基於衍生方法的尿液代謝物的檢測方法

2024-01-30 00:51:15

專利名稱：基於衍生方法的尿液代謝物的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程技術領域的尿液代謝物的檢測方法，具體涉及一 種基於衍生方法的尿液代謝物的檢測方法。
背景技術：
尿液中代謝物的測定對於了解正常的生理過程、疾病的機制、藥物治療的
靶點，以及藥物藥效的評價有著極為重要的意義。從上個世紀中期開始人們就
一直在通過代謝物的測定來了解疾病。例如， 一個經典的例子是苯丙酮酸尿症，
人們通過檢測尿液中的苯丙酮酸來反應人體是否有基因的缺陷。近年來，以測
定體液中代謝物為主要研究目標的代謝組學更是將代謝物的檢測推向一個新的
階段，人們嘗試用各種先進的儀器和方法測定體液包括尿液和血液等中的代謝
物，通過多維統計的計算方法，從整體上反映發病個體與健康對照之間的代謝
差異，從而提高對疾病的理解，並為探索疾病的診斷和治療提供新的突破口。
目前，能相對全面地檢測體液中代謝物的工具主要有核磁共振(NMR)、液相色
譜質譜聯用和氣相色譜質譜聯用技術。與另外兩種技術相比，氣相色譜質譜聯
用技術有更高的靈敏度和更強大的物質鑑定功能，可以為全面了解代謝產物提
供更豐富的信息。但是，氣相色譜質譜聯用技術只能檢測具有揮發性的物質，
而代謝物產物中，特別是尿液中的一般都是強極性物質，因此通常需要衍生的
方法降低被測物的極性以達到氣質聯用檢測的要求。
經對現有技術的文獻檢索發現，迄今為止，代謝物的氣相色譜分析的前衍
生化方法主要是矽烷化，Zhang， Q等在《Journal of Chromatography B》(色
譜B) (2007年，第854期20-25頁)上發表的"GC/MS analysis of the rat
urine for metabonomic research."(氣相色譜質譜聯用分析大鼠尿樣的代謝
組學研究)，該文中主要是矽烷化，該法能衍生包括胺基酸、氨類、糖類、膽
固醇和有機酸等多類體液中的主要代謝物，但該衍生方法對檢測環境要求較高，
衍生物在空氣中容易被水分潮解，同時對氣相色譜質譜的檢測器汙染嚴重，從
而影響測定的準確性，容易導致產生錯誤的信息，影響最終的分析研究結果。 氯甲酸甲酯的衍生方法也是氣相色譜質譜聯用經常運用的一個衍生方法，可以 分析胺基酸類、氨類以及有機酸類等多種物質。氯甲酸甲酯的衍生最大優勢是 可以在水相中直接對被分析物進行衍生，再用通過氯仿等有機溶劑萃取衍生物 進行分析，同時氯甲酸甲酯的衍生物不含矽垸基，不會對色譜柱和檢測器造成 汙染，這樣可以提高分析物的可信度。另外，氯甲酸甲酯衍生操作還有反應時 間短、操作簡便、重現性好等優點。氯甲酸甲酯的衍生方法以往被用於胺基酸 和有機酸的測定，進一步檢索中，目前尚未發現在機體代謝物中運用的相關文 獻報導。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種基於衍生方法的尿液代謝物的檢測 方法，使其用於檢測有機體尿液中代謝特徵，為了解正常的生理過程、疾病的 發生發展機制、藥物治療的靶點提供有效的信息和依據，該方法操作簡便、穩 定性高、結果可靠。
本發明是通過以下技術方案實現的，包括以下步驟
第一步，將收集的尿液離心後保存。
所述保存，其溫度為-80C。
第二步，取第一步得到的尿液，加入甲醇、吡啶、氯甲酸甲酯，並在超聲 儀上超聲作用進行衍生反應。
所述尿液，其用量為600μL，加入40μL甲醇、100μL吡啶、50叱氯甲酸甲酯。
所述超聲儀，其超聲頻率為40KHz，超聲作用時間為60s。
第三步，取氯仿對第二步中衍生混合液進行萃取，並加入氫氧化鈉溶液。
所述氯仿用量為300μL。
所述氫氧化鈉溶液加入量為100μL。
所述氫氧化鈉溶液，其濃度為7 mol/L。
第四步，取氯甲酸甲酯加入第三步的溶液中，再次混合，並在超聲儀上超 聲作用進行二次衍生反應，反應完畢將反應液蝸旋，再離心，棄去水層，剩下 的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉乾燥，待氣相色譜質譜聯用測定。
所述氯甲酸甲酯，其用量為50A。所述超聲儀，其超聲頻率為40KHz，超聲作用時間為60s。 所述渦旋，其時間為30s。
所述離心，其時間為IO min，轉速為3000轉/分鐘。 第五步，取氯仿層用於氣相色譜色譜質譜聯用測定。 所述氯仿層用量為l化。
