一種基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法
2023-12-02 07:24:41 2
專利名稱：一種基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及基因序列特定位點的檢測，特別涉及一種基於 固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法。
背景技術：
基因突變是指基因組DNA分子也就是脫氧核糖核酸序列產生了鹼基對組成或者 排列順序的改變，包括鹼基替換、缺失、插入、重複等。基因突變不僅僅是遺傳病產生的原 因，同時也是癌症發生、細菌病毒耐藥性產生等的重要原因。而單核苷酸多態性(SNP)是 指在基因組上單個核苷酸的變異，形成的遺傳標記，也是基因突變在各物種的遺傳累積。以 SNP為主的遺傳突變檢測不僅僅對臨床某些疾病的早期快速診斷，同時對於避免藥物耐藥 性產生、指導合理用藥、預警疾病發生具有重要的導向意義。目前檢測基因突變的方法有很多。金標準仍然是基因測序的方法，同時還有焦磷 酸測序、核酸雜交、等位基因特異性擴增、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、多聚酶鏈限 制性多態性長度分析(PCR-RFLP)、多聚酶鏈單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)、反向斑點雜 交法等許多針對已知或者位置的單核苷酸突變檢測。雖然這些方法能夠檢測到基因突變， 但是均面臨的問題就是除引物、探針設計複雜外，同時需要具備昂貴的螢光檢測用儀器，即 使是金標準一基因測序的方法最直接有效，但周期過長。另外目前最容易推廣的反向斑 點雜交方法及延伸出來的技術一樣面臨雜交環境嚴格、準確率低、反應時間長、肉眼難以判 讀等問題。這些方法對於醫療系統和早期科研開發均難以普及應用。基因晶片是近年出現的快速、高通量的檢測工具，它是結合測序原理，通過在固相 載體上固定具有針對性的核酸探針或蛋白質，對被檢測組分進行雜交結合，最後引入發光 信號(如螢光、生物素、放射性同位素)進行分析檢測，從而達到樣品分析的目的。但是，目 前的核酸雜交晶片配備設備複雜、昂貴，同時假陰性、假陽性率也同時存在，尤其對於核酸 分子的基因晶片，其質量控制更加難以掌握。固相PCR技術是利用PCR原理，在固相載體上如毛細管、矽膠片、磁珠、玻璃片上等 固定修飾的特異性引物進行PCR反應，其特點是反應簡單，準確性高。但就實際操作而言， 對於引物修飾及固定需要較為複雜的化學處理，如在矽膠片或毛細管上不僅需要對載體表 面處理，同時需要對探針或引物進行修飾，以及同固相載體的配套的PCR儀器並不能推廣 應用，這樣不僅使得製作程序複雜，同時引起實驗重複性降低，導致常規固相PCR只能在實 驗室環境下完成科研工作。
發明內容
本發明解決的技術問題在於提供一種基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測 方法，以檢測基因序列特定位點的多態性，而且肉眼就可直接判斷檢測結果。本發明是通過以下技術方案來實現1)針對目的基因的待測區域設計併合成PCR擴增引物對，在擴增引物的5、端增加生物素標記；提取包含目的基因的基因組DNA，以基因組DNA為模板，以生物素標記的擴增 引物對進行多個循環的PCR擴增，得到PCR擴增產物；2)針對目的基因待測區域的突變多態性，設計併合成多個長度為15 25nt的檢 測探針，檢測探針上針對檢測突變多態性的位點設置在探針5、端5nt之後；並在檢測探針
端進行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；3)對固相載體的表面進行修飾後，將檢測探針和對照探針呈矩陣分布的固定在固 相載體上，得到固定有檢測探針和對照探針的檢測陣列；4)將PCR擴增產物進行變性處理後，置於包含DNA聚合酶和反應底物的PCR反應 液中，然後再加入檢測陣列，進行固相核酸擴增反應；其反應程序為A 在不低於探針Tm值 5°C的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環數至少大於1 ；最後72°C延伸至 少 3min ；5)固相核酸擴增完成後，取出檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸 的結合，用含親和素-鹼性磷酸酶的反應液覆蓋檢測陣列並進行孵育，再次洗脫後用ddH20 衝洗，最後覆蓋包含NBT和BCIP的顯色液進行顯色，直至看到顯色斑點後用ddH20終止反 應；6)顯色斑點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域相匹配，未顯 色斑點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域不相匹配；根據設計的檢測 探針及其陣列上的檢測位點設計情況，對待測區域的突變多態性進行判讀。