纖維素酶組合物以及單一成分的製備方法

2023-05-08 23:25:06

專利名稱：纖維素酶組合物以及單一成分的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其是纖維素酶組合物以及其中單一成分的製備方法。
背景技術：
纖維素酶為複合酶，廣泛應用於釀酒、食品、詞料、紡織、造紙、製藥、環保、石油開 採等工業。纖維素酶來源非常廣泛，昆蟲、微生物(細菌、放線菌和真菌等)和一些動物都 能產生纖維素酶。真菌和細菌產生的纖維素酶是人們研究的主要對象。在纖維素酶研究領域， 其中幾個著名的菌禾中是7Wc/wJewz" we^z'禾卩CW/w/o/wowas浙77zermo6訴cfo/twc"，其中前 者為真菌，後兩個為放線菌。早期的纖維素酶研究以真菌為主，直到20世紀80年代，放線 菌產生的纖維素酶才開始進入人們的視線。纖維素酶在工業領域中的主要應用方面主要包括: 將纖維素降解成糖類生產生物乙醇，織物處理如"石洗(stone washing)"和"生物拋光 (biopolishing)"，以及用於洗滌劑組合物中。本領域中雖然己經有一些纖維素酶組合物應 用與實際生產中，但目前仍需要具有各種特性範圍的新纖維素酶，它們或者用於洗滌劑組合 物的成分，或者處理紙漿和纖維素乙醇等方面。申請人從鹽環境中分離到的一株耐鹽放線菌， 從其發酵液中已發現的纖維素酶具耐熱和耐鹼性，在以上提到的領域有很大的應用前景。
中國專利申請號200610002014. 2公開了一種"微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法"， 是將產生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化後的纖 維素酶產生菌在10 16'C逐級擴大培養，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基 中，在10 16。C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫纖維素酶結束；發酵液在4，000 8，000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗 酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。中國專利申請 號200510070368.6公開了一種"利用酵母菌生產纖維素酶的方法"，是在培養基中加入酵 母菌種進行培養，然後經離心分離得到的上清液即為酶液，將酶液經沉澱分離可得粗酶，粗 酶分離純化，即得產品纖維素酶。

發明內容
本發明的目的在於提供一種由微生物菌種發酵液產生、分離、純化製備纖維素酶組合物 的方法。
本發明的另一目的在於提供上述纖維素酶組合物中一種單一成分的製備方法。本發明所述的纖維素酶組合物的製備方法由以下步驟組成-
一、 粗酶液的製備將7T mw^訴cfo /w/oto/erara YIM 90462T以體積百分比為5 — 10%的 接種量接入液體種子培養基中，在37 45'C的條件下振蕩培養至指數生長期，將處於指數生 長期的菌液以體積百分比5_10%的接種量轉接於液體發酵培養基中，在37 45'C培養至穩 定期初期，將發酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；
二、 用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6;
三、 濃縮後的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續加硫酸銨至50°/。飽和度， 離心取沉澱，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCI緩衝液中，得到的酶液即纖維素酶組合 物。其酶活可達165.25U/ml.
