表達神經營養因子家族相關基因的間充質幹細胞及其應用的製作方法

2023-12-01 15:17:16

專利名稱：表達神經營養因子家族相關基因的間充質幹細胞及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種間充質幹細胞及其製備方法，具體涉及骨髓、臍帶或臍血間充質 幹細胞的分離、培養和幹細胞純化及外源性基因如神經生長因子基因轉移入間充質幹細胞 的方法及其在細胞移植、幹細胞培養、定向分化中的應用。
背景技術：
幹細胞是正常人體內存在的細胞群體，具有高度自我複製和高度的分化能力。近 年來隨著幹細胞研究的深入，人們發現利用幹細胞可再生各種組織器官，如肝臟、胰腺、神 經組織、骨骼、肌腱等。因來源和分離的原因，現階段臨床應用的幹細胞主要有成人骨髓間充質幹細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)禾口造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)、人外周血幹細胞、人胚胎來源的幹細胞和臍帶血造血幹細胞及胎盤或臍帶間 充質幹細胞。按HSCs來源分為骨髓移植(BMT)、外周血造血幹細胞移植(PBSCT)、臍帶血 幹細胞移植、純化的CD34+細胞移植、胎肝HSCT。按免疫遺傳學分為異基因幹細胞移植、 同基因幹細胞移植、自體幹細胞移植。研究表明，BMSCs (骨髓基質來源幹細胞)可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪 細胞、肌細胞、神經細胞和腱細胞等，是一種具有多向分化潛能幹細胞，在體外易分離和擴 增，且便於細胞移植。此外，BMSCs獨特的增殖分裂模式使外源基因易於導入和表達，因此， BMSCs在組織工程、細胞治療和基因治療中具有廣闊的應用前景。幹細胞領域研究最多和最清楚的仍是HSCs，它在基礎與臨床應用研究處幹細胞的 最前沿，並不斷為其它幹細胞研究提供理論和實踐的指導和依據。幹細胞可分為長期亞群和短期亞群，長期亞群具有無限的自我更新能力，在個體 中持續終生，短期亞群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力僅維持8周左右；根 據分化功能不同，幹細胞分為全能性幹細胞、多能性幹細胞和單能性幹細胞，個體形成中最 早的幹細胞為全能性幹細胞，包括受精卵及胚泡的內細胞團。全能性幹細胞進一步形成原 始的生殖幹細胞及體幹/祖細胞，並最終分化形成各種組織細胞。人類諸多疾病採用常規手段難以達到治療效果，基因治療是將人的正常基因或有 治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷和發揮治療作用，從而達 到治療疾病目的。基因治療與常規治療方法不同，其針對的是疾病的根源_異常的基因本 身。基因治療分體細胞基因治療、生殖細胞基因治療和幹細胞基因治療。自從1990年美國 國立衛生研究院(NIH)和其下屬重組DNA顧問委員會(RAC)批准了美國第一例臨床基因治 療申請以來，基因治療已從單基因遺傳病擴展到多個病種範圍，主要有惡性腫瘤，心血管 疾病，遺傳病，AIDS，類風溼等。理想的載體應具組織專一性，甚至細胞專一性，使其用常規方法注射到體內後即 可自動抵達目的細胞，並把要移植的基因整合到染色體上。由於用基因移植治療的細胞，必 須先從病人體內取出進行人工培養後，再移植到病人體內，因而基因治療難度很大，目前只有皮膚細胞和骨髓細胞可接受該處理，而且能做到的治療只是引入外源基因使其表達，以 補充缺失的或失去正常功能的酶，而不能做到用正常基因去替換突變基因。幹細胞轉基因治療是繼基因治療的概念提出後，用於遺傳病治療的新手段。主要 通過自體細胞核移植得到的胚胎來獲取幹細胞，然後進行基因糾正和定向分化，有望在遺 傳病的治療上獲得突破，並解決移植排斥問題。腦細胞源性神經營養因子(BDNF)是由腦細胞產生、分泌的一種有著重要生物功 能的神經細胞營養因子。BDNF對中樞和外周的多種神經細胞具有較為廣泛的神經營養作 用，如促進某些神經群的生存和分化，調控神經突軸的軔力，並與海馬的學習、記憶以及脊 髓疼痛機制有關等。