鹼性蛋白酶、其製造方法、使用方法和產生此蛋白酶的微生物的製作方法

2023-08-06 23:00:26

專利名稱：鹼性蛋白酶、其製造方法、使用方法和產生此蛋白酶的微生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的鹼性蛋白酶。更具體地說，本發明涉及一種在表面活性劑中穩定和抗熱的鹼性蛋白酶、它的生產方法、其在去汙劑中的使用和產生鹼性蛋白酶的微生物。
背景技術：
近幾年，環境汙染已成為一個社會問題。為了調節磷酸鹽作為去汙劑成分的使用，將酶與去汙劑混合以提高去垢性。目前市場上已經有含有酶(例如蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶和脂肪酶)的去汙劑。特別是，蛋白酶能夠降解衣服上的有機汙點，10-40％的有機汙點是由蛋白質造成的，並且這種汙點不能由常規去汙劑洗掉。蛋白酶已經成為一種改進去垢性的必要成分。
作為去汙劑中使用的蛋白酶，有很多來源於在鹼性pH範圍內具有活性的微生物，並且已經使用了蛋白酶，如Kazusase(Showa Denko K.K.)、Savinase(Novo)，Maxacal(Gist)、Alcalase(Novo)和Biosam(ShowaDenko K.K.)。隨著自動洗碗機的廣泛應用，現在需求能夠用於自動洗碗機的酶。蛋白酶對盤子上的蛋黃、奶製品等蛋白質汙點有效。然而，一般來說高溫時在水溶液中酶的失活加快。因此，需要在穩定性方面具有優勢的酶。儘管目前Esperase(Novo)等已用於此目的，但是這些酶沒有令人完全滿意的活性和穩定性。目前知道的在表面活性劑中最穩定的蛋白酶是通過芽孢桿菌屬菌株SD 521(1991年的專利申請號191781)產生的。然而，需要一種更穩定的蛋白酶。
因此，本發明的目的是提供一種在表面活性劑中更穩定的鹼性蛋白酶、生產這種鹼性蛋白酶的方法、這種蛋白酶在去汙劑組合物中的應用和產生這種蛋白酶的微生物。
發明描述我們努力研究的結果是發現了由芽孢桿菌屬未知種SD 114(一種芽孢桿菌屬的菌株)產生的蛋白酶API-26具有極好的穩定性，並且適合於在去汙劑中使用，並且完成了本發明。
因此，本發明提供了下列新的鹼性蛋白酶、它的生產方法、用途和產生這種蛋白酶的微生物。
1)滿足下列(a)-(c)所規定的至少一個條件的鹼性蛋白酶(a)40℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分鐘後剩餘活性超過60％(b)55℃下在緩衝劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分鐘後剩餘活性超過40％(c)55℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分鐘後剩餘活性超過20％2)在以上第1)項中規定的具有下列特性的鹼性蛋白酶(1)作用此蛋白酶能水解蛋白質和肽。
(2)最適pH當此蛋白酶在30℃下，以酪蛋白為底物反應10分鐘時的最佳pH大約為12。
(3)穩定pH範圍30℃下將此蛋白酶溫育24小時時，其在5-11的pH範圍內穩定。
(4)最佳溫度當此蛋白酶在pH10時，以酪蛋白為底物反應10分鐘時的最佳溫度大約為60℃。
(5)分子量通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的分子量為29,000±2,000。
(6)等電點通過等電聚焦聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的等電點為10.1±0.5。
3)在以上第1)項或第2)項中規定的由屬於芽孢桿菌屬的微生物產生的鹼性蛋白酶。
4)在以上第3)項中規定的由屬於芽孢桿菌屬的微生物產生的鹼性蛋白酶，其中所說的微生物是芽孢桿菌屬未知種SD114(保藏號FERM BP-5736)。