本發明步驟一所述的T7 enwo6(/^a /^/o,o/erara YIM 90462T是耐鹽高溫雙歧菌(刊登於 rAer附o6訴cfar / fl/Wo/erara sp. nov.， isolated from a salt mine sample, and emended description of the genus ter附o6zy c/a Yang etal./"/J5^/5w/MZcraZ7/o/.2008; 58: 1821-1825)。所述的液體種 子培養基和發酵培養基均可以採用現有培養基，但在液體發酵培養基中應含有質量體積百分 比為0.1—2% (w/v)的AVICEL、質量體積百分比為1一5% (w/v)的NaCl，這樣既可以保 證酶的產生，又能有效地減少發酵過程中的雜菌汙染。
所述的指數生長期為2-3天，所述的穩定期初期為5-7天，當培養至穩定期初期時即為 產酶高峰期。該時期的酶活性為15.1U/ml。
上述步驟一至三所製得的是纖維素酶組合物，其中主要為纖維素酶組分，其中也含有纖 維素酶以外的組分，但並不影響本組分作為纖維素酶組合物的應用。
對本纖維素酶組合物再進行進一步的分離、提純，可以製得其中的一種單一成分—— S'DS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。具體步驟為上述步驟一至三，再加入以下步驟
四、 將步驟三得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液平 衡好的Butyl-Sepharose預裝柱，將透過峰按保留時間的先後分別收集，直至緩衝液流過8-10 個層析柱體積，保留有羧甲基纖維素酶活性的透過峰酶液部分 '
五、 將步驟四得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液平 衡好的pentyl-Sepharose預裝柱，用無硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集所有洗脫峰 組分；
六、 將步驟五得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl緩衝液平衡好的 Q-Sepharose預裝柱，用含NaCl pH8.0的Tris-HCl緩衝液洗脫，首先使洗脫液電導達封 30mS/cm，將洗脫峰按保留時直至緩衝液流過5-10個層析柱體積，然後使洗脫液電導達到
435mS/cm，將洗脫峰按按保留時間的先後分別收集，直至緩衝液流過5-10個層析柱體積，保 留有羧甲基纖維素酶活性的部分，即為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
本發明所製得的纖維素酶組合物的分子量經SDS-PAGE測定，其在40000道爾頓 120000道爾頓之間，最適反應溫度55 70°C，最適反應為pH5.0 pH6.5。本發明提供的由 耐鹽高溫雙歧菌產生的電泳純中溫纖維素酶酶活反應最適溫度55'C，最適反應pH值6.0，而 且在鹼性條件下能保持較高的活力。本發明由耐鹽高溫雙歧菌產生的纖維素酶組合物和電泳 純纖維素酶，可在造紙及飼料工業中將得到廣泛應用，例如去汙劑、紡織物處理或作為一種 動物飼料添加劑。
本發明的優點是所得到纖維素酶在高溫下仍具有較高的酶活力，在造紙，生物轉化行 業有一定的工業應用價值。全部分離純化過程中均用pH8.0的Tris-HCl緩衝液，且全部分離 純化過程簡單易行。
本發明製備的電泳純中溫纖維素酶，具有以下酶學性質:
1、 耐鹽高溫雙歧菌產纖維素酶最適酶活溫度55'C。酶活力達68.5U/ml。
2、 耐鹽高溫雙歧菌產纖維素酶在4 6(TC之間活力較為穩定，55'C保溫5小時，還保持 30% (20.5U/ml)以上的酶活力。溫度超過60'C，酶活力下降很快。在75'C保溫60min會導 致酶活力下降近90%。
3、 耐鹽高溫雙歧菌產纖維素酶最適pH為6.0，酶活力達68.5U/ml。 pH小於4或大於10
酶活力較低。
4、 耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶pH6.0 9.0之間酶活力穩定，在pH6.0 9.0的緩衝液中保 溫過夜，其殘餘酶活力均在80% (54.8U/ml)以上。
5、 Mn2+、 Mg2+、 Al3+、 Pb2+、 C^+和CcP對耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶有激活作用，Li+、、 Mn2+、 Na+、 Ca2+、 Fe2+、 Ba"和Fe"對酶活力沒有明顯的作用作用，Hg2+、 Cu2+、 Zn2+、 Ni2+ 對酶有顯著的抑制作用。
6、 變性劑SDS對耐鹽高溫雙歧菌產纖維素酶有明顯的抑制作用。鰲合劑EDTA和絲氨 酸蛋白酶專一抑制劑苯甲基磺醯氟化物(PMSF)對耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶沒有抑制作用， 表明了耐鹽高溫雙歧菌纖維素酶對金屬離子沒有依賴性且活性中心不含有絲氨酸。


