得特異適配子的優勢。因此，與其他文庫篩選技術相 比，SELEX技術適應範圍更加廣泛。發明內容本發明的目的提供一種利用特異性寡核苷酸配基組結合配體，對大量生 物信息進行快速、並行集成處理的核酸配基組晶片。
本發明的另一 目的是提供該核酸配基組晶片的製備方法。 本發明還有一個目的，即提供一種利用上述核酸配基組晶片檢測配體的 方法。木發明的核酸配基組晶片，是將靶物質特異性寡核苷酸配基組集成固定 在載休上製成配基組晶片；其中靶物質特異性的寡核苷酸配基組是利用指數 級富集的酉己-基進化系統(the systematic evolution of ligands by exponential enrichment,簡寫SELEX)篩選獲得的靶物質特異性的寡核苷酸捕捉配基組。 所述寡核苷酸捕捉配基的一端帶有可連接固化配基的活化基團，該活化基團 通過包被在載體上的鏈黴親和素固定在載體上。所述靶物質特異性的寡核苷酸捕捉配基為一段20-40個鹼基的寡核苷酸 片段，其--端帶有固著基團，如生物素等，並通過與鏈黴親和素固定在載體 上；另--端形成捕捉配體的配基結構。所述特異寡核苷酸捕捉配基可以為能與配體直接結合的單鏈DNA。如 ssDNA、 dsDNA或RNA;靶物質特異性配體可以是核酸、蛋白質、多肽、 有機染料、ATP、金屬離子類的任何分子。所述載體為硝酸纖維素濾膜、玻片或磁球等。載體可根據晶片的不同用 途選擇。本發明核酸配基組晶片的製備方法，是由以下工藝步驟完成① 利用SELEX技術篩選相關配體的特異性寡核苷酸配基；② 在載體上包被鏈黴親和素，用封閉液封閉；其中述載體可採用硝酸纖 維素濾膜、玻片或磁球等；封閉液可採用含5%牛血清白蛋白、奶粉PBS等 封閉液。③ 將載體與末端帶有生物素的不同種類和數量的配基在37'C下共同孵 育30分鐘，然後用洗滌液洗滌三次，洗滌三次，3min/次，即製備成核酸配 基組晶片。其中洗滌液可採用SHCMK(PH7.35)+0.05°/。Tween20。本發明利用核酸配基組晶片檢測配體的方法，利用特異寡核苷酸配基組 結合配體的原理，對相關配體的系列標誌靶分子信息進行快速、並行集成處 理，包括①製備檢測配體將檢測液與核酸配基組晶片在37'C下共同孵育30分 鍾，用洗漆液洗滌三次，3min/次，然後用洗脫緩衝溶液洗脫下配體，即製備 出配體混合液。洗滌液可採用SHCMK(PH7.35)+0.05%Tween20;所述洗脫 緩衝溶液為SHCMK (PH 7.35) +0. 5%Tween 20。②檢測將釆集製備的配體混合液用特異序列質譜分析鑑定；或用信標 配基PCR擴增進行檢測；或採用雷射解析蛋白圖譜進行分析。本發明還可以利用BIACORE技術，通過核酸配基組晶片進行單一蛋白 質檢測；還可用SELDI技術，以時間順序檢測晶片上序列配體的質量和數量。本發明的特異寡核苷酸配基組是通過SELEX技術針對配體篩選出的一 端帶有生物素的一段20-40個鹼基的寡核苷酸片段，可通過與鏈黴親和素固 定在載體上，形成配基組的結構，可捕捉配體。在特異寡核苷酸配基組晶片 中加入檢測樣品，經孵育，使配基捕捉被檢測配體；再將捕捉的被檢測配體 用洗脫液洗下來，即並行完成多種配體的集成採集。將採集的配體用特異序 列質譜(S叫uence-specific MS/MS)分析鑑定，使配體得到定性和定量檢測。本發明相比現有技術具有如下優點1、 本發明的核酸配基組晶片，是利用固載的特異性寡核苷酸配基組對目 標靶物質某一特性的所有標誌性配體實施集成捕捉，聚集，並通過相關的檢 測技術，完成對耙物質總體性能實施全面動態檢測監控。2、 本發明的核酸配基晶片應用範圍廣該晶片可識別的配體範圍，包 括蛋白、酶、非核酸結合蛋白如細胞生長因子、激素、小肽、抗體以及ATP、 胺基酸等小分子有機物(如ATP)，甚至金屬離子、糖、有機染料，以及完 整的細胞、病毒、孢子等。3、 本發明的核酸配基晶片可重複使用由於本發明的配基和配體是非 共價結合(是以特異性結合捕捉集成靶物質的方式結合)，當配體從配基和配 體複合物中分離後，可對配基重新復性再次使用。4、 本發明核酸配基晶片的檢測靈敏度高、特異性強、微量、多樣定性和 定量檢測，操作簡單，便於多種類、多分子、多靶系統檢測研究等。5、 本發明的配基組成靈活適應性廣核酸配基晶片利用SELEX技術篩 選獲得的特異寡核苷酸配基製作而成，核酸配基晶片可針對不同的目的設立 配基組，可對多種類靶分子快速、並行處理。
圖1為5'生物素化的捕捉配基 圖2為配基檢測機理圖3為核酸配基晶片和質譜聯用同時檢測四種配體的機理(1 ) peptide from HIV-1 Rev; (2) NS3 protease protein; (3) TAR RNA element of HIV-1; (4) MS2 coat protein為四種捕捉配基固定在載體上，製成 微陣晶片。通過該晶片捕捉集成樣品中的配體，再利用檢測技術，如質譜; 信標配基等方法，對配體進行定性定量。
具體實施方式