5)與以上第4)項中規定的蛋白酶具有免疫交叉反應性的鹼性蛋白酶，並且能夠滿足下列(a)-(c)所規定的至少一個條件(a)40℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分鐘後剩餘活性超過60％。
(b)55℃下在緩衝液溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分鐘後剩餘活性超過40％。
(c)55℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分鐘後剩餘活性超過20％。
6)一種生產鹼性蛋白酶的方法，其特徵在於從產生以上第1)-5)項所規定的蛋白酶的屬於芽孢桿菌屬的微生物或其變種的培養物中獲得所說的蛋白酶。
7)一種生產以上第6)項所規定的鹼性蛋白酶的方法，所說的蛋白酶由屬於芽孢桿菌屬的微生物產生，這種微生物是芽孢桿菌屬未知種SD114(FERM BP-5736)。
8)芽孢桿菌屬未知種SD 114(FERM BP-5736)和它的突變體。
9)所說的去汙劑的成分，其中包括以上第1)-5)項所規定的蛋白酶。
10)包含以上第1)-5)項所規定的蛋白酶的去汙劑。
11)用於自動洗碗機的去汙劑，其中包含以上第1)-5)項所規定的蛋白酶。
12)生產肽或胺基酸的方法，其特徵在於使以上第1)-5)項之任一所規定的蛋白酶與蛋白質或者肽反應。
附圖的簡更描述[

圖1]為描述本發明酶的最適pH範圍的圖。
為描述本發明酶的穩定pH範圍的圖。
為描述本發明酶的最佳溫度範圍的圖。
為描述本發明酶和已知酶在55℃下的穩定性的圖。
為描述本發明酶和市售去汙劑(Ultra Ariel)中的已知酶在55℃下的穩定性的圖。
為描述本發明酶和市售去汙劑(Super Cheer)中的已知酶在55℃下的穩定性的圖。
為描述本發明酶和市售去汙劑(Tide Grease Releasing)中的已知酶在40℃下的穩定性的圖。
發明的詳細公開產生酶的微生物產生本發明酶的微生物之一的芽孢桿菌屬未知種菌株SD 114是一種與強固芽孢桿菌(Bacillus firmus)在菌學上密切相關的菌株。然而，這種菌株在一些特性方面明顯地不同於其它的已知菌株，其被認為是一個新的菌株。細菌學特性與本發明相關的芽孢桿菌屬未知種菌株SD 114具有下列的細菌學特性(a)形式芽孢桿菌(b)革蘭氏染色陽性(c)孢子的產生陽性(d)孢子的形狀橢圓(e)移動性陽性(f)對氧的反應需氧菌(g)過氧化氫酶的產生陽性(h)在厭氧條件下的生長陰性(i)伏-普二氏反應(VP)反應陰性(i)VP肉湯培養物的pH6.2(k)酸的產生葡萄糖陰性阿拉伯糖陰性木糖陰性甘露糖醇陰性(i)由葡萄糖產氣陰性(m)明膠的液化作用陽性(n)澱粉的降解陽性(o)檸檬酸鹽的利用陰性(p)丙酸鹽的利用陰性
(q)苯丙氨酸脫氨基作用陰性(r)蛋黃反應陰性(s)硝酸鹽的還原陰性(t)在pH6.8下的生長陽性(u)在pH5.7下的生長陽性(v)在5％氯化鈉中的生長陽性(w)在7％氯化鈉中的生長陽性(x)在10℃下的生長陽性(y)在30℃下的生長陽性(z)在55℃下的生長陽性(aa)微生物DNA的GC含量(摩爾％)45％參考Bergey的系統細菌學手冊(Vol.2，William和Wilkins，1986)，將所說的具有上述細菌學特徵的細菌的系統特徵與其它的菌株比較如下本發明涉及到的芽孢桿菌屬未知種菌株SD 114在由糖產生酸和50℃生長方面沒有表現出與強固芽孢桿菌相同的特徵。然而，已知菌株SD 521由葡萄糖產生酸、使硝酸鹽脫氧，不能在pH6.8時生長，也不能在50℃生長。NCIB 10309由葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖醇產生酸。PB 92由葡萄糖和木糖產生酸，並且能夠利用丙酸鹽。從以上細菌學特徵可以明顯地看出菌株SD 114是一種嗜溫細菌，是與強固芽孢桿菌密切相關的芽孢桿菌屬未知種，但是這種菌株與其它的已知菌株不同。因此這種菌株被認為是一種新的菌株。此菌株在1995年10月2日以FERM P-15214保藏在生物科學和人類技術國家研究院(工業科學和技術機構(地址1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本))，並在1996年10月30日按照布達佩斯條約以菌株SD 114(FERM BP-5736)轉變成國際保藏物。
