同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度的測定方法
2024-02-03 11:35:15 2
專利名稱：同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發明還涉及測 定同型半胱氨酸濃度的測定方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。
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測定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色譜法
(HPLC)、胺基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯免疫分析法(EIA)、 毛細管氣相色譜-質譜，螢光偏振免疫分析(FPIA)、電化學法及酶法等等。
1.高效液相色譜法(HPLC):是經典的參考方法，但其有操作比較 複雜，試驗耗時比較長，試驗數據變異比較大的缺點，在臨床應用方 面逐漸被酶聯免疫分析法、螢光偏振分析法和酶法所取代。高效液相 色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成還 原形式，然後與螢光劑進行衍生生成同型半胱氨酸-螢光物質複合物， 將衍生後的樣品進行色譜分析。因色譜固定相對不同物質的吸附力不 同，因此流動相將其洗脫下來的次序也不同，根據這一原理將樣品中 的不同物質分開，以螢光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-螢光物質復 合物的螢光強度，將其與標準品/內標的比值進行比較和計算，就可以 測定血總同型半胱氨酸的水平。
2. 酶聯免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的
常用方法，其特點是操作比較方便、快捷，重複性好，方法穩定可靠。 缺點是大部分操作還是手工操作，比較耗時等。酶聯免疫分析法其基
本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成S-腺
苷-L-同型半胱氨酸,然後加入酶標的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單
克隆或多克隆抗體，採用競爭結合的原理，將不同水平的標準品與酶 標抗體競爭結合，然後以顯色試劑和終止試劑分別進行顯色和終止， 製作出同型半胱氨酸濃度與發色強度的標準曲線。樣品也按相同步驟 處理，在標準曲線上就可以査出其同型半胱氨酸的濃度。
3. 離子色譜法主要用於實驗研究，臨床上較少使用。其基本分 析原理是色譜分析的一種，主要是其固定相採用離子交換物質，根據 其對不同離子的吸附力不同可將同型半胱氨酸與其它物質分開進行測 定。
4. 毛細電泳法主要用於實驗研究，有在臨床使用的報導。其特 點與高效液相色譜方法相似，如其有操作比較複雜、試驗耗時較長和 試驗數據變異比較大的缺點。基本分析原理先使用還原劑使血樣中 所有形式的同型半胱氨酸轉變成還原形式，然後與螢光試劑進行衍生 生成同型半胱氨酸-螢光物質複合物，將衍生後的樣品進行毛細電泳分 析。將樣品放置於10千伏左右的高壓電場中，因為各種物質所帶電荷 不同，其等電點也不相同，因此其在電場中的遷移速度也就不同，根 據這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質分開，再以螢光檢測器檢測同型半胱氨酸-螢光物質複合物的螢光強度，將其與標準品/ 內標的比值進行比較和計算，就可以測定總同型半胱氨酸的水平。
5. 螢光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法， 該方法完全自動化儀器分析，具有快速、準確、方便的優點。其基本 分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結合的同型半 胱氨酸的螢光偏振強度不同，將樣品、標準品與標抗體競爭結合，採 用競爭結合的原理製作出同型半胱氨酸濃度與螢光偏振強度的標準曲 線，在標準曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。
6. 酶法是因應市場需求而新開發出來的測試方法，目前國內有多
項專利申請CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半 胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉甲基酶
(E.C.2丄1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3丄1)的循環擴增作用， 再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶 等，或腺苷脫氨酶、穀氨酸脫氫酶等顯色反應測定同型半胱氨酸含量； CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用於同型半胱氨酸使之 產生硫化氫後再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產生螢光，該方法使用 全自動螢光分析儀測試，具有快速、準確、方便的優點。其基本分析 原理用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產物再與 螢光顯色劑發生化學反應形成可測量之螢光化合物。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶反應偶聯化學反應技
術，計量由胱硫醚Y合酶(cystathionine ^-synthase EC 2,5.1.48)酶解
同型半胱氨酸產生的硫化氫和N,N-二甲基苯二胺、在氯化鐵的輔助下 發生化學反應生成亞甲基蘭，而在660nm波長處吸光度的變化，得以 測定同型半胱氨酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方 法的同型半胱氨酸診斷試劑盒，採用該試劑盒不僅可以在可見光分析 儀或半、全自動生化分析儀上進行同型半胱氨酸濃度的測定，而且測 定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明同型半胱氨酸濃度測定方法原理如下
同型半胱氨酸+琥珀酸胱硫醚Y合酶硫化氫+
琥珀酸基，高絲氨酸 硫化氫+ N,N-二甲基苯二胺+氯化鐵一~^亞甲基蘭 這種方法應用胱硫醚Y合酶(cystathionines-synthase EC 2.5.1.48) 偶聯化學反應終點比色法。胱硫醚Y合酶(cystathionine y-synthase EC2.5丄48)酶解同型半胱氨酸產生硫化氫，再通過偶聯N,N-二甲 基苯二胺的化學反應，產生亞甲基蘭(在660nm處有吸收峰)，從 而得以測定660nm處吸光度上升的程度，可以測算同型半胱氨酸 濃度的大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明同型半胱氨 酸診斷試劑盒較為理想
緩衝液 pH8.2 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
胱硫醚Y合酶 5000 U/L
N，N-二甲基苯二胺 2.5 mmol/L
氯化鐵 0.6 mmol/L
本發明的同型半胱氨酸診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、N，N- 二甲基苯二胺(N, N-dimethyl-p-phenylenediamine )、 氯化鐵 (ferric chloride )、 胱硫醚y合酶 (cystathionine y曙synthase EC 2.5.1.48)。
試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、胱硫醚Y合酶(cystathionine ^synthase EC 2.5.1.48)。
試劑2
