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一種抑制澱粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑及其應用的製作方法

2024-02-02 03:18:15 1


本發明涉及一種雙功能短肽抑制劑(Ac-LVFFARKHH-NH2)及其對Cu2+介導的澱粉樣β蛋白的聚集、氧化自由基粒子產生率和細胞毒性的有效抑制作用,以及其潛在的藥物和保健品開發方面的用途。



背景技術:

阿爾茲海默症(Alzheimer’s Disease,AD)是一種澱粉樣變病,該病症起病隱匿,在進行性發展中造成神經系統的退行性病變,是老年痴呆症最主要的發病形式。AD發病的主要原因之一是澱粉樣β蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的大量產生和聚集形成纖維,在這個過程中富集吸附多種金屬離子,最終形成老年斑(senile plaque,SP),對神經元細胞產生較高的毒害作用。

Aβ是澱粉樣前體蛋白(amyloid-βprecursor protein,APP)經由β和γ分泌酶切割而形成的含有39-43個胺基酸殘基的多肽。Aβ的兩種主要類型為Aβ40和Aβ42,其中Aβ40含量最為豐富。研究表明Aβ單體在水溶液條件下呈現無規則捲曲結構,在聚集形成纖維的過程中首先通過構象轉變形成富含β-摺疊的二級結構,然後通過分子間疏水相互作用、氫鍵、鹽鍵等作用力聚集在一起逐漸形成成熟纖維。在聚集過程中形成的可溶性Aβ寡聚體和原纖維是最具神經毒性的。同時,Aβ還具有絡合金屬離子的能力,在AD患者大腦組織中的老年斑內發現Cu2+、Zn2+、Fe3+、Al3+發生富集,老年斑周圍的腦組織中多種金屬離子濃度升高。其中Aβ-Cu2+絡合體由於能夠促進Aβ聚集和催化產生氧化自由基粒子(radical oxygen species,ROS),因此會造成神經元細胞氧化壓力的增大,導致細胞死亡。

針對Aβ聚集產生有毒聚集體,研究者開發了諸多能夠有效抑制Aβ聚集的抑制劑,如:薑黃素、EGCG、多肽、抗體等以及納米粒子抑制劑。由於Aβ的疏水核心序列對於Aβ的聚集具有重要作用,因此研究者基於此多肽設計開發了一系列具有明顯抑制Aβ聚集效果的多肽抑制劑。但研究表明在體內,Aβ聚集過程中常會伴隨金屬離子的絡合,因此近些年來許多研究者致力於開發雙功能的Aβ聚集抑制分子,使其既能夠螯合金屬離子,又能抑制Aβ聚集。本發明是在先前Aβ聚集抑制短肽LVFFARK的基礎上,通過在其C末端添加能夠絡合Cu2+的螯合片段HH設計成的雙功能短肽抑制劑,可以實現抑制Aβ聚集和鰲合金屬離子雙功能,為開發新型藥物提供新的設計思路。



技術實現要素:

本發明的目的是開發抑制Aβ聚集毒性的新型抑制劑,提出設計合成一種既能夠抑制Aβ40蛋白聚集,降低Aβ40蛋白造成的神經細胞毒性,又能降低Aβ-Cu2+絡合體催化產生ROS速率的一種新的雙功能短肽抑制劑(Ac-LKFFARKHH-NH2),以及其抑制澱粉樣β蛋白聚集和相關細胞毒性方面的應用。

本發明的技術方案如下:

一種抑制澱粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑;其胺基酸序列為:Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His。

本發明的抑制澱粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑抑制Cu2+存在下β-澱粉樣蛋白聚集及其相關細胞毒性的應用。

