適用於擴增子測序文庫構建的引物、構建方法、擴增子文庫及包含其的試劑盒的製作方法

2024-04-05 11:51:05 1

適用於擴增子測序文庫構建的引物、構建方法、擴增子文庫及包含其的試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種適用於擴增子測序文庫構建的引物、構建方法、擴增子文庫及包含其的試劑盒。該引物包括目的片段擴增引物序列、測序引物序列以及接頭序列，目的片段擴增引物序列、測序引物序列以及接頭序列通過擴增步驟得到的擴增子文庫中目的片段擴增引物序列的至少一端上帶有內部標籤序列，內部標籤序列為6～10個鹼基按不同的排列組合所形成的序列。本發明的引物使所構建的擴增子文庫中因帶有上述內部標籤，不僅可以增加文庫的混樣個數，提高測序的通量；而且區分並除去文庫構建過程中產生汙染數據，提高後期數據分析的準確性，從而更加真實的反映出原始樣品中不同菌群的豐度比例。
【專利說明】適用於擴增子測序文庫構建的引物、構建方法、擴增子文庫 及包含其的試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及高通量測序領域，具體而言，涉及一種適用於擴增子測序文庫構建的 引物、構建方法、擴增子文庫及包含其的試劑盒。

【背景技術】
[0002] 擴增子測序是對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行測序，主要包括16S rDNA測序、18S rDNA測序、ITS測序及功能基因檢測等。採用Illumina MiSeq第二代高通 量測序平臺測定的16S/18S/ITS某個高變區域的序列，來反應環境樣品在細菌、真菌、古細 菌分類方面物種之間的差異，對研究海洋、土壤、腸道糞便等環境中的微生物構成有重要的 指導作用；同樣，也可通過對某些功能基因片段的測序，挖掘更多的生物學信息。
[0003] 16S rDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，採用MiSeq測序儀，對 16SrDNA某個高變區進行測序，以進一步對環境微生物中的細菌或古細菌的多樣性進行分 析。為完成16S rDNA的測序，首先需要基於Illumina測序儀進行相應的文庫構建，目前基 於Illumina測序平臺的建庫方法主要有兩種，包括兩步擴增建庫方法以及一步擴增建庫 方法。第一種建庫方法為較早的建庫方法，為兩步擴增建庫，即使用兩對引物進行兩輪PCR 進行建庫。第二種方法為Illumina官方推薦的一步擴增方法，該方法目前使用比較廣泛， 即通過一步擴增完成建庫過程。
[0004] 這兩種方法在建庫過程都可進行混樣建庫，即在PCR過程中將標籤序列（index) 引入到樣品中，該標籤序列信息也是進行測序時Miseq測序儀所必須加入的，在對下機數 據進行質控時，通過index信息將各個樣品的數據進行拆分。但是由於受到標籤序列信息 標籤的限制，一個樣品只能對應一個標籤序列，無法做到一個標籤序列對應多個樣品，限制 了同一個文庫中樣品的混樣個數，但是由於一個樣品需要的數據量比較少，Miseq測序儀一 個通道（lane)產出的數據量比較大，因此標籤序列的數目限制了混樣的個數少從而造成 了數據的浪費。
[0005] 同時這兩種建庫方法在建庫過程中還存在著很大的缺陷，由於16S rDNA或者ITS 等在擴增過程中使用的是混合模板（如土壤中的多個菌種的混合樣品），而且這些模板之 間序列的相似性很高，所以基因組總DNA在16S rDNA擴增時容易出現錯誤，產生一些在環 境中原本並不存在的"16S rDNA"序列。其中嵌合體（chimeria)對文庫的構建及後續數據 拆分影響較大。
[0006] 嵌合體是在PCR的過程中來自不同微生物的16S rDNA發生共擴增造成的。當以 微生物A的16S rDNA為模板進行擴增時，有可能由於延伸不完全，產生微生物A不完全的 16S rDNA單鏈分子，而在下一輪PCR擴增時，它就可能與另一種序列相近的微生物B的16S rDNA分子退火，並自身作為引物以微生物B的16S rDNA分子為模板延伸，產生一個一部分 來自於微生物A而另一部分來自於微生物B的嵌合體16S rDNA分子，這就叫做嵌合體。這 種原始樣品中並不存在的嵌合體分子，會導致過高估計環境中微生物的多樣性。
[0007] 針對上述如16S rDNA之類模板所構建的文庫，目前還沒有好的解決辦法來區別上 述嵌合體，使得所得到的測序數據的準確性較低。因此，仍需要對現有的擴增子建庫流程進 行改進，以提供一種既便於區分上述"汙染數據"又能提高測序通量的文庫構建方法。