BDNF除了其神經生長作用之外，還有促進內皮細胞生成和缺血組織新 生血管的生成，促進累及早老性痴呆的主要神經元的功能恢復和成活。BDNF對多巴胺神經元的生存和生長也有重要作用。它具有阻止凋亡細胞的死亡， 增加酪氨酸水解酶陽性神經元的生存和神經元纖維的生長。研究證明數種中樞神經系統疾 病與此BDNF支持減少相關連。因此，BDNF作為一種強效神經保護因子，被認為是治療某些 中樞神經系統疾病的一個好的候選因子。膠質細胞系來源的神經營養因子(⑶NF)具有促進多巴胺能神經元和運動神經元 存活的作用，能減少腦缺血時遲發性神經元的死亡和減輕腦缺血損傷後腦水腫和縮小梗死 體積。自從GDNF被克隆後，其對神經損傷的保護作用已被眾多的研究所證實，外源性的 GDNF轉基因治療可改善腦缺血的症狀和病理改變。

發明內容
本發明的目的在於提供了一種可表達外源的神經營養因子家族基因的間充質幹 細胞(MSCs)及其製備方法，並提供了將該MSCs用於幹細胞的體外培養、擴增和定向分化的 用途。發明人在研究中發現，年齡大(60周以上)的大鼠骨髓幹細胞和老年人(大於 50歲以上)的骨髓幹細胞，在體外擴增時，儘管有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)、內皮生長因子(epithelial growth factor, EGF)和神經生長因子(nerve growth factor, NGF)存在的條件下，MSCs仍不能有效和活躍的擴增。因此，本發明用年輕 的胎大鼠MSCs作為MSCs培養的飼養層細胞擴增大齡鼠的MSCs，取得了較滿意的結果。繼 而本發明提出了 MSCs和轉基因MSCs用於骨髓幹細胞培養、擴增與分化的研究思路，旨在促 進大齡動物或老年人或體外難擴增的MSCs的體外擴增和定向分化。本發明從骨髓、臍帶和臍血中提取培養MSCs。為了使幹細胞能表達外源基因，採用 重組腺相關病毒(recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV)為載體將治療用基因-腦 細胞源性神經營養因子(BDNF)基因(人大腦來源)轉移入MSCs，從而實現MSCs和基因治 療相結合。本發明所述的一種表達神經營養因子家族相關基因的MSCs，是按以下步驟製備 的A)從骨髓、臍帶和臍血中提取、培養幹細胞；因它們均具有MSCs的生物學特徵， 在形態上呈均質性，高表達⑶166、⑶54、⑶29，低表達⑶13、⑶34、⑶45，因此以下均稱為 MSCs ；
B)採用腺相關病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)為載體，將神經營養因子家 族相關基因重組到AAV載體上；C)製備表達神經營養因子家族相關基因的AAV ；D)將上述表達神經營養因子家族相關基因的AAV顆粒感染分離、純化的幹細胞， 得到表達神經營養因子家族相關基因的MSCs。所述步驟C中，所述的所述神經營養因子家族相關基因包括膠質細胞源性神經營 養因子即⑶NF和腦細胞源性神經營養因子即BDNF。所述步驟A中，採用離心法分離骨髓幹細胞和臍血幹細胞，用免疫磁珠法純化 ⑶34+細胞。具體方法如下1、按臨床常規骨髓穿刺操作每次取得紅骨髓200ml或取自臍帶血庫的臍血 100ml。2、將骨髓血或臍血加入到磷酸鹽緩衝液(PBS)中輕勻，常溫離心機中以1500r/ min進行離心15分鐘，棄上清，將沉澱物用磷酸鹽緩衝液(PBS)輕輕懸浮，細胞懸液按2 1 比例緩慢加入到比重為1. 089的幹細胞分離液和淋巴細胞分離液中，20°C以2500r/min離 心10分鐘。3、離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細胞的中間細胞層，以PBS洗滌， 800r/min常溫離心4分鐘。細胞計數。胎盤藍染色，活細胞計數。瑞氏染色和有核細胞分 析。4、獲得單個核細胞懸液後進行CD34+細胞純化(MACS磁性分離試劑盒，購自 Miltenyi Biotech 公司，德國)。5、純化後的細胞懸液取樣計數，以PE標記的鼠抗人⑶34單克隆抗體(購自 Becton Dickinson公司，美國)標記細胞，流式細胞術測定⑶34+細胞純度。