此外，屬於所說的菌株SD 114的蛋白酶生產力改進的突變體(通過自發或者誘導突變而得到)可以作為產生本發明蛋白酶的細菌。為了製備這些突變體，可以使用常規的方法，例如由紫外輻射或者誘變劑(如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG))對原始菌株誘導人工突變後，將培養物接種到含有脫脂乳等的瓊脂培養基中。從在菌落周圍形成較大清晰環帶的菌落中選擇具有極好生產力的突變體。而且可以通過在合適的宿主細胞中利用基因擴增現象改進生產力，用與合適的自我複製DNA偶聯的本發明蛋白酶的基因轉化所說的宿主細胞。產生蛋白酶的方法任何能夠使產生本發明蛋白酶的微生物生長並產生所說的蛋白酶的培養基都可以用於生產本發明的蛋白酶。
例如，可以使用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性澱粉等作為碳源，使用有機的氮化合物(如大豆餅，糠餅和玉米浸液)作為氮源。此外還要加入礦物質，如磷酸鹽、鉀鹽和鎂鹽。在本發明中，將培養物在需氧的條件下培養，例如可以使用通氣培養或搖動培養。儘管在20-40℃的溫度下此菌株是穩定的，但要求使用的培養溫度是30-37℃。理想的初始pH為9-10，在培養期間的pH是8.5-10。培養時間為16-60小時，當獲得最大的蛋白酶活性時結束培養是理想的。可以按照常規的分離和純化方法對通過以上過程獲得的培養物進行純化。通過鹽析沉澱蛋白質、溶劑分級分離方法、噴霧乾燥方法、凍幹法等等，將可溶性鹽或者親水的有機溶劑加入到所得的上清液或濾液(所說的上清液和濾液是通過離心或者過濾除去體細胞或培養基的固體剩餘物而得到的)中，獲得了本發明的蛋白酶。而且可以結合使用其它的純化方法(如離子交換層析和凝膠過濾層析)來進一步純化所說的蛋白酶。我們把通過上述方式所獲得的本發明的蛋白酶命名為API-26。通過下列方法測定API-26的活性。酶活性的測定將50μl適當稀釋的酶溶液加入到500μl 50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)中，並且在30℃下預溫育3-5分鐘。將500μl 的2％漢馬斯坦氏酪蛋白溶液(pH10)加入到此溶液中，10分鐘後，加入2ml的三氯乙酸(TCA)溶液(用乙酸鹽緩衝液調節至pH4的0.032M TCA溶液)使反應終止。在30℃下放置10分鐘以上，然後用2號濾紙(Toyo Roshi)過濾。將5ml的0.4M碳酸鈉和1ml用水稀釋6倍的酚試劑加入到1ml濾液中。在30℃下著色20分鐘，然後測定在660nm下的吸光度。katal是描述蛋白酶活性的單位。1 katal定義為pH10和30℃下以酪蛋白為底物產生的降解產物在660nm下與1摩爾酪氨酸的吸光度相同的蛋白酶活性。蛋白酶的特性本發明所獲得的蛋白酶的物理和化學特性如下(1)作用和底物特異性此蛋白酶降解蛋白質或肽(如酪蛋白、血紅蛋白、白蛋白、肉蛋白質、魚蛋白質和大豆蛋白質)。
(2)最適pHpH值的確定以Britton-Robinson寬範圍緩衝液作為緩衝溶液。為了確定最適pH值，將大約20nkatal/ml的酶加入到每一種含有1％酪蛋白的pH緩衝液中。在30℃下溫育10分鐘後測定酶活性。酶活性如表1和圖1所示，其中在pH11.7下的活性被認為是100。從這些結果看出此酶的最適pH值大約為12。
(3)穩定pH範圍穩定pH範圍的確定將此酶以大約20nkatal/ml的濃度加入到每一種pH緩衝溶液中。在30℃下溫育10分鐘後測定酶活性。表2和圖2描述了剩餘活性，其中在溫育前的活性被認為是100。從這些結果中可以看出在30℃下此酶的穩定pH值範圍大約為5-11。
表1<