【發明內容】

[0008] 本發明旨在提供一種適用於擴增子測序文庫構建的引物、構建方法、擴增子文庫 及包含其的試劑盒，以提高測序文庫的通量，並提高所得測序數據的準確性。
[0009] 為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種適用於擴增子文庫構建 的引物，包括目的片段擴增引物序列、測序引物序列以及接頭序列，目的片段擴增引物序 列、測序引物序列以及接頭序列通過擴增步驟得到的擴增子文庫中目的片段擴增引物序列 的至少一端上帶有內部標籤序列，內部標籤序列為6?10個鹼基按不同的排列組合所形成 的序列。
[0010] 進一步地，當目的片段擴增引物序列與測序引物序列單獨設計時，內部標籤序列 設置在目的片段擴增引物序列上或者設置在測序引物序列上。
[0011] 進一步地，內部標籤序列設置在目的片段擴增引物序列的5'端或者設置在測序引 物序列的3'端。
[0012] 進一步地，當目的片段擴增引物序列與測序引物序列設計在同一條引物上時，內 部標籤序列設置在目的片段擴增引物序列與測序引物序列之間。
[0013] 進一步地，引物構建的擴增子文庫中的目的片段擴增引物序列與測序引物序列相 連的兩端均帶有內部標籤序列。
[0014] 進一步地，兩端的內部標籤序列相同或不同。
[0015] 進一步地，當目的片段擴增引物序列與測序引物序列設計在同一條引物上時，同 一條引物稱為文庫擴增引物，文庫擴增引物由一條文庫擴增上遊引物和一條文庫擴增下遊 引物組成，文庫擴增上遊引物由目的片段擴增上遊引物、測序上遊引物和接頭序列上遊引 物組成，文庫擴增下遊引物由目的片段擴增下遊引物、測序下遊引物和接頭序列下遊引物 組成。
[0016] 進一步地，接頭序列上遊引物為P5接頭序列引物，接頭序列的下遊引物為P7接頭 序列引物，測序下遊引物還包括外部標籤序列，外部標籤序列為6?10個鹼基按不同的排 列組合所形成的序列，且外部標籤序列與內部標籤序列相同或不同。
[0017] 進一步地，引物用於構建16S rDNA v4區、18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測 序文庫。
[0018] 進一步地，當引物用於構建16S rDNA v4區的擴增子測序文庫時，引物由SEQ ID N0·1、SEQIDN0·2、SEQIDN0·3、SEQIDN0·4、SEQIDN0·5、SEQIDN0·6和SEQIDN0·7 所示的上遊引物中的任一條上遊引物；與SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14所示的下遊引物中的任一條下遊 引物隨機組合而成。
[0019] 進一步地，當引物用於構建18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測序文庫時，引物 中的用於擴增目的引物為18S rDNA、ITS或功能基因上的保守序列。
[0020] 根據本發明的另一方面，還提供了一種擴增子測序文庫的構建方法，構建方法利 用上述任一種引物進行擴增，得到擴增子測序文庫。
[0021] 根據本發明的又一方面，進一步提供了一種擴增子測序文庫，該擴增子測序文庫 在目的片段的至少一端上帶有內部標籤序列，內部標籤序列為6?10個鹼基按不同的排列 組合所形成的序列。
[0022] 根據本發明的再一方面，提供了一種試劑盒，該試劑盒包括上述任一種引物。
[0023] 應用本發明的技術方案，通過對現有的擴增子文庫構建所用的引物進行改進，使 所構建的擴增子文庫中目的片段擴增引物序列的至少一端上帶有內部標籤序列，增加的內 部標籤,不僅可以增加文庫的混樣個數,提高測序的通量；而且可以根據內部標籤序列信息 進一步區分並除去文庫構建過程中產生的嵌合體以及非相關的PCR產物，提高後期數據分 析的準確性，從而更加真實的反映出原始樣品中不同菌群的豐度比例。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示 意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0025] 圖1示出了本發明一種優選實施例中所提供的引物結構示意圖；
[0026] 圖2示出了本發明實施例1通過擴增後所得到擴增子測序文庫經電泳檢測的結 果；
