一種用於防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌及其微生物菌劑的製作方法

2024-04-05 03:13:05

專利名稱：一種用於防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌及其微生物菌劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業微生物領域，具體涉及一種用於防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌和含有該萎縮芽孢桿菌的微生物菌劑，以及它們在防治棉鈴疫病上的應用。
背景技術：
棉鈴疫病是一種嚴重的棉花病害，由芒麻疫黴(Phytophthora boehmeriaesawada)引起，它不僅直接為害棉鈴，而且為其它病原菌提供了侵染條件。防治棉鈴疫病的方法主要是推株並壟、早摘爛鈴等栽培措施和化學藥劑防治。目前，我國種植棉花的經濟效益較低，而且人工費較高，農民不願投入太多精力來推株併攏；早摘爛鈴只能保住部分產量，不足以防控棉鈴疫病；化學藥劑雖然防治效果較好，但存在容易產生抗藥性，化學藥劑價格較貴，增加生產成本，以及環境汙染等問題。因此，亟需尋找一種省時省力、高效並且成 本低廉的防治方法。利用有益微生物對植物病害進行生物防治，因具有針對性強、防效高且環保等優點越來越受到重視。特別是在蔬菜氣傳病害和作物土傳病害上應用較多。有關棉鈴疫病的生物防治方面研究很少。馬平等(馬平等.生物防治通報.1993.9(3))發現木黴菌和腐黴菌對棉鈴疫病具有一定防治效果，並篩選到生防細菌MB-3和MB-7，其發酵液10倍稀釋液對棉鈴疫病田間防治效果分別為34. 9%和45. 4% (馬平等 中國生物防治 1998. 14(2))。芽孢桿菌(Bacillus)具有分布廣、易分離培養、能產生抗逆性較強的芽孢、貯藏期長和使用方便等優點，是一種理想的生防微生物，相比其他類型的生防因子，更有利於菌劑的生產，劑型加工，在環境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是防治有關植物病害的最有效方法之一。

發明內容
本發明目的在於提供一種用於防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌菌株，該菌株具有高效、廣譜殺菌活性等優點。本發明第二目的在於提供一種微生物菌劑。本發明第三目的在於提供上述微生物菌劑的製備方法。本發明第四目的在於提供上述萎縮芽孢桿菌菌株在防治棉鈴疫病上的用途。本發明第五目的在於提供上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的用途。本發明通過以下技術方案實現一種萎縮芽抱桿菌(Bacillus atrophaeus)菌株 HMB22922,己於 2011 年 12 月 20日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC No. 5614。一種微生物菌劑，其活性成分為萎縮芽孢桿菌HMB22922菌體和它的胞外代謝產物。上述微生物菌劑可以為液體製劑。
上述微生物菌劑的製備方法，包括如下步驟菌種活化，種子液製備和發酵培養。上述微生物菌劑的製備方法，具體包括如下步驟(I)菌種活化將低溫保存的HMB22922菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上30°C培養24 36小時，得活化的菌株；(2)種子液製備用無菌的接種環刮取一環步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養基中，在26 34°C、搖床轉速為170 210rpm條件下培養22 25小時，得種子液；(3)發酵培養按照體積比為0. 5% 3. 0%的比例將步驟⑵的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養基(PH值為5. 8 6. 2)中，在溫度為28 34°C、搖床轉速為170 210rpm 的條件下發酵培養36 54h，得發酵液；所述的蔗糖豆餅粉培養基，其組成成分及其重量百分比為:蔗糖 2. 0 3. 0%，豆餅粉 I. 6 2. 4%，NaCl 0. I 0. 2%，CaCO3 0. I 0. 3%，KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 7H20 0. 01 0. 03%，其餘為水；(4)檢測發酵液中菌體和芽孢數量，待發酵液中成熟芽孢佔到芽孢和菌體總數的90%時停止發酵培養；所得即為HMB22922菌株的液體製劑。上述製備方法步驟(2)和(3)中所述的溫度優選為30 32°C ;所述的搖床轉速優選為210rpm ;所述的培養時間優選為48h。所述的LB平板培養基、LB斜面培養基和LB液體培養基等按照常規方法製備。所述的蔗糖豆餅培養基的製備方法，按照重量百分比將蔗糖、豆餅粉、NaCl、CaCO3> KH2PO4和MgSO4 7H20混合，再加水，攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其萎縮芽孢桿菌HMB22922的活菌數大於8. 37 X 108cfu/mL。所述的萎縮芽孢桿菌HMB22922在防治棉鈴疫病上的應用。上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的應用。本發明微生物菌劑的使用方法將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌數為107cfu/mL，於棉鈴疫病發病前進行棉鈴表面、中下部葉片噴霧，即可達到控制棉鈴疫病的目的。HMB22922菌株的篩選分離過程HMB22922菌株是河北省農林科學院植物保護研究所從河北省辛集市玉米田土壤中分離得到的。2010年河北省農林科學院植物保護研究所從河北省辛集市玉米田中五點採集根際土壤，混勻後稱取5g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水,放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液ImL加無菌水9mL，即成lOmLlO—2倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀釋液，各濃度取200 u L微生物懸液塗於LB和KB培養基平板上，每個濃度3次重複，在28°C恆溫培養ld_3d，進行細菌的分離和純化。並以棉鈴疫病為靶標，利用平板對峙和離體青鈴人工接種進行生防菌的篩選。結果從中篩選出一個對靶標病害具有明顯防治效果的細菌菌株，定名為HMB22922。