實施例一酶標板核酸配基晶片的製備和檢測腫瘤的方法第一步製備生物素配基利用SELEX技術篩選腫瘤標誌物特異性寡 核苷酸配基，該特異性的寡核苷酸的一端帶有高親合性寡核苷酸配的生物素， 具體如下1 ) peptide from HIV國l Rev，生物素-5，- GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCC AGUGUGCIJGGAAUUCGGGUCGUUCUUG - 3: 2) NS3 protease protein,生物素-5, GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGU ACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG -3，； 3 ) TAR RNA element of HIV-1 ，生物素-5， - CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAU ACUCGUAGAUACUCGCCGGQ誦3，； 4) MS2 coat protein,生物素-5'GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCACTTCAGGACCAGCGGGTAC GTGGTCAA TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT扁3，。第二歩選擇酶標板為載體，並在酶標板上包被鏈黴親和素，然後用白 蛋白封閉液封閉酶標板。第三步將酶標板與上述末端帶有生物素的腫瘤標誌物特異性寡核苷酸 配基在37。C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，即製備成酶標板核酸 配基晶片。第四步製備檢測配體將檢測液與上述製備的配基晶片在37'C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，用洗脫緩衝溶液洗脫下配體，即製備出配體混合液。第五步檢測將上述採集製備的配體混合液用特異序列質譜(Sequence-specific MS/MS)分析鑑定，使配體得到定性和定量檢測。實施例二磁珠核酸配基晶片的製備和檢測腫瘤的方法
第一步製備生物素配基禾!J用SELEX技術篩選腫瘤標誌物特異性寡 核苷酸配基，該特異性的寡核苷酸的一端帶有高親合性寡核苷酸配的生物素， 具體如下1) peptide from HIV誦1 Rev， 生物素-5，-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCC AGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUG- 3;2) NS3 protease protein,生物素-5， _ GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGU ACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG -3，；3) TAR RNA element of fflV-l，生物素-5， - CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAU ACUCGUAGAUACUCGCCGGG -3，；4) MS2 coat protein, 生物素國5，GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCACTTCAGGACCAGCGGGTAC GTGGTCAA TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT-3，。第二步選擇磁珠為載體，在磁珠上包被鏈黴親和素，並用白蛋白封閉 液封閉磁珠。第三步將包被的磁珠與上述末端帶有生物素的腫瘤標誌物特異性寡核苷酸配基在37。C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，即製備成磁珠核 酸配基晶片。 一種磁珠可以連接一種配基，配基組晶片可以是由不同種配基 磁珠組組成。第四步製備檢測配體，將檢測液與上述製備的配基晶片在37'C下共同 孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，用洗脫緩衝溶液洗脫下配體，即製備出配 體混合液。第五步檢測，將上述採集製備的配體混合液用特異序列質譜(S叫uence-spedfic MS/MS)分析鑑定，使配體得到定性和定量檢測。實施例三玻片式核酸配基晶片的製備和檢測腫瘤的方法第一步製備生物素配基利用SELEX技術篩選腫瘤標誌物特異性寡 核苷酸配基，該特異性的寡核苷酸的一端帶有高親合性寡核苷酸配的生物素， 具體如下1) peptide from HIV-1 Rev，