應用為雙功能短肽與β-澱粉樣蛋白摩爾濃度比優選為1:1。

抑制澱粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑用於阿爾茲海默症藥物和保健品開發方面的用途。

抑制澱粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑用於用於阿爾茲海默症的藥物的原料藥。

本發明設計合成的雙功能短肽抑制劑是基於Aβ的疏水核心序列(KLVFFAE)得到的一個九肽,本身具有抑制Aβ聚集的能力;端基乙醯化和醯胺化之後,具有降低多肽在血漿中的代謝速度和增強穿透血腦屏障的能力;帶正電荷HH的引入,增大了多肽間的排斥力,不利於多肽自身的聚集,同時可以螯合Cu2+,降低由Aβ-Cu2+絡合體催化產生的ROS對細胞的影響。因此使之成為具有前景的治療AD的候選藥物。

本發明的優點:

多種實驗手段證明,雙功能短肽抑制劑與Aβ40蛋白摩爾濃度比在1:1時,就能夠有效地抑制了Aβ40纖維的生成,並且抑制Aβ-Cu2+絡合體催化產生ROS的速率,最終大幅降低了Aβ40的聚集和絡合金屬Cu2+所帶來的細胞毒性作用,是Aβ40聚集和神經細胞氧化壓力的有效抑制劑。

附圖說明

圖1:不同濃度的雙功能短肽抑制劑與Aβ40共培養72h後的ThT螢光強度變化;

圖2:摩爾濃度比為1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和雙功能短肽抑制劑共培養的ThT螢光動力學;

圖3:摩爾濃度比為1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和雙功能短肽抑制劑共培養的培養物形貌(圖3C),其中圖3A為單獨培養Aβ40形成的聚集體的形貌,圖3B為摩爾濃度比為1:0.4的Aβ40和Cu2+共同培養形成的聚集體的形貌。

圖4:雙功能短肽抑制劑對Aβ-Cu2+絡合體催化產生·OH生成速率的影響;

圖5:Aβ40與Cu2+和雙功能短肽抑制劑按摩爾比1:0.4:1共培養24h後培養物對PC-12細胞存活率的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。

我們通過多種物理化學生物的檢測手段證實雙功能短肽抑制劑可以有效抑制Aβ40聚集和抑制Aβ-Cu2+絡合體催化產生ROS的速率,最終降低Aβ40的聚集和絡合金屬Cu2+所帶來的細胞毒性作用。

雙功能短肽抑制劑胺基酸序列:

Ac-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His-NH2

雙功能短肽抑制劑結構式:

實施例1:不同濃度雙功能短肽抑制劑與Aβ40共培養72h後的ThT螢光強度變化

首先將儲存於-80℃冰箱的Aβ40置於室溫下,待其溫度升至室溫,稱取Aβ40粉末以1mg/mL的濃度溶於純六氟異丙醇;將此溶液在-4℃下靜置2h,待其完全溶解後超聲2min以打散Aβ40聚集體;將超聲後的Aβ40溶液於4℃,16000g離心20min,取上清的75%;將取出的75%上清液在-80℃冰箱內凍實4h以上,隨後冷凍乾燥24h,得到預處理好的蓬鬆棉絮狀的Aβ40,置於-20℃下保存。

溶液配製如下:稱取2.2mg Aβ40溶於2mL 20mM NaOH溶液中,配製成終濃度為250μM的Aβ母液,冰浴超聲處理20min,使其完全溶解;稱取8mg的ThT溶於1L HEPES緩衝液(20mM HEPES,NaCl 100mM,pH=7.4)中,使其濃度為25μM;稱取0.47mg的雙功能短肽抑制劑溶於200mL DMSO中,使其濃度為2mM。

利用HEPES緩衝液進行稀釋,使各實驗組均含有Aβ40 25μM,雙功能短肽抑制劑的濃度分別為0μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM。用漩渦混合器混合均勻,將在37℃,150rpm條件下震蕩共培養72h。檢測時用ThT染液將培養液稀釋20倍後,測定ThT螢光強度。以僅含Aβ的樣品為100%,無Aβ與抑制劑的緩衝液為0進行歸一化,繪製ThT螢光強度百分比隨時間的變化曲線,每個實驗點取三次重複實驗的平均值。螢光光度計儀器參數:激發波長440nm(激髮帶寬5nm);發射波長480nm(發射帶寬5nm)。結果如圖1所示。