6、將純化後的⑶34陽性細胞用含10%小牛血清的DMEM/F12(Hyclone公司)培 養，內含LIF 1.0IU/ml,CSF 1. 0ng/ml,bFGF 2ng/ml。培養24小時後進行轉基因技術操作。所述步驟A中，採用膠原酶和胰酶消化法分離臍帶MSCs，具體方法如下1、將產後臍帶立即浸入4 °C罕氏平衡鹽溶液(Hanks 『 Balanced Salt Solution(HBSS)(Gibco，14185-052，USA)中；2、75%乙醇消毒30秒，清除臍帶血管，間質(Wharton' s膠)於試管中切成 0. 5cm3 大小；3、250g離心5分鐘，去上清，沉澱用0. 1M/L的PBS洗三次；4、250g離心5分鐘，沉澱用0. 1 %的膠原酶37°C消化18小時；5、洗滌，再用2. 5 %的胰酶37°C消化30分鐘；6、收集消化後游離的MSCs，用含10%小牛血清的DMEM/F12(Hycl0ne公司)培養， 內含LIF 1.0IU/ml, CSF 1. 0ng/ml, bFGF 2ng/ml。培養24小時後進行轉基因技術操作。所述步驟B中，包括以下步驟a)人神經營養因子家族相關基因克隆及其N未端的構建；b)含神經營養因子家族相關基因表達盒的AAV載體的構建。上述步驟a中，所述神經營養因子家族相關基因包括膠質細胞源性神經營養因子 即GDNF和/或腦細胞源性神經營養因子即BDNF。
5
本發明經動物腦內移植實驗證實骨髓或臍血MSCs在體內能分化形成神經元或神 經膠質細胞，並且能穩定表達⑶NF。本發明從人骨髓中提取純化骨髓MSCs的方法並不限於以上典型方法，也可用如 下方法物理方法如穿剌、引流等從骨髓中獲取骨髓血細胞。分離骨髓或臍血MSCs的方法可包括1、貼壁分離法。該法主要利用幹細胞具有在塑料培養瓶中貼壁生長的特性將幹細 胞與其它細胞相分離。2、流式細胞分選法。該法是根據幹細胞體積小、相對缺少顆粒和獨特的表面標誌 等特性對其加以分離。3、免疫磁珠法。該法是根據免疫學原理，利用包備有抗體的磁珠與幹細胞表面的 一些特殊標誌如CD34特異結合，通過一定強度磁場時被滯留而分選。4、密度梯度離心法。該法是根據幹細胞與其它細胞的密度不同，實驗證明間質 幹細胞位於低密度細胞層。所採用的常用梯度分離液有Percoll和Ficoll，Ficoll法或 Peroll法可有效地將造血幹細胞從骨髓或臍血中分離出來，且純度較高，細胞存活好。本發明將外源基因轉入人骨髓或臍血MSCs的方法並不限於以上典型的AAV載體 的方法，也可用如下的方法1、電穿孔法；2、脂質體法；3、鈣磷法；4、病毒載體法如皰疹病毒載體、巨細胞病毒 載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體(ADV)、腺相關病毒載體(AAV)等；5、非病 毒載體法如轉座子法(Transposon systems)、原核/真核表達載體等。本發明所轉入外源基因是與疾病發生、預防和治療相關的基因，例如生長因子基 因(表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板來源生長因子(PDGF)、腦源性 神經因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)等)，營養不良蛋白(dystrophin)與假性肥大性肌 營養不良基因，囊性纖維化與人CFTR基因，粘多糖病與0 -葡糖苷酸酶基因，鐮狀細胞性貧 血與血紅蛋白S基因，侏儒症與生長激素基因和苯丙酮尿症與苯丙氨酸羥化酶基因，白介 素IL1-28，幹擾素和細胞趨化因子等基因，轉入病症相關外源基因的骨髓或臍血MSCs可用 於轉入基因相關疾病的診斷和治療。本發明將人源正常目的基因轉入骨髓或臍血MSCs，在骨髓或臍血MSCs內表達、分 泌有治療功效目的基因產物蛋白質，而構成的一種結合基因治療、達到對治療相關疾病治 療更有針對性、療效更顯著的骨髓或臍血MSCs。本發明將轉入神經營養因子(如BDNF和⑶NF)基因的MSCs，用做飼養層細胞用於 某些特定個體(如老年動物、老年人、患萎縮性疾病(再障、腫瘤化療後和腦萎縮等)和體 質差的患者)的骨髓幹細胞或神經幹細胞培養擴增和維持未分化狀態。本發明將轉入神經營養因子(如BDNF和⑶NF)基因的MSCs，同骨髓幹細胞或神經 幹細胞共培養，以促進骨髓幹細胞向神經細胞方向定向分化，而神經幹細胞又可定向分化 成特定的神經細胞如多巴胺能神經元等。


