一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物及其製備方法和應用的製作方法

2023-07-08 03:02:31 3

專利名稱：一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物，尤其涉及Arg-Gly-Asp-Phe-Asp肽 鏈與兩條脂肪醇鏈的偶聯物，及其製備方法和應用，屬於生物醫藥領域。
背景技術：
GP II b/IIIa為血小板膜上纖維蛋白原的受體，它在血小板被激活時暴露並呈現 活性，與纖維蛋白特異性結合，導致血小板的聚集和血栓的形成。含Arg-Gly-Asp序列的多 肽，可以佔領血小板表面的GP II b/IIIa受體，因此可以抑制纖維蛋白參與的血小板聚集 和血栓形成。文獻報導Arg-Gly-Asp-Phe多肽具有很好的抗血栓作用。細胞黏附在細胞黏附性疾病(癌轉移、血栓形成、化學致炎和骨質疏鬆)的發展過 程中起關鍵作用。調節性糖蛋白例如Arg-Gly-Asp肽與整合素受體有很強的結合能力，可 參與細胞黏附過程。例如Arg-Gly-Asp肽與血小板、腫瘤細胞及骨基表面的GP Ilb/IIIa 受體特異性結合可幹預血栓、癌轉移和骨質疏鬆的發展過程。Arg-Gly-Asp肽的這種作用賦 予了含Arg-Gly-Asp序列的化合物一種重要性質，即含Arg-Gly-Asp序列的化合物可以向 血栓、癌轉移和骨質疏鬆的患病部位富集。在這樣一個前提下，把Arg-Gly-Asp-Phe肽通過 Asp與高級脂肪鏈偶聯，便可以獲得Arg-Gly-Asp-Phe-Asp與兩條脂肪醇鏈的偶聯物。

發明內容
本發明的目的之一是提供一類具有抗血栓作用的肽鏈與雙脂肪醇疏水臂的偶聯 物。本發明的目的之一是通過以下技術方案實現的一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物，是將一個Arg-Gly-Asp-Phe-Asp肽鏈與兩條脂 肪醇疏水臂偶聯的偶聯物，所述偶聯物的通式為Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2)nCH3]-OCH2 (CH2)nCH3,其中 η = 6，8，10 或 12。本發明的目的之二是提供一種製備上述具有抗血栓活性的肽鏈與雙脂肪醇鏈偶 聯物的方法。本發明的目的之二是通過以下技術方案來實現的一種製備所述肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物的方法，包括如下步驟(1)將N端保護基保護的天冬氨酸與兩個脂肪醇縮合，所述脂肪醇為CH3(CH2) nCH20H, η = 6、8、10、12 ；(2)脫去N端保護基得到雙脂肪醇天冬氨酸酯；(3)按照現有液相合成技術，將雙脂肪醇天冬氨酸酯依次與苯丙氨酸的保護中間 體、天冬氨酸的保護中間體、甘氨酸的保護中間體和精氨酸的保護中間體逐步接肽合成保 護基保護的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯物；(4)依次脫去保護基保護的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯物的C端保護基和N端保護基 得到目標化合物。
其中所述N端保護基是對多肽的N端進行保護時常用的保護基團，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)；所述C端保護基是對多肽的C端進行保護時常用的保護基團，例如可以是 甲氧基(OMe)；所述側鏈保護基是對多肽側鏈進行保護時常用的保護基團，例如可以是苄 氧基(OBzl)、硝基(NO2)；所述液相合成技術及所述保護、縮合、脫保護的過程是本領域的常 規並公知的技術。該製備方法可以用圖1的路線概括，具體的，所述方法包括(1)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將叔丁氧羰基保護的天冬氨酸分別與 CH3 (CH2) 70H、CH3 (CH2) 90H、CH3 (CH2) n0H 以及 CH3 (CH2) 130H 偶聯；(2)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(1)所得的偶聯物，脫去叔丁氧羰基；(3)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下將叔丁氧羰基保護的苯丙氨酸與步驟(2)所 得產物偶聯；(4)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(3)所得的偶聯物，脫去叔丁氧羰基；(5)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將N端叔丁氧羰基、保護側鏈苄氧基保護的天 冬氨酸與步驟(4)所得產物偶聯；(6)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(5)所得的偶聯物，脫去叔丁氧羰基；(7)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將N端叔丁氧羰基保護、側鏈硝基保護的精氨 酸與甲氧基保護的甘氨酸偶聯；(8)在2NNa0H存在下將(7)所得產物脫除C端保護基；(9)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下將(6)與(8)所得產物偶聯；(10)將(9)所得產物脫除保護基得到通式所示化合物。