代謝特徵研究的是代謝終產物，它不僅能反應基因變化所帶來的相應的機 體機能改變，同時也能反應外界環境刺激引起的變化，它是一種反應機體綜合 表徵的方法。代謝組學利用高解析度的檢測儀器，例如核磁共振、色譜與質譜 聯用等方法檢測體液中的代謝物，結合多維統計的數學計算，能準確尋找到疾 病狀態下的代謝產物變化。通過分析這些與疾病相關的代謝特徵，從而建立潛 在的生物標誌物，利用這些標誌物可以進行疾病的早期診斷和分期，並為疾病 的治療提供新的可能的耙標。
尿液，作為機體代謝的最終排洩物，是一種包含了豐富代謝變化信息的體 液樣本，同時它的獲取屬於完全無創性的，適合於動物代謝組研究或臨床大規 模的體檢排査。本發明操作簡單，可以在水相中進行反應，反應快捷，超聲反 應2分鐘即可，穩定性好，重現性高。


圖1是本發明實施例1所得用氯甲酸甲酯衍生大鼠尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
圖2是本發明實施例2所得用氯甲酸甲酯衍生小鼠尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
圖3是本發明實施例3所得用氯甲酸甲酯衍生豚鼠尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
圖4是本發明實施例4所得用氯甲酸甲酯衍生人體尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方 案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的 保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1取-80'C下保存的大鼠尿樣(用代謝籠收集的大鼠24小時尿樣)，解凍後離 心去除沉澱。取上清液600yL，加入甲醇400^L、吡啶100uL，並加入50uL 氯甲酸甲酯，並在40KHz超聲儀上超聲60s進行衍生反應。取300叱氯仿對衍 生混合液進行萃取。並加入7 mol/L IOO叱的氫氧化鈉溶液，再加5(mL氯甲酸 甲酯於上述溶液中，進行混合，並在40KHz超聲儀上超聲60s進行二次衍生反 應；反應完畢將反應液蝸旋30s後，離心10min (3000轉/分鐘)，棄去水層， 剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉乾燥，待氣相色譜質譜聯用測定。結果如附 圖1所示。從中分析鑑定了尿液中的85個代謝物，包括20種胺基酸，32種有 機酸，12種胺類和20種其它的物質。
實施例2
取-8(TC下保存的小鼠尿樣(用代謝籠收集的小鼠24小時尿樣)，解凍後離 心去除沉澱。取上清液600uL，加入400uL甲醇、100uL吡啶，和50uL氯 甲酸甲酯，並在40KHz超聲儀上超聲60s進行衍生反應。取300叱氯仿對衍生 混合液進行萃取。並加入7 mol/L IOO叱的氫氧化鈉溶液，再加50叱氯甲酸甲 於上述溶液中，進行混合，並在40KHz超聲儀上超聲60s進行二次衍生反應； 反應完畢將反應液蝸旋30s後，離心10 min (3000轉/分鐘)，棄去水層，剩 下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉乾燥，待氣相色譜質譜聯用測定。測定結果如 附圖2所示。從中分析鑑定了尿液中的45個代謝物，包括12種胺基酸，18種 有機酸，5種胺類和10種其它的物質。
實施例3
取-8(TC下保存的豚鼠尿樣(用代謝籠收集的豚鼠24小時尿樣)，解凍後離 心去除沉澱。取上清液600u L，加入400uL甲醇、100uL吡啶，和50uL氯 甲酸甲酯，並在40KHz超聲儀上超聲60s進行衍生反應。取300叱氯仿對衍生 混合液進行萃取。並加入7mol/L IOO叱的氫氧化鈉溶液，再加50ML氯甲酸甲 酯於上述溶液中，進行混合，並在40KHz超聲儀上超聲60s進行二次衍生反應； 反應完畢將反應液蝸旋30s後，離心10 min (3000轉/分鐘)，棄去水層，剩 下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉乾燥，待氣相色譜質譜聯用測定。測定結果如 附圖3所示。從中分析鑑定了尿液中的91個代謝物，包括18種胺基酸，35種 有機酸，9種胺類和29種其它的物質。 實施例4