圖1 用幹細胞分離液分離和免疫磁珠法純化的的CD34+骨髓幹細胞，幹細胞特徵 顯示為細胞小，核染色深，胞質很少。
圖2 培養中的骨髓MSCs 經過數代培養後，骨髓MSCs擴增明顯。圖3 綠色螢光蛋白基因轉染的人骨髓MSCs及其表達應用基因轉染技術，將脂質 體包被綠色螢光蛋白基因表達質粒轉染人骨髓MSCs，48小時後，用螢光倒置顯微鏡觀察綠 色螢光蛋白基因在人骨髓MSCs的表達，結果如箭頭所示人骨髓MSCs表達綠色螢光蛋白基 因，表達螢光強度達中度，轉染率達20%以上。圖4 人神經營養因子(BDNF)基因cDNA片段(RT-PCR)產物.第一泳道為DNA分 子量標準；第二和第三泳道為該基因反向轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)產物。箭頭所指 為該基因cDNA片段在瓊脂糖電泳上的位置。圖5 重組人神經營養因子(BDNF)的表達。此圖為轉化細菌後的表達產物在 SDS-PAGE膠經卡馬氏亮蘭染色後的結果。從左向右起，第一泳道為標準蛋白質分子量標記 物；第二泳道為未誘導的細菌產物；第三和第四泳道為誘導的產物。箭頭所示為表達產物。圖6 該基因BDNF在表達產物的Western Blot分析結果。第一泳道為標準蛋白 質分子量標記物；第二泳道為末誘導細菌產物；第三、第四和第五泳道分別為不同誘導時 間的產物。顯示表達產物為符合預期的BDNF基因產物。圖7 轉基因MSCs的上清能誘導PC12細胞的神經元樣分化，細胞軸突生長明顯， 其末端膨大，並可與周圍神經細胞形成連接。圖8 未轉基因的MSC細胞上清共培養的細胞也有小量的神經突起形成，而對照組 的PC12細胞仍為單個園型或多角型細胞呈集落生長。圖9 共表達人源⑶NF和BDNF基因表達盒結構圖從左到右，分別是pCMV啟動子、 3 -珠蛋白內含子、人⑶NF、IRES、人BDNF和人生長激素多聚腺嘌呤組成。圖10 含共表達人源⑶NF和人源BDNF基因表達盒的重組AAV基因組結構圖從 左到右，分別為反轉末端重複子(ITR)、共表達人源⑶NF和BDNF基因的表達盒和反轉末端 重複子(ITR)。圖11 轉BDNF基因的臍血MSCs與骨髓MSCs共培養，細胞呈現梭形、多角形、錐形 或星形，與神經細胞類似，相互交織成網。
具體實施例方式實施例一骨髓MSCs分離培養和綠色螢光蛋白基因轉染人骨髓MSCs綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因是目前發現的唯一能在細 胞內表達，且不需要其他外源底物參與的全新報告基因。本研究利用CMV-GFP基因轉染人 骨髓幹細胞，觀察GFP在人骨髓幹細胞內的表達情況。一、材料1、設備超淨工作檯，水平離心機，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天 平，骨髓穿剌針和採血袋。流式細胞儀，乾燥箱，手套和手術衣。比重計(1.000-1. 100、 1. 100-1. 200)2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公 司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學試劑 廠)。3、細胞培養基含10%小牛血清的高糖DMEM培養基(Gibco公司)。
4、淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)。5、CD34免疫磁珠試劑，購自premega公司。6、BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD公司，幹細胞計數試劑盒， 批號N0. 340498)7、pGFP10II :3192kb，為含有野生型 GFP 基因 cDNA EcoR I 片段(包括 0RF 禾口 3' 端非編碼區)的PBS質粒(invitrogen公司)。二、方法1、幹細胞分離液的製備稱取泛影葡胺3g、羥甲基纖維素2g、氯化銫0. 2g、聚蔗糖3g。