>(4)最適溫度最適溫度的確定在每個溫度下將25mM含有2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)進行預溫育後，加入所說的酶並在每個溫度下反應10分鐘。30℃下將此溶液溫育24小時後測定酶活性。表2和圖2描述了相對活性，其中在60℃下的活性被認為是100。從這些結果中可以看出此酶的最適溫度大約為60℃。
表3<

>(5)抑制物的影響按照下列條件和方法研究了各種抑制物對所說的酶的影響製備含有大約20nkatal/ml酶的50mM硼酸鹽緩衝液(pH10)溶液。將EDTA、對汞苯甲酸(PCMV)或甲苯磺醯氟(PMSF)以表4所示的濃度加入到此溶液中。30℃下溫育30分鐘後測定酶活性。結果如表4所示，其中沒有抑制物時酶的相對活性被認為是100。如表4所示，PMSF十分強烈地抑制此酶，因此所說的酶是絲氨酸蛋白酶。
表4<

6)分子量通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的此酶的分子量為29,000±2,000。
(7)等電點通過等電聚焦聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的等電點為10.1±0.5。
(8)穩定性所說的酶能夠滿足至少下列條件之一(a)40℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm線型烷基苯磺酸鈉(LAS))中放置30分鐘後剩餘活性超過60％。
(b)55℃下在緩衝溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分鐘後剩餘活性超過40％。
(c)55℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分鐘後剩餘活性超過20％。與抗API-26體的交叉反應性在下列的測定條件下本發明的蛋白酶優選地表現出與抗API-26體的交叉反應。
交叉反應的測定條件製備2mg/ml的API-26抗原，並將其和等量的弗氏完全佐劑混合以形成完全的油包水乳劑。將1ml的這種乳劑在0天、21天、42天和63天施用到2隻雌兔上。在70天時採用驅血法收集所有的血液，並且製備含有抗體的血清樣品。
使用Ouchterlony技術(Acta.Med.Scan.13376-79，1950)評估交叉反應，即用10μl的API-26或其它蛋白酶以1mg/ml的濃度填充中央孔，並且用10μl抗血清(以2n(n＝1、2、3、4、5、6、7)比例稀釋)填充周圍孔。將平板放置在溼度培養室中，並在37℃下溫育過夜，直到能夠看到沉澱素線。如果沉澱素線是以形成API-26的沉澱素線的最小濃度的4倍或更高濃度形成時，就可以得出所說的酶和抗API-26體具有交叉反應性。蛋白酶的應用通過使用本發明的蛋白酶處理蛋白質或者肽可以產生肽或者胺基酸。通過使用蛋白酶處理包含蛋白質或者肽的目標物質可以用此蛋白酶加工目標物質。在常規的使用方法中，本發明的蛋白酶可以與常規的蛋白酶合用。甚至在常規酶失活的苛刻條件下，本發明的蛋白酶還可以使用直到此蛋白酶被激活。例如，不僅可以在50ppm-500ppm LAS存在時使用所說的蛋白酶，而且在超過500ppm的LAS存在下也可以使用。然而，在小於3,000ppm下使用此蛋白酶是優選的，在小於300ppm使用此蛋白酶是更優選的。可以在超過48℃的高溫下使用所說的蛋白酶。然而在小於75℃下使用此蛋白酶是優選的，在小於70℃下使用此蛋白酶是更優選的。用途在各種市售的去汙劑溶液或者表面活性劑中，本發明的鹼性蛋白酶比常規鹼性蛋白酶更穩定。由於此酶也具有熱穩定性，所以在用溫水洗滌衣服或盤子時，其能有效地降解蛋白質汙點，所以通過在去汙劑中加入這種蛋白酶能夠增加去垢性。
此外，這種蛋白酶可以用於飼料加工、食品加工(魚油加工、肉加工等)、纖維加工、羊毛加工、皮革加工、接觸透鏡的洗滌、管道的洗滌。此外，這種蛋白酶可以與浴液和脫毛劑混合使用。去汙劑組合物本發明提供了與具有上述指定特性的鹼性蛋白酶混合的去汙劑組合物。雖然沒有限定與本發明的去汙劑組合物混合的鹼性蛋白酶的數量，但是將相當於10-1,000nkatal/l的去汙劑溶液量的酶混合是合適的。如果加入的量太小，就不能令人滿意地提高去垢性。相反，如果加入的量太多，也不能象所期望的那樣提高去垢性，而且從經濟方面考慮也是不可取的。