在大鼠血栓形成模型上的評價表明，本發明肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物具有優秀 的口服抗血栓活性，可作為抗血栓劑應用；應用雷射納米力度儀、TEM、SEM檢測了這4種偶 聯物自組裝成為納米結構的性能，試驗結果表明，本發明偶聯物具有優秀的自組裝性能，可 作為製備微乳、脂質體等的製劑材料；因為這4種肽鏈與雙脂肪醇鏈偶聯物的口服抗血栓 活性來自Arg-Gly-Asp肽對GPIIb/IIIa受體特異親和作用，所以這種抗血栓活性又表徵了 4種偶聯物的靶向性，所以本發明偶聯物可作為靶向製劑材料。


圖1為Arg-Gly-Asp-Phe-Asp與雙脂肪醇鏈構建的偶聯物的合成路線。i)DCC/ HOBt/NMM ；ii)HCl/EtOAc ；iii)H2, Pd/C ；9a η = 6,9b η = 8,9c η = 10，9d η = 12。圖2為雷射納米力度儀測定本發明的化合物在水相中的粒徑分布。圖3-圖6分別為由透射電鏡描述的本發明的化合物9a_9d在水相組裝形態。圖7為由掃描電鏡描述的本發明的化合物9a在水相組裝形態。圖8和圖9為由掃描電鏡描述的本發明的化合物9b在水相組裝形態。圖10為由掃描電鏡描述的本發明的化合物9c在水相組裝形態。圖11和圖12為由掃描電鏡描述的本發明的化合物9d在水相組裝形態。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而
4更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例IBoc-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (la)的製備在IOOml茄形瓶中加入2. 33g(0. 01mol)Boc-Asp，用無水THF溶解後，向反應液 中加入2. 97g(0. 022mol)H0Bt以及4. 53g(0. 022mol)DCC,冰浴條件攪拌反應0. 5h後加入
2.86g(0. 022mol)八醇，再用NMM調節pH8_9之間，反應過夜後，TLC顯示Boc-Asp原料點消 失，過濾反應液除去DOT，再將濾液減壓濃縮至幹，用IOOml乙酸乙酯溶解殘留物，過濾再次 除去不溶的DCU，乙酸乙酯層依次用5%碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液、5%硫酸氫鉀 水溶液、飽和氯化鈉水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液各萃洗三遍，分出乙 酸乙酯層用無水Na2SO4過夜乾燥，過濾，濾液減壓濃縮至幹，得4. 52 (收率99% )標題化合 物，類白色固體。ESI-MS(m/z) :480[M+Na]+.實施例2Boc_Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (lb)的製備按照Ia 的操作，以 2. 33g(0. Olmol)Boc-Asp 及 3. 47g(0. 022mol)十醇，製得
5.08g(收率99% )標題化合物，類白色固體。ESI-MS(m/z) :536[M+Na]+.實施例3Boc-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3(lc)的製備按照Ia 的操作，以 2. 33g(0. 01mol)Boc-Asp 及 4. 09g(0. 022mol)十二醇製得 5.63g(收率98%)標題化合物，類白色固體。ESI-MS(m/z) :592[M+Na]+.實施例4Boc_Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (Id)的製備按照la 的操作，以 2.33g(0. Olmol)Boc-Asp 及 4.71g(0.022mol)十四醇，製得
6.19g(收率99% )標題化合物，類白色固體。ESI-MS(m/z) 648[M+Na]+.實施例5Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (2a)的製備用少量乙酸乙酯將Ia 4. 52g(0. 0099mol)溶解，冰浴攪拌下加入4N HCl/乙酸乙 酯溶液混合，TLC顯示原料點消失，溶液用水泵反覆抽乾，除淨氯化氫氣體，得3. 53g(收率 99% )目標化合物。ESI-MS(m/z) :358[M+H]+.實施例6Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (2b)的製備按照2a的操作以5. 08g(0. 0099mol) lb製得4. 