由圖1可知,加入雙功能短肽抑制劑雙功能短肽抑制劑後Aβ40的ThT螢光強度明顯下降,說明雙功能短肽抑制劑能有效抑制Aβ40的聚集。ThT螢光強度下降程度與雙功能短肽抑制劑的濃度呈正比,說明雙功能短肽抑制劑濃度越高,其抑制Aβ40聚集效果越好。

實施例2:摩爾濃度比為1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和雙功能短肽抑制劑共培養的ThT螢光動力學

按照與實施例1相同的方法處理Aβ40單體和雙功能短肽抑制劑;另稱取CuCl2·2H2O85.25mg溶於去離子水中,配製成10mL 20mM的Cu2+母液,然後用去離子水稀釋成0.5mM的溶液待用;稱取ThT 2mg溶於25mL HEPES緩衝液中,配製成250μM的ThT母液待用。

配製ThT、Aβ40和雙功能短肽抑制劑的終濃度均為25μM,Cu2+濃度為10μM,混合均勻。將樣品加入96孔板中,每孔點加樣品200μL,培養檢測。酶標儀設置參數:溫度37℃,搖動持續時間5s,波幅3mm,頻率452.1rpm;激發波長440nm(激髮帶寬9nm);發射波長480nm(發射帶寬20nm);手動增益值90。實驗結果如圖2所示。

由圖2可知,Cu2+具有促進Aβ40聚集的作用,可以顯著縮短Aβ40的延滯期。在含有Cu2+的Aβ40培養體系中加入雙功能短肽抑制劑後,Aβ40的延滯期有一定的增大,並且ThT螢光強度顯著的下降,說明雙功能短肽抑制劑能夠絡合Cu2+,並且具有抑制Cu2+介導的Aβ40的快速聚集作用。

實施例3:摩爾濃度比為1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和雙功能短肽抑制劑共培養的培養物形貌(圖3C),其中圖3A為單獨培養Aβ40形成的聚集體的形貌,圖3B為摩爾濃度比為1:0.4的Aβ40和Cu2+共同培養形成的聚集體的形貌。

按照與實施例1、2相同的方法處理Aβ40單體Cu2+和雙功能短肽抑制劑,並按照相同的方法進行培養72h。

培養到72h後,取100μL培養液,超聲10min,將5-10μL溶液滴加在300目的碳膜銅網上,自然乾燥。待銅網上的溶液將幹未乾時,滴加1%的磷鎢酸溶液(pH 6.5)染色30s後吸掉多餘液體,自然乾燥。然後用透射電鏡(JEM100CXII)進行觀察,檢測電壓為100kV,選取放大後標尺為200nm的圖像進行觀察,結果如圖3所示。

由圖3可知,Aβ40在單獨培養72h後形成了四五百納米長的纖維聚集體(圖3A);含有Cu2+的Aβ40培養後也能形成纖維,但其長度較Aβ40單獨培養時要短(圖3B);加入雙功能短肽抑制劑雙功能短肽抑制劑後,Aβ40形成了無規則蛋白聚集體(圖3C)。這表明雙功能短肽抑制劑的加入,改變了Aβ40纖維聚集形貌,能夠抑制Aβ40纖維聚集體的形成。

實施例4:雙功能短肽抑制劑對Aβ-Cu2+絡合體催化產生·OH生成速率的影響按照與實施例1、2相同的方法處理Aβ40單體、雙功能短肽抑制劑和Cu2+;另稱取去鐵胺0.33mg,加入到500mL HEPES緩衝液中得到含有1μM去鐵胺的HEPES緩衝液;分別稱取9.5mg 3-OH-CCA和9.9mg L-抗壞血酸,分別加入到10mL含有去鐵胺的HEPES緩衝液中,配製成5mM的3-OH-CCA和L-抗壞血酸母液待用。