所述的以基因組DNA為模板的PCR擴增，擴增循環數為25 40，所擴增的片段長 度不超過lOOObp。所述的檢測探針包括多個針對檢測突變多態性的位點，同一陣列上分布的探針的 Tm值相差不超過2°C。所述的進行減少空間位阻的序列延長修飾是在檢測探針5、端進行p0lyT、p0lyC、 polyT+polyC或spacer 6 15C序列的延長修飾；所述的固相載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，檢測探針5、端的輔助固定修 飾為在檢測探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。所述的固相載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，檢測探針5、端的輔助固定修 飾為在檢測探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。所述的固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜，將硝酸纖維素膜或尼龍膜在SSC溶液 中浸泡30 60min後在35 40°C條件下乾燥，然後再將檢測探針和對照探針均勻噴塗在 硝酸纖維素膜或尼龍膜上，經50 80°C乾燥30 120min，紫外光照1 IOmin後，得到固 定有檢測探針和對照探針的硝酸纖維素或尼龍膜的檢測陣列。所述的對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，其所設計的序列均與待檢測 的序列無互補性，陽性對照探針的5、端還被生物素標記。所述的檢測陣列在使用前還在體積濃度為2% 5%的BSA中37°C封閉至少 15min。所述的變性處理為熱變性處理95 °C以上至少放置5min，再在0 °C至少放置 3min ；或者，所述的變性處理為鹼變性處理將質量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴增產物按照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。所述的進行固相核酸擴增反應，其反應體系為40 200 μ 1，包括變性處理後的 PCR擴增產物，含DNA聚合酶、反應底物和Mg2+的PCR反應液，以及ddH20 ；加入的檢測陣列 浸沒於反應體系內。所述的固相核酸擴增反應完成後，取出檢測陣列首先放入洗脫液A中，轉速至少 30rpm離心洗脫至少Imin ；然後將檢測陣列覆蓋親和素反應液後37°C孵育至少IOmin後， 再依次放入洗脫液A、洗脫液B中，轉速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出檢測陣列用 ddH20衝洗，最後覆蓋顯色液進行顯色，至看到顯色斑點後終止反應；所述的洗脫液A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；所述的親和素反應液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-鹼性磷酸酶液；顯色反應 液組成為ImL顯色緩衝液、6. 5 μ INBT合3. 5 μ 1 BCIP0與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果1、本發明提供的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，是將檢測探針固 定在檢測陣列上，與PCR擴增的待測基因片段進行雜交，當擴增的片段被檢測探針識別後， 能夠進行序列的延長(固相核酸擴增)，使得被生物素標記的擴增片段固定在膜陣列上而 不被洗脫，而不能被探針識別的序列，就不能進行序列的延長，不能通過檢測探針被固定， 進而被洗脫掉；這樣通過設計多個檢測探針呈矩陣式的分布，通過一次就可以檢測出待檢 測基因位點的突變性質。該方法是以基因晶片為基礎、PCR反應技術為原理的高通量、高特異性、快速、並且 易於推廣的檢測方法，通過在以硝酸纖維素膜為代表的固相介質上進行特異性探針引發的 核酸擴增反應，結合反向斑點雜交技術，將攜帶生物素標記的靶序列與膜陣列上探針結合 後，通過生物素-親和素-鹼性磷酸酶-BCIP/NBT反應，可以觀察到明顯藍紫色斑點，從而 進行肉眼判讀。