13g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :414[M+H]+.實施例7Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (2c)的製備按照2a的操作以5. 63g(0. 0099mol) Ic製得4. 59g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :470[M+H. ]+.實施例8Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (2d)的製備按照2a的操作以6. 19g(0. 0099mol) Id製得5. 15g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :526[M+H]+.實施例9Boc-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (3a)的製備在100ml茄形瓶中加入3. 18g(0. 012mol) Boc-Phe，用無水THF溶解後，向反應液 中加入1. 48g(0. OllmoDHOBt以及2. 26g(0. 011mol)DCC,冰浴條件攪拌反應0. 5h後加入
3.53 (0. 0098mol) 2a (N端應先用無水THF溶解後再用NMM調節pH8_9之間，再加入反應液 中)，反應過夜後，TLC顯示N端原料點消失，過濾反應液除去DCU，再將濾液減壓濃縮至幹，用IOOml乙酸乙酯溶解殘留物，過濾再次除去不溶的DOT，乙酸乙酯層依次用5%碳酸氫鈉 水溶液、飽和氯化鈉水溶液、5%硫酸氫鉀水溶液、飽和氯化鈉水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶 液、飽和氯化鈉水溶液各萃洗三遍，分出乙酸乙酯層用無水Na2SO4過夜乾燥，過濾，濾液減 壓濃縮至幹，得5. 97g (收率99 % )標題化合物，類白色固體。Mp 68. 8-69. 3°C ；=8.04(c=0.8, CHCl3); ESI-MS (m/z) :627[M+Na]+。實施例IOBoc-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (3b)的製備按照3a 的操作以 3. 18g(0. 012mol) Boc-Phe 以及 4. 13g(0. 0098mol)2b 製得 6.41g(收率 99% )標題化合物，類白色固體。Mp 63. 2-65. 1°C;[^°=10.57(c=l ,CHCl3); ESI-MS(m/z) :683[M+Na]+。實施例1 IBoc-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (3c)的製備按照3a 的操作以 3. 18g(0. 012mol) Boc-Phe 及 4. 59g(0. 0098mol)2c 製得 7. 02g(收率 99% )標題化合物，白色粉末。Mp 65. 4-66. 7°C ；[af = 17.07(c=l, CHCl3); ESI-MS(m/z) :739[M+Na]+0實施例12Boc-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (3d)的製備按照3a 的操作以 3. 18g(0. 012mol) Boc-Phe 及 5. 15g(0. 0098mol)2d 製得 7. 58g(收率 99% )標題化合物，白色粉末。Mp 59. 6-62. 2°C ；[a]2D°=9.67(c-l, CHCl3); ESI-MS(m/z) :795[M+Na]+0實施例 13Phe_Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (4a)的製備用少量乙酸乙酯將5. 97 (0. 0098mol) 3a溶解，冰浴攪拌下加入4N HCl/乙酸乙酯 溶液混合，TLC顯示原料點消失，溶液用水泵反覆抽乾，除淨氯化氫氣體，得4. 89收率99%) 目標化合物。ESI-MS (m/z) :505[M+H]+.實施例14Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (4b)的製備按照4a的操作以6. 41g(0. 0098mol)3b製得5. 49g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :561[M+H]+.實施例15Phe_Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (4c)的製備按照4a的操作以7. 02g(0. 0098mol)3c製得6. 04g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :617[M+H]+.實施例16Phe_Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (4d)的製備按照4a的操作以7. 58g(0. 0098mol)3d製得6. 