生物素-5，-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCC AGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUG- 3; 2 ) NS3 protease protein,生物素-5， - GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGU ACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG -3，；3) TAR RNA element of fflV-l，生物素-5， - CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAU ACUCGUAGAUACUCGCCGGG -3，；4) MS2 coat protein,生物素-5 ，GGGAATGGATCCACATCTACGAATTC ACTTCAGGACCAGCGGGTAC GTGGTCAA TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT-3，。 第二步選擇玻片為載體，在玻片上包被鏈黴親和素，並用白蛋白封閉 液封閉玻片。第三步將玻片與上述末端帶有生物素的上述末端帶有生物素的腫瘤標誌物特異性寡核苷酸配基在37'C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，即製備成玻片核酸配基晶片。第四步製備檢測配體將檢測液與上述製備的配基晶片在37'C下共同孵冑'30分鐘，用洗滌液洗滌三次，用洗脫緩衝溶液洗脫下配體，即製備出配休混合液。第五步檢測將上述製備採集的配體混合液甩特異序列質譜(Sequence-specific MS/MS)分析鑑定，使配體得到定性和定量檢測。
權利要求
1、一種核酸配基組晶片，其特徵在於是將靶物質特異性寡核苷酸配基組集成固定在載體上製成配基組晶片；其中靶物質特異性的寡核苷酸配基組是由SELEX技術篩選獲得的靶物質特異性的寡核苷酸捕捉配基組；所述寡核苷酸捕捉配基的一端帶有可連接固化配基的活化基團，該活化基團通過包被在載體上的鏈黴親和素固定在載體上。
2、 如權利要求1所述核酸配基組晶片，其特徵在於所述靶物質特異 性的寡核苷酸捕捉配基為一段20-40個鹼基的寡核苷酸片段，其一端帶有生 物素，並通過鏈黴親和素固定在載體上；另一端形成捕捉配體的配基結構。
3、 如權利要求1所述核酸配基組晶片，其特徵在於所述特異寡核苷酸 捕捉配基為能與配體直接結合的單鏈DNA或RNA。
4、 如權利要求1所述核酸配基組晶片，其特徵在於所述載體為硝酸纖 維素濾膜、玻片或磁球。
5、 -種核酸配基組晶片的製備方法，是由以下工藝步驟完成① 利用SELEX技術篩選相關配體的特異性寡核苷酸配基；② 在載體上包被鏈黴親和素，用封閉液封閉；③ 將載體與末端帶有生物素的不同種類和數量的配基在37'C下共同孵 俘30分鐘，然後用洗滌液洗滌三次，3min/次，即製備成核酸配基組晶片。
6、 如權利要求1所述核酸配基組晶片的製備方法，其特徵在於步驟① 所述的封閉液為含5X牛血清白蛋白或奶粉PBS封閉液。
7、 如權利要求1所述核酸配基組晶片的製備方法，其特徵在於步驟③ 所述的洗滌液為含0.5% Tween-20的SHCMK (PH 7.35)結合液。
8、 如權利要求1所述核酸配基組晶片的製備方法，其特徵在於所述載 體為硝酸纖維素濾膜、玻片或磁球。
9、 -種利用核酸配基組晶片檢測配體的方法，是由以下工藝步驟完成① 製備檢測配體將檢測液與配基晶片在37'C下共同孵育30分鐘，用 洗滌液洗滌:三次，3min/次；然後用洗脫緩衝溶液洗脫下配體，即製備出配體 混合液。② 檢測將採集製備的配體混合液用特異序列質譜分析鑑定；或採用信 標配基PCR擴增進行檢測；或採用雷射解析蛋白圖譜進行分析。
10、如權利要求9所述利用核酸配基組晶片檢測配體的方法，其特徵在 於步驟①所述的洗滌液為SHCMK(PH7.35)+0.05%Tween20;所述洗脫緩 衝溶液為SHCMK (PH 7.35) +0. 5%Tween 20。
全文摘要
本發明提供了一種核酸配基組晶片及核酸配基組晶片的製備和檢測配體的方法。本發明的特異寡核苷酸配基組是通過SELEX技術針對配體篩選出的一段20-40個鹼基的寡核苷酸片段，其一端帶有生物素等可連接固化配基的活化基團，通過與鏈黴親和素固定在載體上，形成配基組的結構，可捕捉配體。在特異寡核苷酸配基組晶片上加入檢測樣品，經孵育，使配基捕捉被檢測配體，然後將捕捉的被檢測配體用洗脫液洗下來，即並行完成多種配體的集成採集；採集的配體用特異序列質譜(Sequence-specific MS/MS)分析鑑定，使配體得到定性和定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101130814SQ20071001865
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月30日 優先權日2007年8月30日
發明者廖世奇, 王雲普 申請人:西北師範大學;甘肅省醫學科學研究院;蘭州普利生物技術開發有限公司