[0027] 圖3示出了本發明實施例2通過擴增後所得到擴增子測序文庫經電泳檢測的結 果；以及
[0028] 圖4示出了本發明實施例3通過擴增後所得到擴增子測序文庫經電泳檢測的結 果。

【具體實施方式】
[0029] 需要說明的是，在不衝突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特徵可以相 互組合。下面將參考附圖並結合實施例來詳細說明本發明。
[0030] 如【背景技術】部分所提到的，在現有技術中，擴增子測序文庫的構建方法所構建的 文庫存在通量低且後續得到的測序數據準確性較低的缺陷。為了克服上述缺陷，在本發明 一種典型的實施方式中，提供了一種適用於擴增子測序文庫構建的引物，提供了一種適用 於擴增子文庫構建的引物，包括目的片段擴增引物序列、測序引物序列以及接頭序列，目的 片段擴增引物序列、測序引物序列以及接頭序列通過擴增步驟得到的擴增子文庫中目的片 段擴增引物序列的至少一端上帶有內部標籤序列，內部標籤序列為6?10個鹼基按不同的 排列組合所形成的序列。
[0031] 本發明的上述引物通過對現有的擴增子文庫構建所用的引物進行改進，使所構建 的擴增子文庫中目的片段擴增引物序列的至少一端上帶有內部標籤序列。通過增加的內部 標籤，不僅可以增加文庫的混樣個數，提高測序的通量；而且可以根據內部標籤序列信息進 一步區分並除去文庫構建過程中產生的嵌合體和非相關的PCR產物。比如，我們使用的內 部標籤序號上遊為1，下遊為2,而在產物中出現了 1、1組合或者2,2組合，或者沒有加入的 組合3,4或者產生了沒有標籤序列的片段，在進行信息分析時可認為該部分為汙染數據， 我們就可以將其去除，只使用上遊為1下遊為2的數據進行分析，提高了後期數據分析的準 確性，從而更加真實的反映出原始樣品中不同菌群的豐度比例。
[0032] 與現有技術相比，本發明的上述引物可以通過內部標籤序列的不同來標示不同樣 品的模板來源，增加混樣數目，從而提高測序的通量；還可以通過內部標籤序列來確定目的 片段的菌種來源，提高了後續測序文庫數據分析的準確性。上述內部標籤序列的序列信息 通常由6?10個鹼基按不同的排列組合形成，沒有特殊的設計要求，只要排列形成不同的 序列能夠用來區分不同的PCR樣品即可。
[0033] 在本發明的上述用於擴增子文庫構建的引物中，對目的片段擴增引物序列、測序 引物序列的具體設計形式並無特殊限制，可以採用常規的形式以單獨的兩對引物存在，通 過逐步擴增的方式來構建擴增子文庫，也可以以其他的引物設計形式來進行擴增，只要能 夠利用上述引物擴增得到具有上述結構特徵的測序文庫即可。
[0034] 在上述原則指導下，根據構建方法步驟的不同，可以對所用的引物進行不同的設 計。當採用多步擴增得到上述文庫時，目的片段擴增引物序列和測序引物序列需要分步使 用，此時，內部標籤序列可以設置在目的片段擴增引物序列上也可以設置在測序引物序列 上。在本發明中，當內部標籤序列設置在目的片段擴增引物序列上時，設置在目的片段擴 增引物序列的5'端；當內部標籤序列設置在測序引物序列上時，設置在測序引物序列的3' 端，這樣能夠確保內部標籤序列能夠被測序測到，同時能夠區分目的片段的樣品來源。
[0035] 在本發明一種優選的實施例中，上述引物構建的擴增子文庫中的目的片段擴增引 物序列與測序引物序列相連的兩端均帶有內部標籤序列。通過在目的片段擴增引物序列與 測序引物序列相連的兩端均帶上內部標籤序列，使得各樣品PCR產物兩端均包含相應的內 部標籤信息，從而可以通過改變不同樣品兩端的內部標籤序列信息來標示不同的樣品，從 而可以無限制的進行樣品混池；而且由於每個樣品PCR產物具有兩個相對應的固定的內部 標籤信息，如果產生嵌合體則內部標籤信息會發生改變，此時則通過篩選可以去除掉嵌合 體，使得後期的數據信息分析更加準確，從而能夠更加真實的反映出原始樣品的菌群豐度 比例。
[0036] 在本發明的上述優選實施例中，由於每個樣品兩端的內部標籤序列都有固定搭 配，因此，只要能跟另一個樣品區分開來即可。因此，上述每個樣品兩端的內部標籤序列可 以相同也可以不同。相同時能減少涉及標籤的數目，不同時更能增加不同樣品的特異性，在 一端的內部標籤序列也無法區分樣品來源時，可以進一步通過另一端的內部標籤序列來進 行區分，從而更徹底地去除所可能混有的嵌合體。在本發明中，優選兩端的內部標籤序列不 同。