本發明的鹼性蛋白酶可以與已知的去汙劑組合物混合而在組成上無任何改變。本發明的去汙劑組合物不需要特殊的成分。這種去汙劑組合物典型的例子是具有一種或多種由下列物質構成的組成的去汙劑組合物10-50％(重量比)的表面活性劑、0-50％(重量比)的助劑、1-50％(重量比)的鹼性試劑或者礦物質、0.1-5％(重量比)的抗沉澱劑、酶、漂白劑、螢光染色劑、抗結塊劑和抗氧化劑(依去汙劑組合物的重量而定)。
可以使用去垢劑組合物中通常含有的下列表面活性劑肥皂；線型或者分支烷基或者鏈烯基硫酸酯；氨基硫酸酯；脂肪族硫酸化合物，如具有線性或分支烷基或者鏈烯基基團(其中加入了一個或多個環氧乙烷、環氧丙烷和環氧丁烷)的烷基或鏈烯基醚硫酸酯、烷基磺酸酯、氨基磺酸酯、二烷基磺基琥珀酸酯、脂肪族磺酸酯(如α-烯烴、亞乙烯基烯烴和內烯烴的磺酸酯)；芳香族磺酸酯，如線型或者分支的烷基苯磺酸酯、帶有線型或者分支烷基或鏈烯基基團(其中加入了一個或多個環氧乙烷、環氧丙烷和環氧丁烷)的烷基或鏈烯基醚羧酸酯；α-磺基脂肪酸或者酯；胺基酸型的表面活性劑；烷基或者鏈烯基酸性磷酸酯；磷酸酯表面活性劑(如烷基或者鏈烯基磷酸酯)；磺酸型的兩性表面活性劑；甜菜鹼型兩性表面活性劑；帶有線型或分支烷基基團(其中加入了一個或多個環氧乙烷、環氧丙烷和環氧丁烷)的烷基或者烯基醚或者醇；帶有線型或分支烷基基團(其中加入了一個或多個環氧乙烷、環氧丙烷和環氧丁烷)的聚氧化乙烯烷基苯醚；高級脂肪酸鏈烷醇醯胺或者它們的烯化氧加成化合物；蔗糖脂肪酸酯；甘油脂肪酸一酯；烷基或者鏈烯基胺氧化物；四烷基銨鹽型陽離子表面活性劑；等等。陰離子表面活性劑的抗衡離子優選的是鈉離子或者是鉀離子。所說的去汙劑可以含有一種或多種這些表面活性劑的混合物。
下列的無機化合物可以用作助洗劑和鹼化劑或者無機電解質。可以作為鹼性金屬鹽的有磷酸鹽(如正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽、偏磷酸鹽、六偏磷酸鹽、植酸鹽等等)；膦酸鹽(如乙烷-1，1-二膦酸、乙烷-1，1，2-三膦酸、乙烷-1-羥基-1，1-二膦酸和它們的衍生物、乙烷羥基-1，1，2-三膦酸、乙烷-1，2-二羧基-1，2-二膦酸、甲烷羥基膦酸等等)；膦醯基羧酸鹽(如2-膦醯基丁烷-1，2-二羧酸、1-膦醯基丁烷-2，3，4-三二羧酸、α-甲膦醯基琥珀酸等等)；胺基酸鹽(如天冬氨酸、穀氨酸等等)；氨基多乙酸鹽(如次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸鹽、二亞乙基三胺五乙酸鹽等等)；高分子電解質(如聚丙烯酸、聚亞甲基丁二酸鹽、聚順丁烯二酸、無水順丁烯二酸的共聚物、羧甲基纖維素鹽等等)；未離解的聚合物(如聚乙二醇、聚乙烯醇等等)；羧甲基化合物(如二乙醇酸、羥二乙醇酸、羧甲基羥丁二酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、蔗糖、乳糖等等)；有機酸鹽(如季戊四醇的羧甲基化合物、葡糖酸的羧甲基化合物、苯多羧酸、草酸、蘋果酸、羥二丁二酸、葡糖酸等等)；矽鋁酸鹽(如沸石等等)；作為鹼性金屬鹽的無機鹽(如碳酸鹽、倍半碳酸鹽、硫酸鹽、二矽酸鹽等等)；作為有機化合物的澱粉，尿素等等；作為無機化合物的氯化鈉，皂土等等；和作為有機鹼化劑的三乙醇胺，二乙醇胺，一乙醇胺，三異丙醇胺等等。
如上所述，本發明的去汙劑組合物含有一種或多種表面活性劑、本發明的鹼性蛋白酶和鹼化劑或者無機電解質作為主要成分。此外，如果需要，其可以含有兩性表面活性劑、漂白劑(如過碳酸鈉、過硼酸鈉等)、漂白激活劑、染色劑、助洗劑、抗再沉澱劑(如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素等)、抗結塊劑、抗氧化劑、防腐劑、螢光增亮劑、起泡沫劑和其它的酶(如脂酶等)。