取-8(TC下保存的人尿樣(晨尿)，解凍後離心去除沉澱。取上清液600ixL， 加入400pL甲醇、100wL吡啶和50uL氯甲酸甲酯，並在40KHz超聲儀上超聲 60s進行衍生反應。取300PL氯仿對衍生混合液進行萃取。並加入7 mol/L IOO叱 的氫氧化鈉溶液，再加50叱氯甲酸甲酯於上述溶液中，進行混合，並在40KHz 超聲儀上超聲60s進行二次衍生反應；反應完畢將反應液蝸旋30s後，離心10 min (3000轉/分鐘)，棄去水層，剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉乾燥，待氣相 色譜質譜聯用分析。測定結果如附圖4所示。從中分析鑑定了尿液中的81個代 謝物，其中21種胺基酸，30種有機酸，13種胺類和17種其它的物質。
權利要求
1、一種基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟第一步，將收集的尿液離心後保存；第二步，取第一步得到的尿液，加入甲醇、吡啶、氯甲酸甲酯，並在超聲儀上超聲作用進行衍生反應；第三步，取氯仿對第二步中衍生混合液進行萃取，並加入氫氧化鈉溶液；第四步，取氯甲酸甲酯加入第三步的溶液中，再次混合，並在超聲儀上超聲作用進行二次衍生反應，反應完畢將反應液蝸旋，再離心，棄去水層，剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉乾燥，待氣相色譜質譜聯用測定；第五步，取氯仿層用於氣相色譜色譜質譜聯用測定。
2、 根據權利要求1所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法，其特徵是，第一步中，所述保存，其溫度為-80℃。
3、 根據權利要求1所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法，其特徵是，第二步中，取尿液600uL，加入40uL甲醇、100uL吡啶、50uL氯甲酸甲酯。
4、 根據權利要求1或3所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法， 其特徵是，第二步中，所述超聲儀，其超聲頻率為40KHz，超聲作用時間為60s。
5、 根據權利要求1所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法，其特徵是，第三步中，所述氯仿用量為300uL，所述氫氧化鈉溶液加入量為100uL。
6、 根據權利要求1或5所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法， 其特徵是，第三步中，所述氫氧化鈉溶液，其濃度為7 mol/L。
7、 根據權利要求1所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法，其特徵是，第四步中，所述氯甲酸甲酯，其用量為50uL；所述超聲儀，其超聲頻率 為40KHz，超聲作用時間為60s。
8、 根據權利要求1或7所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法， 其特徵是，第四步中，所述蝸旋，其時間為30s。
9、根據權利要求1或7所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法， 其特徵是，第四步中，所述離心，其時間為1O min，轉速為3000轉/分鐘。
10、根據權利要求1所述的基於衍生方法的尿液代謝特徵的檢測方法，其 特徵是，第五步中，所述氯仿層用量為lμL。
全文摘要
本發明涉及一種生物工程技術領域的基於衍生方法的尿液代謝特徵物的測定方法，具體為將收集的尿液離心後保存；取尿液，加入甲醇、吡啶、氯甲酸甲酯，並在超聲儀上超聲作用進行衍生反應；取氯仿對衍生混合液進行萃取，並加入氫氧化鈉溶液；取氯甲酸甲酯加入上步所得的溶液中，再次混合，並在超聲儀上超聲作用進行二次衍生反應，反應完畢將反應液蝸旋，再離心，棄去水層，剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉乾燥，待氣相色譜質譜聯用測定；取氯仿層用於氣相色譜色譜質譜聯用測定。本發明具有操作簡單(可以在水相中進行反應)、反應快捷(超聲反應2分鐘即可)、穩定性好、重現性高等特點。
文檔編號G01N30/00GK101206203SQ200710172348
公開日2008年6月25日 申請日期2007年12月14日 優先權日2007年12月14日
發明者李後開, 墨 淡, 偉 賈, 邱雲平 申請人:上海交通大學