將上述組分依次加 入100ml的量筒中，加O.Olmol/L磷酸鹽緩衝液至100ml，即得幹細胞分離液的濃縮液。用 比重計測得其比重為1. 123g/ml。使用時，將上述幹細胞分離液的濃縮液用0. Olmol/L磷酸 鹽緩衝液稀釋至所需的比重，即為工作液。2、採集臨床志願者髂骨內骨髓按臨床常規骨髓穿刺操作每次取得紅骨髓200ml。將20ml骨髓加入到磷酸鹽緩衝 液(PBS)中輕勻，常溫離心機中以1500r/min進行離心15分鐘，棄上清，將沉澱物用磷酸鹽 緩衝液(PBS)輕輕懸浮，細胞懸液按2 1比例緩慢加入到比重為1.089的幹細胞分離液 和淋巴細胞分離液中，20°C以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取 富含有核細胞的中間細胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。細胞計數。胎盤藍染 色，活細胞計數。瑞氏染色和有核細胞分析。3、用免疫磁珠法純化人骨髓幹細胞CD34+造血幹/祖細胞分離採用免疫磁珠法，從骨髓血中分離的單個核細胞，以 DMEM調整細胞濃度至107ml，洗滌後加磁珠標記的單抗，於10°C，孵育15min，過Mini MACS 細胞分離柱，脫離磁場，加壓洗脫結合的CD34陽性細胞即為純化的骨髓幹細胞。4、免疫細胞化學和流式細胞檢測。試劑盒操作詳見說明書。將新鮮分離的細胞加入EppendofT管(106細胞/管)， 以1500rpm轉速離心5min，PBS洗1次，加入冷丙酮lml，4°C固定8min ；離心棄上清後加入 一抗(CD34、CD45)，混勻後37°C反應45min，1500rpm轉速離心lOmin，PBS洗3次，離心棄上 清後加入帶二抗標記的IgG，混勻後37°C反應30min，PBS洗滌兩次，離心後的沉澱物視量加 入PBS製備成細胞懸液，流式細胞儀進行檢測。5、人骨髓幹細胞的培養與擴增取2 X 106ml-lCD34+細胞種入培養瓶中，加DMEM培養液含20 % FCS和LIF (lU/ml， GIBC0)、SCF(50ng/ml, GLBC0)、IL-3 (200U/ml，GLBC0)、GM-CSF (200U/ml，GIBC0) 37°C >5% C0240小時後半量換液，再培養48小時後分瓶培養擴增。以下所用細胞均為培養擴增的人 骨髓MSCs。6、進行pEGFP-Nl質粒細胞轉染，用Lipofectamine2000脂質體轉染法。三、結果1、各種分離液所得細胞經胎盤藍染色顯示，細胞存活率均達90%以上，均未顯示 對骨髓細胞有毒性作用。2、用瑞氏染色法鑑定，用幹細胞分離液分離所得細胞主要為幹細胞，細胞小，如紅細胞大小，核染色深，胞質很少(圖1)。3、幹細胞標誌試劑盒和流式細胞儀鑑定骨髓幹細胞幹細胞標誌試劑盒主要用於 鑑定骨髓造血幹細胞，其中⑶34用於標誌造血幹細胞，⑶45用於標誌淋巴細胞，PI主要用 於標誌有核細胞。經流式細胞儀測定，幹細胞分離液所得細胞懸液中CD34、CD45和有核細 胞比例見表1。結果提示用1. 086比重的幹細胞分離液所得的⑶34陽性細胞數比淋巴細 胞分離液所得的CD34+細胞數多12倍。表1，不同比重幹細胞分離液分離豬骨髓細胞各種標誌的細胞比例 4、用免疫磁珠法純化人骨髓幹細胞，⑶34陽性細胞佔96. 4%。5、分離的骨髓MSCs經4-5代轉代後，細胞擴增明顯，大部分細胞呈梭型，同心園狀 分布，少量細胞呈小圓型(圖2)。6、用pEGFP-m質粒進行骨髓MSCs轉染，轉染細胞螢光強度為中度以上，綠色螢光 信號主要從胞體中發出(圖3)，轉染效果達20%以上。實施例二 人⑶NF和BDNF基因克隆及其N未端的構建1、人⑶NF基因克隆及其N未端的構建以人腦組織信息核糖核苷酸(mRNA)為模板，用Poly(T)引物在反向轉錄酶作用 下，合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)，然後以人腦組織cDNA作為模板，用人工 合成的，含有編碼人白細胞介素_2分泌先導多肽核苷酸和人成熟GDNF基因N-末端序列核 苷酸的正向引物和人GDNF基因C-末端序列核苷酸的反向引物進行PCR擴增，進行人GDNF 基因克隆及其N未端的改建，並在其N-末端引入內切酶Nhel和Ndel位點，在其C_末端 引入內切酶BamHI和Hindlll位點。