N，N-二甲基苯二胺(N， N-dimethyl- p-phenylenediamine )、氯 化鐵(ferric chloride)。
試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、胱硫醚y合酶(cystathionine y-synthase EC 2.5.1.48)。
試劑2
N，N-二甲基苯二胺(N， N-dimethyl- p-phenylenediamine )。
試劑3
緩衝液、氯化鐵(ferric chloride)。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成 液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為單試劑，包括
緩衝液 pH8.2 100mmol/L 穩定劑 30 mmol/L
胱硫醚Y合酶 4000 U/L
N,N-二甲基苯二胺 3mmol/L 氯化鐵 1 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑; 使用前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間IO分鐘，起 始吸光度《0.1，測試主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半 胱氨酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)， 檢測方法為終點法，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生
化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同型
半胱氨酸濃度的大小。
實施例二
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
緩衝液 pH8.2 10Ommol/L 穩定劑 40 mmol/L
胱硫醚Y合酶 3000 U/L
試劑2
N,N-二甲基苯二胺 2.5 mmol/L
氯化鐵 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱 氨酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上 升反應)，檢測方法為終點法，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同型半 胱氨酸的濃度大小。 實施例三
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
緩衝液 pH8.2 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
胱硫醚Y合酶 5000 U/L
試劑2
N,N-二甲基苯二胺 2 mmol/L
試劑3
緩衝液pH8.2 100 mmol/L
氯化鐵 1 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定同型半胱氨酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定:溫度37°C ， 反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長660nm，測試副波 長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比 例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點法， 檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同型半 胱氨酸濃度的大小。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化 分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好、不受內外 源物質的汙染，便於推廣應用。
權利要求
1.一種同型半胱氨酸濃度測定方法，其方法原理如下同型半胱氨酸+琥珀酸 胱硫醚γ合酶 硫化氫+琥珀酸基-高絲氨酸硫化氫+N，N-二甲基苯二胺+氯化鐵-→亞甲基蘭將最終反應物亞甲基蘭(Methylene blue)置於可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的大小程度，測算出同型半胱氨酸濃度大小測定結果。
2. —種同型半胱氨酸診斷試劑盒，主要成分包括緩衝液 20——500 mmol/L穩定劑 1——50 mmol/L胱硫醚Y合酶 500——20000 U/LN，N-二甲基苯二胺 0.2-20 mmol/L氯化鐵 0.1——8 mmol/L其特徵在於試劑盒可以是千粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、N，N-二甲基苯二胺(N, N-dimethyl-p-phenylenediamine )、 氯化鐵(ferric chloride )、 胱硫醚y合酶 (cystathionine y-synthase EC 2.5.1.48)組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、N,N- 二甲基苯二胺(N， N-dimethyl-p-phenylenediamine )、 氯化鐵 (ferric chloride)、 胱硫醚y合酶 (cystathionine ^synthase EC 2.5.1.48)組成雙劑試劑；試劑1, 由緩衝液、穩定劑、胱硫醚y合酶(cystathionine y-synthase EC 2.5丄48)組成；試劑2，由N，N-二甲基苯二胺(N， N-dimethyl-p陽phenylenediamine )、氯化鐵(ferric chloride)組成。
5. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、N,N- 二甲基苯二胺(N， N-dimethyl-p-phenylenediamine )、 氯化鐵(ferric chloride )、 胱硫醚y合酶 (cystathionine y-synthase EC 2.5.1.48 )組成多齊lj試齊(j;試齊U 1 ， 由緩衝液、穩定劑、胱硫醚y合酶(cystathionine ^-synthase EC 2.5丄48)組成；試劑2，由N，N-二甲基苯二胺(N, N-dimethyl-p-phenylenediamine )組成；試劑3，由緩衝液、氯化鐵(ferric chloride) 組成。
6. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在於還 包括穩定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、N，N-二甲基苯二胺(N，N-dimethyl-p-phenylenediamine)、氯化鐵(ferric chloride)、胱硫醚γ合酶(cystathionine γ-synthase EC2.5.1.48)及穩定劑，這些成分可以配成單劑試劑盒、雙劑試劑盒及三劑試劑盒；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶促反應，再將反應物置於可見光分析儀下，檢測主波長660nm處吸光度上升的大小程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度。採用本發明完全可以通過可見光分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的汙染，便於推廣應用。
文檔編號C12Q1/00GK101097190SQ20061008557
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優先權日2006年6月26日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司