圖1為耐鹽高溫雙歧菌產電泳純中溫纖維素酶的反應溫度和相對活性的關係曲線。 圖2為耐鹽高溫雙歧菌產電泳純中溫纖維素酶的反應pH和相對活性的關係曲線。圖3為耐鹽高溫雙歧菌產纖維素酶組合物的反應溫度和相對活性的關係曲線c 圖4為耐鹽高溫雙歧菌產纖維素酶組合物的反應pH和相對活性的關係曲線。 上述圖2中
醋酸-醋酸鈉緩衝液。
檸檬酸-磷酸二氫鈉緩衝液。 Tris-HCl緩衝液。 甘氨酸--氫氧化鈉緩衝液。
醋酸-醋酸鈉緩衝液。 檸檬酸-磷酸二氫鈉緩衝液。 Tris-HCl緩衝液。 甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液。
表示pH3.0、 3.6、 4.8
■ 表示pH4、 5、 6、 7、 7.6
▲ 表示pH7.5、 8.5 攀表示pH9、 10
上述圖4中
表示pH3.0、 3.6、 4.8
■ 表示pH4、 5、 6、 7、 7.6
▲ 表示pH7.5、 8.5 參表示pH9、 10
具體實施例方式
實施例1、
一、 粗酶液的製備將7Tzmwo&y 必/ a/Wo/era似YIM 90462T以10% (體積百分比)接種 量接入液體種子培養基中，在5(TC的條件下振蕩培養36小時至指數生長期，將處於指數生 長期的菌液以10% (體積百分比)接種量轉接於液體發酵培養基中，在37 45'C培養至5-7 天至穩定期初期即為產酶高峰期，將發酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；
二、 用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6;
三、 濃縮後的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續加硫酸銨至50%飽和度， 離心取沉澱，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液中。
上述得到的液體，經纖維素酶活力測定和SDS-PAGE電泳分析，確定為纖維素酶組合物。
四、 將步驟三得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液平 衡好的Butyl-Sepharose預裝柱，將透過峰按保留時間的先後分別收集，直至緩衝液流過8-10 個層析柱體積，保留有羧甲基纖維素酶活性的透過峰酶液部分；
五、 將步驟四得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液平 衡好的pentyl-Sepharose預裝柱，用無硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩衝液洗脫，收集所有洗脫峰 組分；
六、 將歩驟五得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl緩衝液平衡好的 Q-Sepharose預裝柱，用含NaCl pH 8.0的Tris-HCl緩衝液洗脫，首先使洗脫液電導達到 30mS/cm，將洗脫峰按保留時直至緩衝液流過5-10個層析柱體積，然後使洗脫液電導達到35mS/cm，將洗脫峰按按保留時間的先後分別收集，直至緩衝液流過5-10個層析柱體積，保 留有羧甲基纖維素酶活性的部分，即為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
上述步驟四、六中所涉及的羧甲基纖維素酶活性測定方法參考文獻Methods for Measuring Cellulase Activities. T. M. WOOD et al. METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 160。
經底物特異性試驗分析和SDS-PAGE電泳分析，確定為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
在步驟一中的所述的種子培養基的組成
IOX大量鹽溶液 100ml
50X微量量鹽溶液 20ml
Peptone 5g
加水定容至1L。
上面提到的IOX大量鹽溶液配方為
NaCl 15g (NH4)2S04 31g Na2HP04 91 g 加水定容至1L。
上面提到的50X微量量鹽溶液配方為
EDTA 0.5g
MgS04 2.00g
ZnS04 0.08g
FeS04 0.2g
MnS04 0.15g
CaCl2 0.2g
加水定容至200ml。
在步驟一中的所說的發酵培養基的組成 Peptone 10g Yeast 5g NaCl 10-50g
AVICEL (微晶纖維素sigma公司)l一20g 加水定容至1L。
權利要求