弓丨物1C-末端部份序列與引物2N-末端部份序列相同 (見下劃線)；引物3C-末端含GDNF的C-末端序列。由於人白細胞介素_2分泌先導多肽核苷酸較長，故採用分步克隆法。即以人腦組 織cDNA作為模板，先用引物2和引物3進行第一次PCR反應，再以此PCR產物為模板，用引 物1和引物3進行第二次PCR反應。PCR引物設計如下引物 l(61mer):5，~gt |gctagccatatg| tacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt-3，引物 2(52mer)5' —actaagtcttgcacttgtcacaaacagttctgagaagaagcgccggggatca—lj，引物3(34mer)5， -tcaagcttggatcctcagatacatccacaccttt-3'
PCR擴增產物經加尾(tailing)加上腺嘌呤後，連接至T-easy載體，轉化細菌後， 擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。測序正確後，構建含人⑶NF基因原核細胞表達質粒，進行表達和 westernblotting 檢測。2、人BDNF基因克隆及其N未端的構建以人腦組織信息核糖核苷酸(mRNA)為模板，用Poly(T)引物在反向轉錄酶作用 下，合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)。然後以人腦組織cDNA作為模板，用人工 合成的，含有編碼人白細胞介素_2分泌先導多肽核苷酸和人BDNF基因N-末端序列核苷酸 的正向引物和人BDNF基因C-末端序列核苷酸的反向引物進行PCR擴增，進行人BDNF基因 克隆及其N未端的改建。並在其N-末端引入內切酶Ncol和Smal位點，在其C-末端引入 內切酶Xbal和Hindlll位點。引物4C-末端部份序列與引物5N-末端部份序列相同(見 下劃線)；引物6C-末端含GDNF的N-末端序列。由於人白細胞介素-2分泌先導多肽核苷酸較長，故採用分步克隆法。即以人腦組 織cDNA作為模板，先用引物5和引物6進行第一次PCR反應，再以此PCR產物為模板，用引 物4和引物6進行第二次PCR反應。PCR引物設計如下弓丨物 4(63mer)5' —gtccatggcccgggatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt一3，弓丨物 5(55mer)5，_actaagtcttggcacttgtcacaaacagtcactctgaccctgcccgccgaggggag_3，弓丨物 6(41mer)5' -gcctctagaaagcttctatcttccccttttaatggtcaatg-3'PCR擴增產物經加尾(tailing)加上腺嘌呤後，連接至T-easy載體，轉化細菌後， 擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。測序正確後，構建含人BDNF基因原核細胞表達質粒，進行表達檢測。實施例三、共表達⑶NF和BDNF表達盒pAAV_MCS載體的構建共表達⑶NF和BDNF表達盒pAAV_MCS載體的構建方法(圖9，10)包括以下步驟1)應用AAV helper-free表達系統中pAAV-MCS載體的多克隆位點，將⑶NF基 因以內切酶BamHI和Xball核苷酸片段、經純化、並與BamHI和Xball酶切消化、純化的 pAAV-MCS載體進行連接反應後，轉化感受態細菌，進行擴增，並塗布在含適當抗生素的培養 皿上，37 °C培養箱過夜生長；2)篩選多個克隆菌落於含適當抗生素的培養液中，37°C震蕩培養過夜，於第二天 抽取、純化pAAV-MCS質粒DNA，並用BamHI和Xball酶切消化，以確定含有BamHI和Xball 的GDNF基因片段的pAAV-MCS載體的質粒DNA和克隆菌株；3)確定含有⑶NF基因片段的pAAV-MCS之後，以內切酶Hindlll和Bglll完全消 化含有⑶NF基因的pAAV-MCS質粒DNA，1 %瓊脂糖分離、純化備用；4)為獲得IRES片段，用內切酶Hindlll和Small完全消化pIRESneo3載體DNA， 瓊脂糖分離、純化IRES片段備用；5)用內切酶Small和Bglll完全消化含有BDNF基因片段的T-easy載體DNA，1%