HMB22922菌株的分類鑑定(I)形態特徵鑑定在LB培養基上培養菌體為杆狀，培養IOh後產生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴孢晶體，能運動，鞭毛周生。在營養瓊脂平板上，培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面溼潤；培養後期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面乾燥有褶皺；在營養瓊脂斜面上劃線培養，呈直線形；在液體培養基中靜止培養，表面形成白色菌膜。與《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠等編著，科學出版社，2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態特徵基本一致，初步判斷菌株HMB22922屬於芽孢桿菌(Bacillus)o(2)利用16S rDNA序列鑑定分類以HMB22922的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對16S rDNA進行PCR擴增，所述的引物序列為F27 5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2),R1492 :5』 GGCTACCTTGTTACGACTT3』 ； (SEQ ID No 3)；16S rDNA 的擴增反應體系為 50 y L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 u L ；dNTPMixture(2. 5mM) 5 u L ；Taq(5U/u L) I u L, F27(10 u mol/L) I u L, R1492(10 u mol/ L)luL ；HMB22922 的基因組 DNA 50ng ；ddH20 補足至 50 y L。PCR 的反應條件為 95 °C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C I. 5min，30個循環-,1 TC IOmin0將所得PCR擴增產物進行凝膠電泳，送交上海生工生物工程有限公司測序，得到HMB22922的16S rDNA序列(見SEQ ID No I)。將所得HMB22922的16S rDNA序列在Genbank中進行同源性比較，結果菌株HMB22922與芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性達到99% (見圖3);構建系統發育樹(見圖2)，HMB22922與萎縮芽孢桿菌聚合到一起，說明HMB22922是萎縮芽孢桿菌(B. atrophaeus)。(3)利用生理生化特徵鑑定分類利用Biolog微生物自動鑑定系統可以測試菌株HMB22922對95種碳源的利用情況從而進一步確定其種屬特徵，提高菌株鑑定的可靠性。先將待測菌株的純培養菌落接入無菌水中，振蕩器震蕩製成細胞懸液，然後用多道移液槍接種於96孔GNIII鑑定板上培養，再用Biolog Microstation軟體讀取數據,確定碳源利用情況。通過與BIOLOG系統資料庫MicroLog software (Release Version 4.20.04)比對，可知待測菌株的分類。將 HMB22922菌株送交中國農業大學，利用Biolog微生物自動鑑定系統進行鑑定分類，鑑定結果表明HMB22922屬於萎縮芽抱桿菌(B. atrophaeus)。綜合以上形態特徵、16S rDNA序列同源性對比分析，以及生理生化特徵鑑定的結果，可知HMB22922屬於萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus),並且和現有的芽孢桿菌菌株不同，是一個新的萎縮芽孢桿菌菌株。本發明具有的優點和有益效果(I)本發明為防治棉鈴疫病提供了一種有效的生物防治途徑；(2)本發明對棉鈴疫病的防治效果好，平均防效在80%以上，且針對性強；(3)本發明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環境汙染；(4)利用本發明防治棉鈴疫病不易產生抗藥性；(5)本發明微生物菌劑製備方法簡單、成本低、使用方便。


圖I.為萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的拮抗作用圖，其中A為萎縮芽孢桿菌HMB22922，B為棉鈴疫病菌。圖2.為HMB22922菌株根據16S rDNA序列獲得的系統發育樹圖。圖3.為本發明HMB22922菌株與萎縮芽孢桿菌1942菌株(B. atrophaeus 1942)的16S rDNA基因序列同源性比較圖譜；其中萎縮芽孢桿菌1942菌株序列中表示與HMB22922相應的鹼基相同，「g、a、C、t」表示萎縮芽孢桿菌1942菌株序列中與HMB22922相應位點的鹼基為g、a、c、t 」表示對應位點的鹼基缺失。
具體實施例方式實施例IHMB22922微生物菌劑的製備，按照如下步驟進行(I)菌種活化將保存於-40 °C的菌株HMB22922 (萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)菌株HMB22922已於2011年12月20日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5614)在LB平板培養基(其組成成分及其重量比為胰蛋白腖Ig酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上進行活化(30°C )，挑取單菌落在LB斜面培養基(其組成成分及其重量比為胰蛋白腖lg，酵母提取物0. 5g，、氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上，在30°C下培養24 36小時；得活化的菌株；(2)種子液的製備按常規方法製作LB液體培養基(其組成成分及其重量比為胰蛋白腖lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，水IOOOmL)，在250mL三角瓶中裝入LB液體培養基IOOmL,高壓溼熱滅菌，待溫度降到室溫後，每瓶中接入步驟⑴中一接種環活化好的菌株，在搖床上進行振蕩培養，轉速190rpm、3(TC下培養24h，所得為種子液；(3)蔗糖豆餅培養基的製備按照重量百分比將蔗糖3.0%，豆餅粉2%，NaClO. I %, CaCO3 0. 3%, KH2PO4 0. 02% 和 MgSO4 7H20 0. 