可以使用任何方法將所說的酶和本發明的去汙劑組合物混合。然而，出於對去汙劑用戶或去汙劑工廠中的工人的安全和健康危害考慮(在去汙劑的處理期間產生灰塵)，最好不將酶的細粉末混合。因此，優選地將酶配製成液體或者無塵形式。可以通過任何常規的方法(如滾動成粒狀、擠壓成粒狀、經流化床成為粒狀和經離心流化床成為粒狀)將酶成型。用於與本發明的去汙劑組合物混合的酶的形狀並不限於按照上述方法產生的形狀。由於本發明的鹼性蛋白酶很穩定，可以在比常規製備方法更高的溫度下(例如大於50℃)進行酶的配製。
本發明的去汙劑組合物的具體形式包括含有本發明鹼性蛋白酶的洗滌衣物的去汙劑和用於自動洗碗機的去汙劑等。實現本發明的最好條件下面是具體說明本發明的例子，但是本發明不只限於下列例子。
使用了在這些實施例中指定的市售去汙劑。在使用它們之前，通過分選等方法提取包含在所說的去汙劑中的酶顆粒來製備不含酶的去汙劑。
實施例1芽孢桿菌屬未知種菌株SD 114的培養35℃下將菌株SD 114在300毫升含有1％酪蛋白、1％肉湯和1％多腖的培養基中震蕩培養66小時，用碳酸鈉將培養基的pH調節到7.5，然後在培養物中產生並分泌所說的酶。4℃下以1000 G離心此培養物以便獲得上清液。上清液中的酶活性大約為50nkatal/ml。
實施例2酶API-26的純化將在實施例1中獲得的培養物的上清液用除去細菌的膜過濾，然後用超濾膜濃縮。用30-60％飽和的硫酸銨將此濃縮的溶液鹽析。將獲得的沉澱溶解在25mM tris-HCl緩衝液(pH7.5，包含1mM CaCl2)中，並用此緩衝液進行透析。然後在pH7.5下將此溶液加入到CM-cellulofine C-500柱(Seikagaku公司)中，使用0-1M含有1mM CaCl2的KCl通過濃度梯度方法洗脫所說的酶。與離子交換層析之前相比酶組分的比活顯示出大約8倍的增加。對此組分進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析表明此酶為一條單一的帶。
實施例3溫度穩定性將本發明的酶API-26、枯草桿菌蛋白酶10309(由菌株NCIB 10309產生的酶)、PB 92(由芽孢桿菌屬菌株PB 92產生的酶)和SD 521(由芽孢桿菌屬菌株SD 521產生的酶)加入到50mM Atkin-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10，包含0.1mM EDTA)中，得到活性大約為20 nkatal/ml的溶液。在55℃下溫育此溶液，定期收集樣品，並在30℃下測定剩餘活性。表5為每一時間點的剩餘活性，其中在沒有熱處理的條件下測定的活性為100。分別根據1976年的8401號專利出版物、1976年的125407號臨時出版物和1991年的191781號臨時出版物所規定的方法製備枯草桿菌蛋白酶10309、PB 92和SD 521。如表5和圖4所示，API-26具有極好的溫度穩定性。
表5.溫度穩定性(55℃)<

實施例4表面活性劑穩定性我們研究了此酶對表面活性劑的穩定性。測定方法將LAS溶解在50mM Atkin-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10，包含0.1mMEDTA)中，得到500ppm的LAS溶液。將酶(API-26、枯草桿菌蛋白酶10309、PB 92和SD 521)加入到此溶液中，得到酶活性大約為20nkatal/ml的溶液，在40℃和55℃下溫育此溶液。在30℃下定期檢測剩餘活性。表6(40℃)和表7(55℃)為在每個時間點的剩餘活性，其中開始時酶活性為100。如這兩個表所示，與常規酶相比，API-26在表面活性劑中具有極好的穩定性。
表6.在表面活性劑中的穩定性(40℃)<