1、一種纖維素酶組合物的製備方法，其特徵在於由以下步驟組成一、粗酶液的製備將Thermobifida halotolerans YIM 90462T以體積百分比為5-10％的接種量接入液體種子培養基中，在37～45℃的條件下振蕩培養至指數生長期，將處於指數生長期的菌液以體積百分比5-10％的接種量轉接於液體發酵培養基中，在37～45℃培養至穩定期初期，將發酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；二、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6；三、濃縮後的酶液加硫酸銨至30％飽和度，離心取上清液，繼續加硫酸銨至50％飽和度，離心取沉澱，溶解在pH8.0、0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液中，得到的酶液為纖維素酶組合物。
2、 一種纖維素酶組合物單一成分的製備方法，其特徵在於由以下步驟組成一、粗酶液的製備將7T^mo&拆^ /w/o/o/erara YIM 90462T以體積百分比5 — 10%的接 種量接入液體種子培養基中，在37 45'C的條件下振蕩培養至指數生長期，將處於指數生長 期的菌液以體積百分比5 — 10%的接種量轉接於液體發酵培養基中，在37 45t:培養至穩定 期初期，將發酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；三、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的l/6;三、 濃縮後的酶液加硫酸銨至30%飽和度，離心取上清液，繼續加硫酸銨至50%飽和度， 離心取沉澱，溶解在pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液中；四、 將步驟三得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液平 衡好的Butyl-Sepharose預裝柱，將透過峰按保留時間的先後分別收集，直至緩衝液流過8-10 個層析柱體積，保留有羧甲基纖維素酶活性的透過峰酶液部分；五、 將步驟四得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0、 0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液平 衡好的pentyl-Sepharose預裝柱，用無硫酸銨pH8.0的Tris-HCl緩衝液洗脫，收集所有洗脫峰 組分；六、 將步驟五得到的酶液離心，取上清液加到pH8.0的Tris-HCl緩衝液平衡好的 Q-Sepharose預裝柱，用含NaCl pH8.0的Tris-HCl緩衝液洗脫，首先使洗脫液電導達到 30mS/cm，將洗脫峰按保留時直至緩衝液流過5-10個層析柱體積，然後使洗脫液電導達到 35mS/cm，將洗脫峰按按保留時間的先後分別收集，直至緩衝液流過5-10個層析柱體積，保 留有羧甲基纖維素酶活性的部分，即為SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。
3、 如權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於在步驟(一)所述的液體發酵培養基 中含有質量體積百分比為0.1—2%的AVICEL，質量體積百分比為l一5。/。的NaCl。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，尤其是纖維素酶組合物以及其中單一成分的製備方法。本纖維素酶組合物的製備方法為一、粗酶液的製備將Thermobifida halotolerans YIM 90462T以體積百分比5-10％的接種量接入液體種子培養基中，振蕩培養，以體積百分比5-10％的轉接於液體發酵培養基中，培養至穩定期初期，將發酵液離心，取上清液，濾紙過濾，得粗酶液；二、用截留分子量為10KDa的超濾膜包將粗酶液的體積濃縮至原來的1/6；三、濃縮後的酶液加硫酸銨至30％飽和度，繼續加硫酸銨至50％飽和度，離心取沉澱，溶解在pH8.0、含有0.3M硫酸銨的Tris-HCl緩衝液中，得到的酶液為纖維素酶組合物。對本纖維素酶組合物再進行進一步的分離、提純，可以製得其中的一種單一成分——SDS-PAGE電泳純中溫纖維素酶。該電泳純纖維素酶的活力為68.5U/ml.本發明的優點是所得到纖維素酶在高溫下仍具有較高的酶活力，在造紙、生物轉化行業有一定的工業應用價值。
文檔編號C12R1/01GK101525608SQ20091009434
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月13日 優先權日2009年4月13日
發明者唐蜀昆, 姜成林, 徐麗華, 李文均, 胡松楠, 趙立興, 魏雲林 申請人:雲南大學