59g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :673[M+H]+.實施例I7Boc-Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (5a)的製備在100ml茄形瓶中加入3. 88g (0. 012mol) Boc-Asp (OBzl)，用無水THF溶解後，向反 應液中加入1. 48g(0. OllmoDHOBt以及2. 26g(0. 01111101)00，冰浴條件攪拌反應0. 5h後加 入4. 89 (0. 0098mol) 4a (N端應先用無水THF溶解後再用NMM調節pH8_9之間，再加入反應 液中)，反應過夜後，TLC顯示N端原料點消失，過濾反應液除去D⑶，再將濾液減壓濃縮至 幹，用100ml乙酸乙酯溶解殘留物，過濾再次除去不溶的DOT，乙酸乙酯層依次用5%碳酸氫 鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液、5%硫酸氫鉀水溶液、飽和氯化鈉水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶 液、飽和氯化鈉水溶液各萃洗三遍，分出乙酸乙酯層用無水Na2SO4過夜乾燥，過濾，濾液減壓濃縮至幹，得7. 85g(收率99% )標題化合物，類白色固體。[°^°=1.80(c=1.2,CHCl3); ESI-MS(m/z) :833[M+Na]+0實施例 18Boc-Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (5b)的製備按照5a 的操作以 3. 88g(0. 012mol) Boc-Asp (OBzl)，以及 5. 49g(0. 0098mol)4b 制 得 8. 47g(收率 99%)標題化合物，類白色固體。[a]2DD=1.53(c=l,CHa3);ESI-MS(m/z) 889[M+Na]+。實施例19Boc_Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (5c)的製備按照5a 的操作以 3. 88g(0. 012mol) Boc-Asp (OBzl)以及 6. 04g(0. 0098mol)4c 制 得9. 03g(收率99% )標題化合物，類白色固體。Mp 70. 0-71. 5°C;[a]^°=2.70(c= I5CHCl3); ESI-MS(m/z) :945[M+Na]+0實施例20Boc-Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (5d)的製備按照5a 的操作以 3. 88g(0. 012mol) Boc-Asp (OBzl)以及 6. 59g(0. 098mol)4d 制 得 9. 57g(收率 99% )標題化合物，白色固體。Mp 80. 5-81. 9°C ；[a]^0=9.10(c=l,CHCl3)； ESI-MS(m/z) :1001[M+Na]+o實施例2IAsp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (6a)的製備用少量乙酸乙酯將7.85(0.0098mOl)5a溶解，冰浴攪拌下加入4N HCl/乙酸乙 酯溶液混合，TLC顯示原料點消失，溶液用水泵反覆抽乾，除淨氯化氫氣體，得6. 88g(收率 99% )目標化合物。ESI-MS(m/z) :711[Μ+Η]+·實施例22Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (6b)的製備按照5a的操作以8. 47g(0. 0098mol)5b製得7. 50g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :767[M+H]+.實施例 23Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (6c)的製備按照5a的操作以9. 03g(0. 0098mol)5c製得8. 05g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :823[M+H]+.實施例24Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (6d)的製備按照5a的操作以9. 47g(0. 0098mol)5d製得8. 59g(收率99 % )目標化合物。 ESI-MS (m/z) :879[M+H]+.實施例25Boc_Arg (NO2) -Gly-OMe 的製備在IOOml 茄形瓶中加入 3. 19g(0. Olmo)Boc-Arg(NO2)，用約 50ml 無水 THF 溶成均 一態後，向反應液中加入1. 48g(0. OllmoDHOBt以及2. 26g(0. 011mol)DCC，冰浴條件攪拌 反應Ih後加入Gly-OMe 1. 