實施例5酶API-26在去汙劑溶液中的穩定性我們按照下列的條件和方法研究了本發明的酶在市售的去汙劑UltraAriel(PG)、Super Cheer(PG)和Tide Grease Releasing(PG)溶液中的穩定性。向50mM Atkin-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10，包含1,000ppm的Ca2+和1,000ppm的去汙劑溶液)中加入酶API-26和其它的酶、枯草桿菌蛋白酶10309、PB 92和SD 521，得到酶活性為大約20nkatal/ml的溶液，然後在55℃或40℃下溫育此溶液。30℃下定期檢測剩餘活性。表8-10和圖5-7為每個時間點的剩餘活性，其中開始時活性為100。如這些表和圖所示，與其它酶相比，API-26在去汙劑中具有十分顯著的穩定性。
表8.Ultra Ariel(55℃)

表9.Super Cheer(55℃)

表10.Tide Grease Releasing(40℃)

實施例6包含酶API-26的去汙劑的去垢性試驗用除去細菌的膜處理以實施例1相同的方式獲得的培養物的上清液，用超濾膜濃縮所得的上清液，然後通過噴霧乾燥製備此酶的粗製劑。將所得的粗製品酶加入到Tide(PG)(一種市售的液體去汙劑)中，並測定去垢性。將所說的粗製品酶以100nkatal/ml的濃度加入到Tide中。40℃下將含有製備的酶的去汙劑溫育4周。將2克溫育4周的含有酶的去汙劑加入到1升含有40ppm鈣離子(Ca2+)的水中，洗滌髒衣物，測定亮度，以便通過下列方程確定去垢性。10塊大小為5cm×5cm的EMPA-116用作髒衣物。
去垢性(％)＝(洗滌後衣物的亮度-髒衣物的亮度)/(乾淨衣物的亮度-髒衣物的亮度)×100也以SD521作為對照檢測去垢性。所得結果列於表11。從這些結果可以看出，API-26的加入增加了液體去汙劑的有效性。
表

實施例7含有酶API-26用於自動洗碗機的去汙劑的去垢性試驗我們使用實施例6描述的酶粗製劑檢驗了其在自動洗碗機中的去垢性。
使用市售的去汙劑(Hi-wash S(NCC))製備用於自動洗碗機的含有所說的酶的去汙劑，所說的市售去汙劑含有聚乙烯亞烷基醚、過碳酸鈉、碳酸鹽、硫酸鹽和有機酸鹽，並將其以20∶1的重量比與API-26酶的粗製劑混合。將所得的去汙劑以0.21％的濃度用於洗滌，並測定去垢性。洗滌條件機器由Matsushita電力工業有限公司裝配的自動洗碗機NP-600，其中將去汙劑溶液從旋轉的噴嘴中注入，洗滌放置在旋轉的去汙劑溶液中的盤子。
洗滌溫度溫度由5℃緩慢升至55℃水硬度為3.5°DH酶濃度0.01％用於洗滌的循環水的量2.5升髒盤子用1克蛋黃弄髒兩個直徑為25cm的陶瓷盤，並過夜風乾。去垢性的評價洗滌後，通過照相測定使用amide-Schnitz溶液反應在盤子上產生的紫色區域的面積(PI)。按照下列方程由測定的髒區域的面積計算清潔率。
清潔率(％)＝{(P0-P1)/P0×100}，其中的P0是盤子的面積。
表12顯示出計算的清潔率。此試驗也以SD521作為對照。這些結果表明含有酶API-26的去汙劑具有很強的去汙活性，這是因為其甚至對於象此試驗中所用的蛋黃那樣的頑固汙點的清潔率也為100％。應該考慮到此酶大大有助於提高用於自動洗碗機的去汙劑的去垢性。
表12

工業使用的可能性本發明的鹼性蛋白酶在市售的各種去汙劑或者表面活性劑中是非常穩定的，與現存的鹼性蛋白酶相比其對於熱也是穩定的。由於此酶在衣物和碗的洗滌過程中能有效地降解蛋白質，所以與此酶混合可以增加去垢性。
用這種酶處理蛋白質或者肽，生產其它肽或者胺基酸的過程可能是經濟的，因為此酶是穩定的。
本發明的芽孢桿菌屬未知種菌株SD 114及其突變體是很容易處理的嗜溫菌，其在本發明的鹼性蛋白酶的生產上是有用的。
通過本發明的蛋白酶的生產方法可以有效地生產本發明的鹼性蛋白酶，其中包括培養屬於芽孢桿菌屬的微生物或其突變體。
權利要求
1.滿足下列(a)-(c)所規定的至少一個條件的鹼性蛋白酶(a)40℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分鐘後剩餘活性超過60％；(b)55℃下在緩衝劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分鐘後剩餘活性超過40％；(c)55℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分鐘後剩餘活性超過20％。