03% 加入水中，攪拌混合均勻，即得蔗糖豆餅培養基；分裝於500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C對蔗糖豆餅培養基進行滅菌30分鐘，再降溫到30°C備用；(4)發酵培養向步驟(3)所得每瓶蔗糖豆餅培養基200mL中接種步驟⑵所得種子液2mL ;在30°C、搖床轉速190rpm條件下進行發酵培養36h，以後每隔30分鐘從三角瓶中取樣進行鏡檢，對視野中的芽孢和總菌體數進行計數，並計算芽孢率(芽孢率(％)=成熟芽孢數/(成熟芽孢數+菌體數)X 100);芽孢率達到90%即可停止發酵培養；共發酵培養約45 50h，即得萎縮芽孢桿菌HMB22922液體製劑。實施例2萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的拮抗作用試驗(一 )、試驗時間和地點2010年8月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。( 二)試驗方法(I)供試棉鈴疫病菌來源棉鈴疫病菌5-1採自河北省滄州市獻縣河街鎮河街村棉株病鈴，經河北省農林科學院植物保護研究所分離純化，河北農業大學植物保護學院植物病理系鑑定為芒麻疫黴(Phytophthora boehmeriae),致病力測定表現為強致病力。(2)平板對峙實驗首先將棉鈴疫病菌5-1在PDA平板上活化，培養5天後在菌落邊緣區域，用打孔器(0=6mm)打孔製成菌片，將棉鈴疫病菌菌片轉接在另一個PDA平板中央，再將活化後的萎縮芽孢桿菌HMB22922點接在距指示菌菌片2. 0釐米處，設空白對照(不點接HMB22922菌株的棉鈴疫病菌生長情況)。25°C恆溫培養，待空白對照即將長滿整個培養皿時，測量棉鈴疫病菌的對照生長量(菌落半徑)和處理生長量(接種HMB22922後的抑制生長半徑)，用拮抗作用抑菌率(抑菌率)=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量X 100)表/Jn o(三)結果(表I)萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的抑制率達85.71 % ;透明的抑菌帶寬10. 0毫米(見圖I)。說明萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病具有明顯的抑制作用，具有防治棉鈴疫病的生防潛力。表I萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的拮抗試驗結果
權利要求
1.一種萎縮芽抱桿菌(Bacillus atrophaeus)菌株 HMB22922,已於 2011 年 12 月 20日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5614。
2.一種微生物菌劑，其特徵在於其活性成分為萎縮芽孢桿菌HMB22922菌體和它的胞外代謝產物。
3.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特徵在於HMB22922的活菌數大於8.37X 108cfu/mL。
4.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特徵在於為液體製劑。
5.權利要求2所述的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)將低溫保存的HMB22922菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上30°C培養24 36小時，得活化的菌株； (2)用無菌的接種環刮取一環步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養基中，在26 34°C、搖床轉速為170 210rpm條件下培養22 25小時，得種子液； (3)按照體積比為0.5% 3.0%的比例將步驟(2)的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養基中，在溫度為28 34°C、搖床轉速為170 210rpm的條件下發酵培養36 54h，得發酵液；所述的蔗糖豆餅粉培養基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖2. 0 3. 0%，豆餅粉I.6 2. 4%,NaCl 0. I 0. 2%,CaCO3 0. I 0. 3%,KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 *7H200.01 0. 03%，其餘為水； (4)檢測發酵液中菌體和芽孢數量,待發酵液中成熟芽孢佔到芽孢和菌體總數的90%時停止發酵培養。
6.按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其步驟(3)中所述的溫度為30 32。。。
7.按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其步驟(3)中所述的搖床轉速為210rpmo
8.按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其步驟(3)中所述的培養時間為48h。
9.權利要求I所述的萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)菌株HMB22922在防治棉鈴疫病上的應用。
10.權利要求2所述的微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)菌株HMB22922，於2011年12月20日保藏於中國微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.5614。本發明還公開了利用該菌株生產的微生物菌劑及其製備方法，菌劑的活性成分為HMB22922菌體和它的胞外代謝產物。本發明HMB22922菌株對棉鈴疫病有特異的防治作用，而且防效高，平均防效在80％以上；其次，本發明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環境汙染問題；以及利用本發明防治棉鈴疫病不易產生抗藥性；此外，本發明微生物菌劑製備方法簡單、成本低、使用方便。
文檔編號A01N63/00GK102747005SQ20121002808
公開日2012年10月24日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者李寶慶, 李社增, 郭慶港, 馬平, 鹿秀雲 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所