檢測時按比例在石英皿中分別加入含有去鐵胺的HEPES緩衝液、Cu2+、Aβ40、雙功能短肽抑制劑和3-OH-CCA,最後加入L-抗壞血酸快速搖勻檢測。體系中Aβ40、雙功能短肽抑制劑的摩爾濃度均為25μM,Cu2+濃度為10μM,3-OH-CCA和L-抗壞血酸濃度為0.5mM。螢光激發波長390nm(激髮帶寬5nm),發射波長447nm(發射帶寬5nm)。螢光強度的變化率表徵·OH的產生速率。實驗結果如圖4所示。

由圖4可知,Aβ-Cu2+絡合體具有催化產生·OH的作用,而加入雙功能短肽抑制劑雙功能短肽抑制劑後·OH產生速率極大的降低,說明雙功能短肽抑制劑可以絡合體Cu2+,極大的抑制Aβ-Cu2+絡合體催化產生·OH的能力。

實施例5:Aβ40與Cu2+和雙功能短肽抑制劑按摩爾比1:0.4:1共培養24h後培養物對PC-12細胞存活率的影響

細胞毒性實驗中使用的細胞為大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞(PC-12)。培養基為DMEM血清培養基(DMEM:FBS:penicillin=89:10:1,v/v/v)。培養環境為5%CO2,37℃恆溫培養。按照與實施例1、2相同的方法處理Aβ40,雙功能短肽抑制劑和Cu2+,實驗組中雙功能短肽抑制劑、Aβ40的終濃度為25μM,Cu2+濃度為10μM。

首先將處於對數期的PC-12細胞稀釋成5000個/mL的密度,按每孔80μL的量加入96孔板中,每個實驗組設置6個復孔作為平行組。培養24h後,加入20μL老化後的Aβ40溶液樣品,使得孔中Aβ40:Cu2+:雙功能短肽抑制劑為1:0.4:1,繼續培養24h。然後在每孔中加入10μL MTT溶液(濃度為5.5mg/mL),繼續培養4h。檢測時,將96孔板以1500rpm的速度離心10min,離心後移除96孔板中溶液,每孔加入100μL的DMSO搖床震蕩10min。待紫色晶體完全溶解後,使用酶標儀在570nm下測定吸光度,計算細胞存活率。以不含細胞的樣品作為空白組(0%);不含Aβ40和抑制劑,僅含有細胞的樣品作為對照組(100%),計算加藥組的細胞存活率。***表示p>0.05。結果如圖5所示。

由圖5可知,Aβ40自聚集會產生細胞毒性,使細胞存活度降低到65%左右,而Aβ-Cu2+絡合體毒性比單獨培養Aβ4時要大,會使細胞存活度降低到50%左右,但是在Aβ-Cu2+絡合體系中加入雙功能短肽抑制劑後,可以顯著提高細胞存活度至90%。該實驗表明Aβ-Cu2+絡合體的毒性不僅來自於Aβ40自聚集產生的毒性,還包括Aβ-Cu2+絡合體催化產生的·OH給細胞帶來的氧化性壓力。雙功能短肽抑制劑不僅可以抑制Aβ40的聚集,還可以絡合Cu2+離子,降低·OH給細胞帶來氧化性壓力,極大的提高細胞的存活度。

本發明提出了雙功能短肽抑制劑與Aβ40蛋白摩爾濃度比在1:1時能夠有效抑制Aβ40蛋白的聚集並絡合Cu2+離子,降低Aβ40聚集和Aβ-Cu2+絡合體催化產生ROS相關的細胞毒性,具備潛在的藥物和保健品開發方面的用途。已通過多項實施例對其抑制Aβ40和Aβ-Cu2+絡合體的聚集、催化產生ROS和細胞毒性的效果進行了描述,相關技術人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合,來實現本發明技術。特別需要指出的是,所有相類似的替代和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的,他們都被視為包括在本發明精神、範圍和內容中。

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