10瓊脂糖分離、純化BDNF基因片段備用；6)將上述內切酶HindHI和Small消化的IRES片段和內切酶Small和Bglll消 化的BDNF基因片段經連結酶反應，拼接到上述內切酶Hindlll和Bglll完全消化的含⑶NF 基因的pAAV-MCS載體質粒DNA上，轉化感受態細菌，370C培養擴增，並塗布在含適當抗生素 的培養皿上，37°C培養箱過夜生長；7)篩選多個克隆菌落於含適當抗生素的培養液中，37°C震蕩培養過夜，於第二天 抽取、純化pAAV-MCS質粒DNA，並用上述內切酶消化pAAV-MCS質粒DNA，確定含⑶NF基因、 IRES片段和BDNF因的pAAV-⑶NF/IRES/BDNF質粒；將此pAAV-⑶NF/IRES/BDNF表達質粒 用脂質體導入真核細胞，應用蛋白質印跡法，觀察由CMV啟動子驅動共表達⑶NF和BDNF的 狀況。實施例四、⑶NF-AAV的表達⑶NF-AAV的表達，包括以下步驟1、在轉染前48小時，在加入10ml DMEM生長培養液的100毫米培養皿中接種約3 百萬個AAV-293細胞，2天後細胞密度應為70-80% ；2、解凍含上述表達盒的 pAAV-MCS、pAAV-RCH 和 pHelper 質粒 DNA，用 pH 7. 5 的 TE 緩衝液調整每種質粒DNA為lmg/ml ；3、在15毫升培養管中從上述3種質粒溶液中各取10微升DNA溶液，再加入1毫 升0.4M CaCl2，輕輕混勻；4、在另一支15毫升培養管中加入1毫升2x HBS溶液，再將上述3)中的1.03毫 升的DNA/CaCl2滴入1毫升2x HBS溶液中，倒轉培養管多次，混勻；5、立即將DNA/CaCl2/HBS混懸液滴入AAV-293細胞培養皿中，並使其均勻分布在 培養液中；6、將AAV-293細胞培養皿放入37°C培養箱中6小時，隨後去除AAV-293細胞培養 皿中的培養液，加入10毫升新鮮DMEM生長培養液，在37°C培養箱中培養72小時；7、3天後觀察，如觀察到培養液顏色變化、或看到有細胞形態變園，脫離板面或漂 浮在培養液中，則表明有重組AAV病毒顆粒產生；8、此時收集細胞培養液、並收集細胞，通過4次凍/融法，裂解細胞，使其胞內重組 AAV病毒釋放出來，最後在室溫下以10，OOOXg離心10分鐘，將上清液轉移至另一新管中，貯 存於_80°C冰箱保存。此即為表達人源GAD65和⑶NF基因的重組AAV母液，下一步可進行 病毒擴增、病毒滴定度檢測及GDNF基因表達產物的檢測。為了使骨髓或臍血MSCs能表達外源基因，發明人採用AAV為載體，以CMV為啟動 子，將⑶NF基因轉移入骨髓或臍血MSCs。rAAV載體由AAV-293細胞哺育生產，AAV載體病 毒的純化採用兩次氯化銫離心法。1X106細胞/ml的濃度加入培養瓶中進行培養6-12小時後，換新的培養液。⑶NF 在培養上清中的表達用抗GDNF單克隆抗體進行ELASA測定。實施例五、腦細胞源性神經營養因子(BDNF)轉基因骨髓MSCs的製備1、材料1. 1 主要試劑:Trizol Reagent, LipofectamineTM2000 (美國 Invitrogen 公司)。 逆轉錄酶DNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)。T4DNA連接酶(美國MBI公司)。PCR