[0037] 本發明的上述用於擴增子文庫構建的引物，也可以採用一步擴增的方法進行文庫 構建。當採用一步擴增的方法進行文庫構建時，需將目的片段擴增引物序列和測序引物序 列設計在同一條引物上，此時，將內部標籤序列設置在目的片段擴增引物序列和測序引物 序列之間。這種一步擴增的方法能夠快速、方便地得到目的片段的至少一端上帶有內部標 籤序列的擴增子測序文庫。在本發明一種優選的實施例中，上述同一條引物具體稱為文庫 擴增引物，該文庫擴增引物由一條文庫擴增上遊引物和一條文庫擴增下遊引物組成，文庫 擴增上遊引物由目的片段擴增上遊引物、測序上遊引物和接頭序列上遊引物組成，文庫擴 增下遊引物由目的片段擴增下遊引物、測序下遊引物和接頭序列下遊引物組成。這種將三 條不同的上遊引物和三條不同的下遊引物整合於一對文庫擴增引物上的設計方式，不僅大 大降低了多步擴增帶來的汙染風險，而且簡化了文庫構建流程，縮短了文庫構建時間。
[0038] 在本發明的上述優選實施例中，為了與常規的Miseq測序平臺的試劑配套使用， 其中的接頭序列和測序引物序列均為本領域擴增子文庫構建常用的序列。即上遊引物為的 P5引物，接頭序列的下遊引物為P7引物，用於測序的下遊引物還包括外部標籤序列，外部 標籤序列為6?8個鹼基按不同的排列組合所形成的序列，且外部標籤序列與內部標籤序 列相同或不同。
[0039] 接頭序列通過採用P5接頭序列和P7接頭序列以及測序引物序列。常規測序引物 序列上的標籤序列為外部標籤序列，可以自己設計，也可以利用常規的標籤序列進行設計， 本領域技術人員可以自行選擇，在此不再贅述。外部標籤序列與內部標籤序列相同與否，都 不影響其對目的片段來源的區分，只是影響所需要設計的標籤序列的數目。在本發明中，優 選外部標籤序列與內部標籤序列不同，這樣，對目的片段樣品來源的鑑別程度更強，且能夠 混樣的數目更多，能更進一步提高測序通量。
[0040] 本發明的上述引物，由於能夠在後續更準確地區別目的片段的模板來源，因此更 適合應用於構建16S rDNA v4區、18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測序文庫。16S rDNA v4區、18S rDNA和ITS大部分序列在不同的物種都是相當保守的，因此，在保守序列上設計 引物，且在引物上帶有不同的內部標籤序列的標示，可以在具有相同的外部標籤序列時，通 過不同的內部標籤序列來區分不同樣品來源的擴增子文庫。在用於16S rDNA v4區、18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測序文庫時，只需更改擴增目的片段即可。
[0041] 當本發明的上述引物用於構建16S rDNA v4區的擴增子測序文庫時，上遊文庫擴 增引物包括：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0·6和SEQIDN0·7所示的上遊引物；以及SEQIDN0·8、SEQIDN0·9、SEQIDN0·10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14所示的下遊引物，擴增時上述任 一種上遊引物與任一種下遊引物隨機搭配使用。上述構建16S rDNA v4區的擴增子測序文 庫的引物，都僅需要一步擴增即可完成文庫的構建，既操作簡單、降低汙染，又能提高後續 文庫測序數據的準確性，同時又能增加測序通量。
[0042] 在本發明另一種典型的實施方式中，提供了一種擴增子測序文庫的構建方法，該 構建方法通過利用上述任一種引物擴增得到擴增子測序文庫。這種建庫方法不僅能夠不僅 可無上限地提高文庫的混樣個數，提高測序通量，更重要是的可以去除嵌合體，提高後期測 序數據信息分析的準確性，從而能夠更加真實的反映出原始樣品的菌群豐度比例，是一種 優化的擴增子快速、靈活高通量建庫流程。
[0043] 在本發明又一種典型的實施方式中，還提供了一種擴增子測序文庫，該擴增子測 序文庫中在目的片段的至少一端上帶有內部標籤序列，內部標籤序列為6?10個鹼基按不 同的排列組合所形成的序列。本發明的這種文庫因在目的片段上帶有了內部序列標籤，一 方面擴大了標籤的數目，有利於增加混樣量，提高測序通量；另一方面能夠除去嵌合體，提 高測序文庫後續分析的準確性。
[0044] 在本發明再一種典型的實施例中，還提供了一種試劑盒，該試劑盒包括上述任一 種引物。本發明的試劑盒所構建的測序文庫在目的片段上帶有內部序列標籤，不僅擴大了 標籤的數目，可以在同一測序通道中無上限地增加混樣量，提高測序通量；而且含便於後續 分析測序數據時利用該內部標籤除去汙染數據，提高分析的準確性，有巨大的潛在市場價 值。