2、本發明提供的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，檢測準確性高 包括通過特異性的探針設計、利用已經成熟PCR技術的退火溫度以阻止非特異的結合、以 及利用Taq酶5:3、外切酶活性阻止錯配之後的延伸，完全可以達到對核酸序列單鹼基差 異的良好分辨力，保障了檢測的準確性；並且對實驗室及儀器設備的要求不高在普通實 驗室PCR儀上即可完成整體實驗，無需特殊和昂貴設備；操作簡單主要操作以PCR技術為 核心，常規操作，成本低廉，易於推廣；同時解決了現有方法的檢測速度慢、解析度不高、配 套儀器昂貴、檢測過程複雜等技術問題。3、本發明提供的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，可以在基因分 型、耐藥突變檢測、SNP位點篩查等基於核酸突變的領域具有廣泛應用。尤其是對各種耐藥 病毒、細菌以及基因分型或感染初期檢查具有重要的檢測意義，進而為臨床早期診斷、早期 治療及指導用藥提供參考依據和準確導向。
圖1為擴增片段與固定在固相載體上的檢測探針結合、延伸、顯色的程序示意圖；其中①為硝酸纖維素膜，②為5、端延長修飾的Cltl鏈，③為檢測探針，④為擴增片段靶序列 互補區，⑤為Taq酶，⑥為生物素標記，⑦為親和素-鹼性磷酸酶，⑧為BCIP/NBT顯色；圖2為B型肝炎病毒分型檢測用檢測探針和對照探針的分布示意圖；其中①為陽 性對照探針，②為陰性對照探針，③ ⑥分別為HBV的A型、B型、C型、D型的檢測探針；圖3為B型肝炎病毒分型檢測的顯色結果圖；圖3a 圖3d分別為檢測出的HBV 的A型、B型、C型、D型的顯色結果圖。
具體實施例方式下面結合具體的檢測片段的擴增和檢測探針的設計，檢測探針與固相載體的固 定，檢測探針與擴增片段在固相載體上雜交、擴增，以及在B型肝炎病毒分型檢測中的應 用，對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。參見圖1，基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，是將檢測探針固定在檢 測陣列上，與PCR擴增的待測基因片段進行雜交，，當擴增的片段被檢測探針識別後，能夠 進行序列的延長(固相核酸擴增)，使得被生物素標記的擴增片段固定在基膜上而不被洗 脫，而不能被探針識別的序列，就不能進行序列的延長，不能通過檢測探針被固定，進而被 洗脫掉；這樣通過設計多個檢測探針呈矩陣式的分布，通過一次就可以檢測出待檢測基因 位點的突變性質。所針對的目的基因的獲取一般採用檢測片段一般為已知的序列，其擴增採用通常 的PCR體外擴增，要求循環數25 40，擴增片段的長度建議不超過lOOObp，而擴增引物對 上親和素的標記既可以在正向引物也可以在反向引物上，具有由待測的突變位點在擴增片 段的位置關係來決定。檢測探針的長度設計為15 25nt，檢測探針上針對檢測突變多態性的位點設置 在5、端5nt之後，根據目的基因的待測區域的突變多態性，設計一系列(多個)探針呈矩 陣分布在固相載體上，具有高通量的檢測效果；而根據具體檢測的目的，檢測探針可以設計 成要求與檢測位點的匹配或不匹配，相應的結果為顯色或不顯色。而針對目的基因的待測 區域的突變連鎖情況，檢測探針上相應的設計多個檢測位點。對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，陰性對照探針和陽性對照探針的序 列設計可以相同或不相同，原則是其序列不能與擴增片段有交叉互補性。陽性對照探針的
端被生物素標記，能夠被顯色，用以監測顯色系統是否正常；陰性對照探針用以監測雜 交和固相核酸擴增的特異性。檢測探針5、端的修飾包括減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾； 其中減少空間位阻的序列延長修飾是出於減少核酸擴增錯配和擴增後的序列與固相載體 的附著、顯色的考慮，包括polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6 15C等多種序列的延 長修飾。端的輔助固定修飾一般與固相載體結合考慮，固相載體可以為硝酸纖維素膜、 尼龍膜或者載玻片，通過在檢測探針的5、端添加氨基、巰基、羥基或醛基的輔助固定修飾 與其固定，為了檢測探針更好的固定和將來的顯色效果，固相載體可以進行多種表面修飾。比如，以硝酸纖維素膜為固相載體，通過在SSC溶液中浸泡再烘乾之後，可以使得 顯色斑點不擴散；通過檢測探針5、端的羥基，經紫外光照後與硝酸纖維素膜固定。