2.權利要求1所規定的具有下列特性的鹼性蛋白酶(1)作用此蛋白酶能水解蛋白質和肽；(2)最適pH當此蛋白酶在30℃下，以酪蛋白為底物反應10分鐘時的最佳pH大約為12；(3)穩定pH範圍30℃下將此蛋白酶溫育24小時時，其在5-11的pH範圍內穩定；(4)最適溫度當此蛋白酶在pH10時，以酪蛋白為底物反應10分鐘時的最佳溫度大約為60℃；(5)分子量通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的分子量為29,000+2,000；(6)等電點通過等電聚焦聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的等電點為10.1±0.5。
3.權利要求1或權利要求2所規定的由屬於芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物產生的鹼性蛋白酶。
4.權利要求3所規定的由屬於芽孢桿菌屬的微生物產生的鹼性蛋白酶，其中所說的微生物是芽孢桿菌屬未知種SD114(保藏號FERM BP-5736)。
5.與權利要求4中規定的蛋白酶具有交叉反應性的鹼性蛋白酶，並且能夠滿足下列(a)-(c)所規定的至少一個條件(a)40℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分鐘後剩餘活性超過60％；(b)55℃下在緩衝劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分鐘後剩餘活性超過40％；(c)55℃下在表面活性劑溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸鹽緩衝液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分鐘後剩餘活性超過20％。
6.一種生產鹼性蛋白酶的方法，其特徵在於從產生權利要求1-5所規定的蛋白酶的屬於芽孢桿菌屬的微生物或其變種的培養物中獲得所說的蛋白酶。
7.一種生產權利要求6所規定的鹼性蛋白酶的方法，所說的蛋白酶由屬於芽孢桿菌屬的微生物產生，這種微生物是芽孢桿菌屬未知種SD114(FERM BP-5736)。
8.芽孢桿菌屬未知種SD 114(FERM BP-5736)和它的突變體。
9.去汙劑的成分，其中包括權利要求1-5所規定的蛋白酶。
10.包含權利要求1-5所規定的蛋白酶的去汙劑。
11.用於自動洗碗機的去汙劑，其中包含權利要求1-5所規定的蛋白酶。
12.生產肽或胺基酸的方法，其特徵在於使權利要求1-5任一項所規定的蛋白酶與蛋白質或者肽反應。
全文摘要
本發明涉及一種新的芽孢桿菌屬未知種菌株(保藏號FERM BP－5736)、通過培養所說的菌株或其突變體所獲得的,在表面活性劑中高度穩定的且具有下列特性的蛋白酶、此蛋白酶的產生方法和其用途。(1)能水解蛋白質或肽,(2)在30℃下,以酪蛋白為底物反應24小時的最佳pH大約為12,(3)30℃下以酪蛋白為底物反應24小時,其穩定pH範圍為5—11,(4)在pH10下以酪蛋白為底物反應10分鐘時的最佳溫度大約為60℃,(5)通過SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的分子量為29,000±2,000,(6)通過等電聚焦聚丙烯醯胺凝膠電泳測得的等電點為10.1±0.5,(7)40℃下與500ppmLAS溶液混合30分鐘的剩餘活性不少於60%,55℃下與500ppmLAS溶液混合15分鐘的剩餘活性不少於20%。
文檔編號C12P21/06GK1201489SQ96198013
公開日1998年12月9日 申請日期1996年11月1日 優先權日1995年11月2日
發明者御代田喜昭, 福山志朗, 米田正 申請人:諾沃挪第克公司 被以下專利引用 (2),