38g(0. Ollmol)，再用NMM調節pH8_9之間，反應過夜後，TLC顯 示Boc-Arg(NO2)原料點消失，過濾反應液除去DOT，再將濾液減壓濃縮至幹，用IOOml乙酸 乙酯溶解殘留物，過濾再次除去不溶的DCU，乙酸乙酯層依次用5%碳酸氫鈉水溶液、飽和 氯化鈉水溶液、5%硫酸氫鉀水溶液、飽和氯化鈉水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉 水溶液各萃洗三遍，分出乙酸乙酯層用無水Na2SO4過夜乾燥，過濾，濾液減壓濃縮至幹，得 3. 51g(收率90%)標題化合物，淺黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :467[M+H]+.實施例26Boc_Arg (NO2) -Gly 的製備在IOOml 茄形瓶中，用 20. OmlMeOH 將 3. 51g(0. 009mol)Boc-Arg(NO2) -Gly-OMe 完全溶解，冰浴條件下加入NaOH (2N)溶液，調節pH12，保持冰浴條件不變，2h後TLC (氯仿/ 甲醇/冰醋酸，5 1 0.1)顯示原料點完全消失，用飽和硫酸氫鉀水溶液調pH至7，減壓 濃縮除去溶劑，加入IOmlH2O,用飽和硫酸氫鉀水溶液在冰浴攪拌條件下調pH至2，溶液用 乙酸乙酯萃取三次(50ml X 3)，再用飽和NaCl洗滌酯層至中性。用無水Na2SO4乾燥過夜， 過濾，濾液減壓濃縮至幹，然後用200-300目矽膠柱層析分離，得2. 37g(收率70%)標題化 合物，白色固體。[α]芸=-8.37(c=l，CH3OH); ESI—MS(m/z) :375[Μ_Η]+·實施例27Boc-Arg (NO2)-Gly-Asp (OBzl-Phe-Asp [-OCH2 (CH2)6CH3]-OCH2 (CH2)6CH3 (7a)的制 備在IOOml 茄形瓶中加入 4. 51g(0. 012mol)Boc-Arg(NO2)-Gly，用無水 THF 溶解後， 向反應液中加入1. 62g(0. OllmoDHOBt以及2. 472g(0. 0011mol)DCC,冰浴條件攪拌反應 0. 5h後加入6a (N端應先用無水THF溶解後再用NMM調節pH8_9之間，再加入反應液中)， 反應過夜後，TLC顯示N端原料點消失，過濾反應液除去DCU，再將濾液減壓濃縮至幹，用 IOOml乙酸乙酯溶解殘留物，過濾再次除去不溶的D⑶，乙酸乙酯層依次用5%碳酸氫鈉水 溶液、飽和氯化鈉水溶液、5%硫酸氫鉀水溶液、飽和氯化鈉水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、 飽和氯化鈉水溶液各萃洗三遍，分出乙酸乙酯層用無水Na2SO4過夜乾燥，過濾，濾液減壓濃 縮至幹。用200-300目矽膠柱層析分離，得5. 44g(收率50%)標題化合物，白色固體。Mp 139. 8-141. 40C ；[a]2D°=-l 1.17(c=1.7, CH3OH);ESI-MS (m/z) :1091 [M+Na] +。實施例28Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (7b)的制 備按照7a 的操作以 4. 51g(0. 012mol)Boc-Arg(NO2)-Gly,以及 6b 製得 5. 61g(收 率 50% )標題化合物，類白色固體。Mp 146. 6-149. 3 0C ； [^0=-18.90(c=l, CH3OH); ESI-MS(m/z) 1147[M+Na]+ο實施例29Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (7c)的 製備按照7a的操作以4. 51g(0. 012mol)Boc-Arg(NO2)-Gly以及6c製得目標化合物 粗品後，用200-300目矽膠柱層析分離，得5. 30g(收率45% )標題化合物，白色固體。Mp: 146. 7-148. 50C ;[a]2D°=-19.07(c=l, CH3OH); ESI-MS (m/z) 1203 [M+Na]實施例30Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (7d)的 製備按照7a 的操作以 4. 51g(0. 012mol)Boc-Arg(NO2) -Gly 以及 6d 8. 59g(0. 0098mol) 製得目標化合物粗品後，用200-300目矽膠柱層析分離，得5. 56g(收率45%)標題化合物， 白色固體。Mp 148. 5-150. 2°C ； [af° =-17.3 3 (c= 1, CH3OH) ； ESI -MS (m/z) 1259 [M+Na]實施例3IBoc-Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (8a)的製備將7a 0. 20g用甲醇溶解，加入Pd/C適量(10% )，反應體系保持密閉，通入氫氣反覆置換反應體系中的空氣，保持氫氣室溫攪拌。反應不再吸氫後TLC檢測反應進程。反 應完畢後，常壓過濾去除Pd/C，濾液旋幹溶劑後用乙醚反覆研磨得標題化合物0. 17g(收率 95%)。ESI-MS(m/z) :934[M+H]+.實施例32Boc-Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (8b)的製備按照8a的操作以7b 0. 