固相核酸擴增即檢測探針與目的基因片段在固相載體上雜交、擴增，是探針特異 性識別的核心，其中，擴增體系採用常規的PCR反應液，其獨特之處就在於以包含檢測位點 的檢測探針作為引物，能夠與目的基因互補雜交並進行核酸擴增，且通過檢測探針被固定 在固相載體上不被洗脫；同時，為了保證雜交的特異性，退火溫度一般設置在不低於探針 Tm值的5°C範圍內。洗脫過程是為了將未與固相載體結合的擴增片段洗脫掉，洗脫液可以為一般常用 的緩衝液，結合離心洗脫效果比較好。顯色通過親和素-鹼性磷酸酶液+NBT/BCIP的顯示方式，其優勢在於底色不明顯， 反應精確，結果容易判定，效果比較好；而且實現方便，親和素-鹼性磷酸酶液和NBT/BCIP 顯色液均可採用現有的試劑盒。實施例1基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，對B肝病毒進行基因分 型檢測，具體操作為1)檢測用擴增產物的製備利用ClustalX和Bioedit軟體進行對已報導的B肝病毒HBV 8個型的47個序列 進行多重比對，找出S區和PreS2區的型內保守序列作為待測目的片段，依此設計PCR擴增 引物對，並對反向擴增引物的5、端增加生物素(Biotin)標記，所設計的引物對P具體為正向弓丨物:tacacagacg ccgcaaata19 ；反向弓丨物Biotin_ccttgataat ccagaagaac c 21 ；從B肝患者血清中利用病毒提取試劑盒提取出B肝病毒HBV的基因組DNA，以基 因組DNA為模板，以引物對P為引物進行30個循環的PCR擴增，能夠獲得長度為630bp的 擴增片段。2)檢測探針的設計與合成根據中國人群感染實際情況，設計並人工合成了B肝病毒HBV的A、B、C、D四型 探針，探針Tm值設計為59士 1°C，探針長度為16 2^t，同時在探針序列端進行加上 PolyT(T10)、PolyC(C10)的序列延長修飾，進行減少空間位阻的延長修飾是為了利於靶序列 與固定在基膜上的探針進行結合，具體的檢測探針序列如下探針1:Ci。T10_-ccttgataat ccagaagaacC21
探針2:Ci。T10_-tccaggatca acaacaaccagt22
探針3:Ci。T10_-tgactggaga tttgggact19
探針4:Ci。T10_-cagcaggatg cagaggaa18
探針5:Ci。T10_-ggtagttgat gttcctggaag21
探針6:Ci。T10_-ccataggaat cttgcgaaag20
探針7:Ci。T10_-atgttcagcg cagggt16
探針8:Ci。T10_-ttccttggag atacatagggagga24其中，探針序列當中的劃線位點為針對HBV基因突變產生的多態性的識別位點。 探針1 2為針對HBV的A型設計的探針，探針3 4為針對HBV的B型設計的探針，探針 5 6為針對HBV的C型設計的探針，探針7 8為針對HBV的D型設計的探針；探針上檢 測多態性的位點設置均在探針5、端5nt之後。3)檢測探針在檢測陣列上的固定
將硝酸纖維素膜在2 X SSC溶液(檸檬酸三鈉15mM，氯化鈉150mM，pH7. 0)中浸泡 30min後取出，在37°C孵箱內烘乾2小時，再將檢測探針和對照探針用點膜儀噴塗至膜上(1 滴500nl，間隔1mm，呈矩陣分布，具體分布如圖2所示)，裁減至4mmX6mm大小，將點完探針 的硝酸纖維素膜放入80°C烘箱烘乾30分鐘，2Mnm波長紫外光照6分鐘，通過紫外光照將 探針與硝酸纖維素膜固定連接，得到固定有檢測探針和對照探針的檢測陣列。在乾燥條件 下，檢測陣列可長期儲備待用，使用前將該膜浸入2% BSA液37°C封閉15min。4)固相核酸擴增反應首先對第一步獲得的基因擴增產物進行序號標記，然後對擴增產物進行熱變性處 理95°C水浴5min，然後冰上放置^iin ；再將變性後的擴增產物10 μ 1、PCR反應液(欣百 諾公司，TagMixMaster) 20 μ 1、ddH20 10 μ 1放入乾淨的PCR反應管中混勻，將製備好的檢 測陣列放入，檢測陣列的膜背面靠管壁，進行固相核酸擴增反應；設計反應程序A :57°C退 火30s ；B :72°C延伸30s ；A-B循環數為1 ；最後72°C延伸3min。