[0045] 下面將結合具體的實施例來說明本發明的有益效果。
[0046] 實施例1
[0047] 應用於Illumina MiSeq測序的16S rDNA v4區擴增子測序文庫的構建方法，包括 如下實驗步驟：
[0048] (1)根據樣品16S rDNA DNA濃度，使用無菌水將樣品稀釋至Ing/ μ 1，如果樣品中 存在大量的RNA汙染則需要先使用RNase消化後再進行稀釋。
[0049] (2)PCR擴增。使用表1中所示的已經合成好的引物按照表2所示的組合進行擴 增。
[0050] 表 1 :
[0051]

【權利要求】
1. 一種適用於擴增子文庫構建的引物，包括目的片段擴增引物序列、測序引物序列以 及接頭序列，其特徵在於，所述目的片段擴增引物序列、所述測序引物序列以及所述接頭序 列通過擴增步驟得到的擴增子文庫中目的片段擴增引物序列的至少一端上帶有內部標籤 序列，所述內部標籤序列為6?10個鹼基按不同的排列組合所形成的序列。
2. 根據權利要求1所述的引物，其特徵在於，當所述目的片段擴增引物序列與所述測 序引物序列單獨設計時，所述內部標籤序列設置在所述目的片段擴增引物序列上或者設置 在所述測序引物序列上。
3. 根據權利要求2所述的引物，其特徵在於，所述內部標籤序列設置在所述目的片段 擴增引物序列的5'端或者設置在所述測序引物序列的3'端。
4. 根據權利要求1所述的引物，其特徵在於，當所述目的片段引物與所述測序引物序 列設計在同一條引物上時，所述內部標籤序列設置在所述目的片段擴增引物序列與所述測 序引物序列之間。
5. 根據權利要求1所述的引物，其特徵在於，所述引物構建的擴增子文庫中的所述目 的片段擴增引物序列與所述測序引物序列相連的兩端均帶有所述內部標籤序列。
6. 根據權利要求5所述的引物，其特徵在於，兩端的所述內部標籤序列相同或不同。
7. 根據權利要求4所述的引物，其特徵在於，當所述目的片段擴增引物序列與所述測 序引物序列設計在同一條引物上時，所述同一條引物稱為文庫擴增引物，所述文庫擴增引 物由一條文庫擴增上遊引物和一條文庫擴增下遊引物組成，所述文庫擴增上遊引物由目的 片段擴增上遊引物、測序上遊引物和接頭序列上遊引物組成，所述文庫擴增下遊引物由目 的片段擴增下遊引物、測序下遊引物和接頭序列下遊引物組成。
8. 根據權利要求7所述的引物，其特徵在於，所述接頭序列上遊引物為P5接頭序列 引物，所述接頭序列的下遊引物為P7接頭序列引物，所述測序下遊引物還包括外部標籤序 列，所述外部標籤序列為6?10個鹼基按不同的排列組合所形成的序列，且所述外部標籤 序列與所述內部標籤序列相同或不同。
9. 根據權利要求7或8中所述的引物，其特徵在於，所述引物用於構建16S rDNA v4 區、18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測序文庫。
10. 根據權利要求9所述的引物，其特徵在於，當所述引物用於構建16S rDNA v4區的 擴增子測序文庫時，所述引物由： SEQIDNO·l、SEQIDNO·2、SEQIDNO·3、SEQIDNO·4、SEQIDNO·5、SEQIDNO·6和 SEQ ID NO. 22所示的上遊引物中的任一條上遊引物；與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12 和 SEQ ID NO. 13所示的下遊引物中的任一條下遊引物隨機組合而成。
11. 根據權利要求9所述的引物，其特徵在於，當所述引物用於構建18S rDNA、ITS或 功能基因的擴增子測序文庫時，所述引物中的用於擴增目的引物為18S rDNA、ITS或功能基 因上的保守序列。
12. -種擴增子測序文庫的構建方法，其特徵在於，所述構建方法利用權利要求1至11 中任一項所述的引物進行擴增，得到所述擴增子測序文庫。
13. -種擴增子測序文庫，其特徵在於，所述擴增子測序文庫在目的片段的至少一端上 帶有內部標籤序列，所述內部標籤序列為6?10個鹼基按不同的排列組合所形成的序列。
14. 一種試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括權利要求1至11中任一項所述的引物。
【文檔編號】C40B40/06GK104293783SQ201410522715
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】蔣智, 曹志生, 朱海浩, 王大偉, 李明洲, 劉運超 申請人:天津諾禾致源生物信息科技有限公司