20g製得標題化合物0. 17g(收率95% )0 ESI-MS(m/z) 990 [M+H] +·實施例33Boc-Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (8c)的製備按照8a的操作以0. 20g 7c製得標題化合物0. 17g(收率95% )0 ESI-MS(m/z) 1046 [M+H]+.實施例34Boc-Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (8d)的製備按照8a的操作以0. 20g 7d製得標題化合物0. 17g(收率95% )0 ESI-MS(m/z) 1102 [M+H] +·實施例35Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (9a)的製備用少量乙酸乙酯將0. 17g(0.00017mOl)8a溶解，冰浴攪拌下加入4N HCl/乙酸 乙酯溶液混合，TLC顯示原料點消失，溶液用水泵反覆抽乾，除淨氯化氫氣體，得0. 15g(收 率 99 % )目標化合物。Mp 135. 8-137. 1 ； [a]^°=-5.64(c=1.4, CH3OH); ESI-MS (m/z) 834[M+H]+。實施例36Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (9b)的製備按照9a的操作以0. 17g(0. 00017mol)8b製得0. 15g(收率99%)目標化合物。Mp 187. 4-188. 7°C ；[a]^°=-14.33(c=l, CH3OH); ESI-MS(m/z) :890[M+H]+。實施例37Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (9c)的製備按照9a的操作以0. 17g(0. 00016mol)8c製得0. 15g(收率99%)目標化合物。Mp 189. 9-192. 0°C ;[af° =-15.77(c= 1, CH3OH); ESI-MS(m/z) :946[Μ+Η]+。實施例38Arg-Gly-Asp-Phe-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (9d)的製備按照9a的操作以0. 17g(0. 00015mol)8d製得0. 15g(收率99%)目標化合物。Mp 189. 7-191. 6°C ；[a]^°=-10.37(c=l, CH3OH); ESI-MS (m/z) 1002 [M+H]試驗例1本發明化合物口服給藥的抗血栓活性試驗1)大鼠手術與器械Wistar大鼠(雄性，190 210g)按Inmol · kg—1劑量分別口服本發明化合物， 30min後按UOOmg-kg—1劑量腹腔注射烏拉坦溶液進行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右 頸總動脈，於近心端夾動脈夾，近心端和遠心端分別穿入手術線，將遠心端的手術線於皮毛 用止血鉗夾緊，準備在遠心端插管。2)插管插管為矽烷化過的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長60. Omm,內徑 3. 5mm ；兩端為相同的聚乙烯管，管長100. Omm,內徑1. Omm，外徑2. Omm該管的一端拉成尖管 (用於插入大鼠頸動脈或靜脈)，外徑為1. Omm0將編好號的乾淨青黴素小瓶中分別裝入6cm 長的黑色手術線，稱重；然後取出絲線，按照編號放入準備好的插管的中段較粗的插管中。打開大鼠右側動脈夾，用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液 (50IU · kg—1)，然後將插管的動脈端插入大鼠右側頸總動脈，將計算量的肝素緩緩注入大鼠
9體內。3)給藥溶液藥品分別按Inmol · kg—1劑量配置本發明化合物生理鹽水溶液，供口服給藥。4)血栓稱重計時開始15分鐘後，剪斷動靜脈插管，停止循環，用眼科鑷小心取出絲線，在濾紙 上輕輕蘸掉血滴，放入事先稱重好的青黴素小瓶中，精確稱重並記錄。計算出血栓的溼重。 每個藥品重複10次給藥。統計各組的血栓溼重(X ± SD),並做t檢驗。5)結果經口服給藥，本發明的化合物都具有很好的抗栓活性。結果列入表1。表1. 口服體內抗血栓活性評價結果 η = 10 ；NS 0. 9%生理鹽水;a 與 NS 相比，P < 0. 01。試驗例2本發明的化合物在水相中自組裝的粒徑表徵試驗本發明的4種偶聯物按照10_3mol/L的濃度配置成為水溶液，在納米粒度及Zeta 電位測定儀(NanO-ZS90，英國馬爾文Zeta納米系列)連續測定8天，觀察粒徑變化，結果見 表2。得到的數據表明，這4種化合物的粒徑均在196士40nm到255士78nm之間，且八天都 能穩定存在(如圖2所示)。因而是優秀的微乳和脂質體藥物的製備材料。表2.本發明化合物粒徑及Zeta