5)洗脫與顯色固相PCR反應完成後，取出檢測陣列進行洗脫，將未與檢測陣列固定的片段洗脫 掉，全部洗脫過程均在37°C條件下完成，具體為將檢測陣列取出，放入洗脫液A(100mmol/LpH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和4mmol/L Mg2Cl)中離心洗脫(轉速為30rpm，洗脫lmin)，取出檢測陣列後，用鹼性磷酸酯 酶標記的親和素反應液(購自碧雲天公司，鹼性磷酸酯酶標記Mi^ptavidin)覆蓋後，37°C 條件下孵育IOmin ；孵育完成後將檢測陣列放入乾淨的洗脫液A進行洗脫(轉速30rpm， 洗脫 lmin)，取出後再放入洗脫液 B(100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl)中，再離心洗脫(轉速30rpm，洗脫lmin)；取出檢測陣列，用清水對膜塊表 面衝洗，並利用吸水紙去除膜塊上的液體，將膜塊覆蓋顯色液(碧雲天公司，BCIP/NBT鹼性 磷酸酯酶顯色試劑盒)，30秒後肉眼可看到斑點後，即用清水中止反應。具體的檢測結果如圖3所示，其中，①為陽性對照，②為陰性對照，可以看到被生 物素標記的陽性對照均正常顯色，說明顯色系統工作正常；陰性對照不顯色，說明固相擴增 的特異性好，沒有非特異性雜交和核酸擴增。圖3a 圖3d分別為檢測出的HBV的A型、B型、C型、D型的顯色結果圖，其中③、 ④、⑤、⑥固定的檢測探針均與HBV病毒靶序列特異結合併顯色，膜陣列中其他探針並無顯 色，那麼根據膜陣列上的檢測探針的分布位置，令③、④、⑤、⑥檢測探針顯色所檢測的HBV 病毒分別為A型、B型、C型、D型靶序列。這表明檢測探針上設計的檢測位點特異性的識別 到了由於位點突變而產生的HBV病毒的分型，本發明提供的檢測方法準確、明顯。注由於 中國人群感染HBV A型極為稀少，尚未在患者提取的標本當中獲得A型病毒株，為了驗證本 發明的效果，本實驗中對HBV A型的檢測使用了人工合成DNA模板。準確性和重複性考證對100例B型肝炎病毒患者的血清中HBV擴增產物進行測序，用NCBI的 genotyping tool進行分型，其中A型為人工合成序列1例，B型25例，C型67例，D型7 例，再同上述方法檢測結果進行比對，該方法檢測準確率為99%。其中1例誤檢因在設計探 針的位點旁邊鹼基產生突變引起。
權利要求
1.一種基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟1)針對目的基因的待測區域設計併合成PCR擴增引物對，在擴增引物的5、端增加生物 素標記；提取包含目的基因的基因組DNA，以基因組DNA為模板，以生物素標記的擴增引物 對進行多個循環的PCR擴增，得到PCR擴增產物；2)針對目的基因待測區域的突變多態性，設計併合成多個長度為15 25nt的檢測探 針，檢測探針上針對檢測突變多態性的位點設置在探針5、端5nt之後；並在檢測探針端 進行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；3)對固相載體的表面進行修飾後，將檢測探針和對照探針呈矩陣分布的固定在固相載 體上，得到固定有檢測探針和對照探針的檢測陣列；4)將PCR擴增產物進行變性處理後，置於包含DNA聚合酶和反應底物的PCR反應液中， 然後再加入檢測陣列，進行固相核酸擴增反應；其反應程序為A 在不低於探針Tm值5°C 的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環數至少大於1 ；最後72°C延伸至少 3min ；5)固相核酸擴增完成後，取出檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結 合，用含親和素-鹼性磷酸酶的反應液覆蓋檢測陣列並進行孵育，再次洗脫後用ddH20衝 洗，最後覆蓋包含NBT和BCIP的顯色液進行顯色，直至看到顯色斑點後用ddH20終止反應；6)顯色斑點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域相匹配，未顯色斑 點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域不相匹配；根據設計的檢測探針 及其陣列上的檢測位點設計情況，對待測區域的突變多態性進行判讀。
2.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於， 所述的以基因組DNA為模板的PCR擴增，擴增循環數為25 40，所擴增的片段長度不超過 IOOObp。
3.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於， 所述的檢測探針包括多個針對檢測突變多態性的位點，同一陣列上分布的探針的Tm值相 差不超過2°C。
