ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的應用的製作方法
2024-01-26 03:32:15 1
專利名稱：ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種ath_eTM160及其在抑制microRNA160功能中的應用。
背景技術：
MicroRNA(miRNA)是一類重要的小分子RNA，它們參與調控植物的生長發育以及脅迫反應等多個途徑。在植物中，miRNA主要通過降解靶基因的方式發揮作用。首先，成熟的miRNA通過鹼基互補匹配的方式與靶基因結合，然後引起結合位置靶基因mRNA的切割(切割主要發生在互補區域的10與11位之間)，進而導致靶基因的降解。最近，有研究者報導了一個IPSl基因，雖然該基因能部分的與miR399序列互補匹配，但在切割位置上IPSl形成3個鹼基的凸起，該凸起使IPSl不能被miR399切割，也就不能被降解。當細胞內高表達IPSl時，其與miR399結合，這導致miR399不能與其靶基因結合，進而使其靶基因不受miR399調控。IPSl被稱為內源的模擬祀基因(endogenous Target Mimic-eTM)。IPSl可以作為抑制miR399的工具，應用於miR399的相關研究。而其它miRNA的內源模擬靶基因未見報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種ath_eTM160及其在抑制microRNA160功能中的應用。本發明提供的DNA分子，為一種內源DNA分子，命名為ath_eTM160，其為如下
(1)-(3)中任——種的DNA分子
(I)序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述嚴格條件可為如下在6父33(，0.5%303的溶液中，在65° C下雜交，然後用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的範圍。上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體中，得到的重組載體。在本發明的實施例中，重組載體為序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸插入pCAMBIA1300的Xba I和Sac I酶切位點間得到的載體擴增上述DNA分子的全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的範圍。上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物中microRNA160表達或其靶基因表達或改變植物葉片形狀中的應用也是本發明保護的範圍；其中，所述microRNA160的核苷酸序列為序列表中的序列5。上述應用中，所述microRNA160的靶基因為ARF10、ARF16和/或ARF17。ARFlO的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；ARF16的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；ARF17的核苷酸序列為序列表中的序列4。上述應用中，所述調控植物中microRNA160表達為抑制植物中microRNA160表達；所述調控植物中microRNA1 60靶基因表達為提高植物中microRNA160靶基因表達；所述改變植物葉片形狀為增強植物葉片邊緣鋸齒化；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物進一步具體為擬南芥。上述抑制植物中microRNA160表達通過提高目的植物中microRNA160表達實現。上述應用為將上述DNA分子導入目的植物，得到轉基因植物；所述轉基因植物具有如下I) -3)中至少一種特徵I)所述轉基因植物中microRNA160表達量低於所述目的植物；2)所述轉基因植物中microRNA160的靶基因ARF10、ARF16和/或ARF17表達量均高於所述目的植物；3)所述轉基因植物葉片邊緣鋸齒化。上述DNA分子通過上述重組載體導入目的植物中。上述應用中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。本發明的實驗證明，本發明在擬南芥中獲得一段DNA分子ath_eTM160，將其轉入擬南芥中過表達，發現其可以抑制擬南芥中microRNA160的表達,且同時提高microRNA160靶基因的表達，也同時呈現葉片鋸齒形加重。因此，該基因可以作為內源工具來調控microRNA160 的功能。
圖I 為 PCR 擴增得到 ath_eTM160圖2為轉基因擬南芥的PCR鑑定圖3為擬南芥ath_eTM160抑制mi croRNA160的功能
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、ath_eTM160基因的獲得I、擬南芥總RNA的提取I) Trizol 法提取(I)取適量野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana,購自ABRC,美國)材料(O. Ig)加入液氮研磨15min，至粉末狀，將粉末倒入2mL離心管(約佔1/2管)，然後立即加入ImLTrizol試劑。將粉末與Trizol試劑混勻,在室溫下孵育5min,以便核酸蛋白複合體完全解離。(2)將離心管於 4°C 12000rpm 離心 15min。(3)將上清液轉移到新的2mL離心管中，並向其中加入等體積O. 5ml氯仿，手動劇烈振蕩管體15s後，室溫靜至3min。
(4)將離心管於 4°C 12000rpm 離心 15min。(5)將上層的水相轉移至新的離心管中，向其中加入等體積的異丙醇以沉澱RNA。混勻後，於一 20°C靜置lOmin。(6)將離心管於 4°C 12000rpm 離心 lOmin。(7)倒掉上清液，加入ImL 75%乙醇清洗RNA沉澱，振蕩後，4 °C 12000rpm離心3min。(8)除去乙醇溶液，在超淨臺吹乾。(9)加入20 μ I不含RNA酶的水溶解沉澱，得到RNA溶液。2) RNA 的純化(除 DNA) (I)將RNA溶液加水至39 μ 1，按下表加入其餘試劑，混勻。
權利要求
1.一種DNA分子，為如下(I)-(3)中任--種的DNA分子 (1)序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
2.含有權利要求I所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將權利要求I所述DNA分子插入表達載體中，得到的重組載體。
4.擴增權利要求I所述DNA分子的全長或其任意片段的引物對。
5.權利要求I所述DNA分子或權利要求2所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物中microRNA160表達或調控植物中microRNA160靶基因表達或改變植物葉片形狀中的應用；所述microRNA160的核苷酸序列為序列表中的序列5。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述microRNA160的靶基因為ARF10、ARF16 和 / 或 ARF17。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特徵在於所述調控植物中microRNA160表達為抑制植物中microRNA160表達；所述調控植物中microRNA160靶基因表達為提高植物中microRNA160靶基因表達；所述改變植物葉片形狀為增強植物葉片邊緣鋸齒化；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物進一步具體為擬南芥。
8.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述應用為將權利要求I所述DNA分子導入目的植物，得到轉基因植物； 所述轉基因植物具有如下I) -3)中至少一種特徵 1)所述轉基因植物中microRNA160表達量低於所述目的植物； 2)所述轉基因植物中microRNA160的靶基因ARF10、ARF16和/或ARF17表達量均高於所述目的植物； 3)所述轉基因植物葉片邊緣鋸齒化。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於權利要求I所述DNA分子通過權利要求2所述重組載體導入目的植物中。
10.如權利要求8或9所述的應用，其特徵在於 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的應用。本發明提供的DNA分子，為如下(1)-(3)中任一一種的DNA分子(1)序列表中的序列1自5′末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。本發明的實驗證明，在擬南芥中獲得一段基因ath-eTM160，將其轉入擬南芥中過表達，發現其可以抑制擬南芥中microRNA160的表達。
文檔編號C12N15/113GK102864146SQ20121034820
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者王秀傑, 王猛, 吳華君, 王志敏 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所