-11.3試驗例3本發明的化合物在水相中自組裝的TEM表徵按照TEM的測定要求，將化合物溶於蒸餾水中配製成濃度為10_3mol/L的溶液，滴 在特製200目銅網上，室溫自然揮幹，在透射電子顯微鏡(TEM)下觀察其形態及粒徑，並用 照片記錄。結果可得隨著脂肪鏈鏈長的增加，化合物可能有聚集的趨勢。9a、9b、9c、9d隨著 脂肪鏈碳數的增加，TEM結果開始變得密集(圖3-圖6)。試驗例4本發明的化合物在水相中自組裝的SEM表徵按照SEM的測定要求，將化合物溶於蒸餾水中配製成濃度為10_3mol/L的溶液，凍 幹成粉。在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察其形態，並用照片記錄。由圖片可知從9a到9d 隨著碳鏈的增加，纖維管呈網狀相連。隨著碳鏈的增長，納米結構開始變得密集，可能有聚 集趨勢(圖7-圖12)。
權利要求
一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物，是Arg Gly Asp Phe Asp肽鏈與兩條脂肪醇鏈的偶聯物，所述偶聯物的通式為Arg Gly Asp Phe Asp[ OCH2(CH2)nCH3] OCH2(CH2)nCH3，其中n＝6，8，10或12。
2.一種製備權利要求1所述的肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物的方法，其步驟包括(1)將N端保護基保護的天冬氨酸與兩個脂肪醇縮合，所述脂肪醇為CH3(CH2)nCH2OHj =6、8、10、12 ；(2)脫去N端保護基得到雙脂肪醇天冬氨酸酯；(3)按照現有液相合成技術，將雙脂肪醇天冬氨酸酯依次與苯丙氨酸的保護中間體、天 冬氨酸的保護中間體、甘氨酸的保護中間體和精氨酸的保護中間體逐步接肽合成保護基保 護的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯物；(4)依次脫去保護基保護的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯物的C端保護基和N端保護基得到 目標化合物。
3.根據權利要求2所述的肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物的製備方法，其步驟為(1)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將叔丁氧羰基保護的天冬氨酸分別與CH3(CH2) 70H、 CH3 (CH2) 90H、CH3 (CH2) n0H 以及 CH3 (CH2) 130H 偶聯；(2)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(1)所得的偶聯物，脫去叔丁氧羰基；(3)在DCC、HOBt,NMM和THF存在下將叔丁氧羰基保護的苯丙氨酸與步驟(2)所得產 物偶聯；(4)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(3)所得的偶聯物，脫去叔丁氧羰基；(5)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將N端叔丁氧羰基保護、側鏈苄氧基保護的天冬氨 酸與步驟(4)所得產物偶聯；(6)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(5)所得的偶聯物，脫去叔丁氧羰基；(7)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將N端叔丁氧羰基保護、側鏈硝基保護的精氨酸與 甲氧基保護的甘氨酸偶聯；(8)在2NNa0H存在下將(7)所得產物脫除C端保護基；(9)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下將(6)與(8)所得產物偶聯；(10)將(9)所得產物脫除保護基得到通式所示化合物。
4.權利要求1所述的肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物在製備抗血栓藥物中的用途。
5.權利要求1所述的肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物在製備微乳或脂質體藥物載體的用途。
全文摘要
本發明公開了一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯物及其製備方法和應用，是將一條Arg-Gly-Asp-Phe-Asp肽鏈與兩條脂肪醇鏈偶聯，所得偶聯物的通式為Arg-Gly-Asp-Phe-Asp[-OCH2(CH2)nCH3]-OCH2(CH2)nCH3。其中n＝6，8，10或12。本發明的偶聯物除具有優秀口服抗血栓活性外，還具有優秀的自組裝性能，可作為製備微乳、脂質體等藥物載體的製劑材料。
文檔編號A61K9/107GK101906141SQ20091008515
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月2日 優先權日2009年6月2日
發明者張慧敏, 彭師奇, 趙明 申請人:首都醫科大學