4.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在 於，所述的進行減少空間位阻的序列延長修飾是在檢測探針5、端進行p0lyT、p0lyC、 polyT+polyC或spacer 6 15C序列的延長修飾；所述的固相載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，檢測探針5、端的輔助固定修飾為 在檢測探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。
5.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於， 所述的固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜，將硝酸纖維素膜或尼龍膜在SSC溶液中浸泡 30 60min後在35 40°C條件下乾燥，然後再將檢測探針和對照探針均勻噴塗在硝酸纖 維素膜或尼龍膜上，經50 80°C乾燥30 120min，紫外光照1 IOmin後，得到固定有檢 測探針和對照探針的硝酸纖維素或尼龍膜的檢測陣列。
6.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於， 所述的對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，其所設計的序列均與待檢測的序列無 互補性，陽性對照探針的5、端還被生物素標記。
7.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於，所述的檢測陣列在使用前還在體積濃度為2% 5%的BSA中37°C封閉至少15min。
8.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於， 所述的變性處理為熱變性處理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置!Min ；或者，所述的變性處理為鹼變性處理將質量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴增產物按 照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。
9.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於， 所述的進行固相核酸擴增反應，其反應體系為40 200 μ 1，包括變性處理後的PCR擴增產 物，含DNA聚合酶、反應底物和Mg2+的PCR反應液，以及ddH20 ；加入的檢測陣列浸沒於反應 體系內。
10.如權利要求1所述的基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特徵在於， 所述的固相核酸擴增反應完成後，取出檢測陣列首先放入洗脫液A中，轉速至少30rpm離心 洗脫至少Imin ；然後將檢測陣列覆蓋親和素反應液後37°C孵育至少IOmin後，再依次放入 洗脫液A、洗脫液B中，轉速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出檢測陣列用ddH20衝洗，最 後覆蓋顯色液進行顯色，至看到顯色斑點後終止反應；所述的洗脫液 A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/ L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；所述的親和素反應液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-鹼性磷酸酶液；顯色反應液組 成為ImL顯色緩衝液、6. 5 μ INBT合3. 5 μ 1 BCIP0
全文摘要
本發明公開了一種基於固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，將檢測探針固定在檢測陣列上，與PCR擴增的待測基因片段進行雜交，當目的片段被固相載體上的探針識別後，能夠進行核酸序列的合成延長，使得被生物素標記的擴增片段固定在檢測陣列上而不被洗脫，而不能被探針識別的序列，就不能進行序列的延長，不能通過探針被固定，進而被洗脫掉；這樣通過設計多個檢測探針呈矩陣式的分布，一次就可以檢測出待檢測基因位點的突變性質。
文檔編號C12Q1/68GK102140509SQ201010608970
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者劉永蘭, 包晗, 張菊, 梁平, 趙錦榮, 郭晏海, 雷小英, 顏真 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學