11Kit(Qiagen公司)；BamHI和Xho I限制性內切酶(Promega公司)；引物合成、核苷酸序列 測定(Qiagen公司)；Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen公司)；原位-半乳糖苷酶染色 試劑盒(Stratagene公司)，DMEM培養基(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)；喜 樹鹼(Sigma公司)。1. 2病毒載體、細胞株及菌種pAAV系列質粒及AAV-293、AAV-HT1080細胞 (Stratagene公司)，DH5宿主菌由本室製備保存。2、方法2. lpAAV-BDNF重組AAV載體的構建從胎腦組織中提取總RNA，利用M-MLV逆轉錄酶及01igo_dT引物合成第一條cDNA 鏈，然後在PCR管中加入ExTaqTM;利用PCR法擴增BDNF目的基因，上遊引物為5』 -GCTCTAGAGCCACCATGACCATCCTTTTCCTTACTATG-3』，其中TCTAGA為Xbal I識別位點，下遊引物為5，-GCGGTACCCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAAT-3，。上、下遊引物經5』端修飾分別引入限制性內切酶BamHI和Xhol位點。擴增產物 經BamHI和Xhol酶切後定向克隆入pAAV_MCS載體多克隆位點。重組質粒pAAV_BDNF經雙 酶切鑑定正確後，進行DNA測序。2. 2 重組 AAV (AAV-BDNF)的包裝採用Qiagen試劑盒大量提取超純質粒pAAV-BDNF、pHelper和pAAV-RC質粒，分別 測定0D值，並用TE溶液調整質粒濃度為lg/L。DMEM高糖培養基培養AAV-293，細胞融合至 70% 80%時，用磷酸鈣轉染法將pAAV-BDNF質粒與AAV包裝質粒pAAV_RC、AAV輔助質粒 pHelper三質粒共轉染AAV-293細胞，構建帶有BDNF全長0RF的重組AAV-BDNF。pAAV-LacZ 作為報告基因同pAAV-BDNF —樣共轉染AAV-293細胞。轉染後於培養箱中培養6h後換新 鮮培養基，再培養66 72h後回收病毒。顯微鏡下觀察細胞形態變化。2. 3病毒顆粒的收集用細胞刮子將細胞懸浮，收集細胞懸液，進行4輪冷凍(液氮)_復溫(37°C水浴) 循環，每次冷凍、復溫均lOmin。10, OOOr/min離心lOmin收集上清液-初級病毒液，於_80°C保存。2. 4重組pAAV-BDNF病毒滴度檢測培養AAV-HT1080細胞，以每孔3X 105個接種12孔培養板，培養過夜，使細胞達到 80%融合。每孔加入0. 2mL AAV容納培養基(使培養基中喜樹鹼終濃度達0. 8 y mol/L)，混 勻後培養4h。吸出培養基，病毒原液稀釋100倍後，再進行體積為2. 5mL的5倍系列稀釋， 稀釋度從2 X 10_3到8X 10_5。取0. 5mL分別加入3個培養孔，同時以無病毒原液作為陰性 滴度對照。培養2h，每孔再加入0. 5mLDMEM,培養48h，棄上清，使用Stratagene公司的原 位日-半乳糖苷酶染色試劑盒對細胞進行固定和染色，在細胞密度適當的培養孔中計數藍 染的細胞，計算每mL貯存物中病毒顆粒(染色細胞數)。2. 5BDNF基因重組的pAAV的純化及其體外表達目的基因的檢測用病毒接種於大約10瓶75cm2培養瓶的HT1080細胞，待出現細胞病變時如上收 集病毒，用CsCl密度梯度離心法純化pAAV，_70°C保存備用。將純化的pAAV的轉染HT1080 細胞，取其培養基配製電泳樣品，用未接種的同時傳代的HT1080細胞培養基配製樣品做為陰性對照，分別取第1天，第2天，第3天的培養基用於樣品製備，蛋白電泳及Western blot 法檢測BDNF基因在HT1080細胞中的表達，其中在We stern blot過程中使用羊抗大BDNF多 克隆抗體(1 1000)與PVDF(聚偏氟乙稀)膜上的BDNF蛋白質進行結合。2. 6BDNF-pAAV 轉染大鼠骨髓MSCs和體外細胞培養活性測定大鼠骨髓基質細胞(MSCs)的分離、原代和傳代培養在無菌條件下取出大鼠股骨 和脛骨。剪掉骨頭兩端，露出骨髓腔，用無血清的DMEM培養液衝洗骨髓腔，反覆2次或3次， 以lOOOr/min離心5min。離心後棄上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養液重懸細胞， 接種於培養瓶中。培養24h後換液，後每3d全量換液1次，細胞基本鋪滿瓶壁後，以胰酶消 化傳代。在MSCs培養基中加入適量病毒液。37°C CO2孵箱中孵育，培養3，10天，取培養上 清，進行BDNF的Western blot檢測和對PC12細胞(源於大鼠腎上腺髓質瘤/嗜鉻細胞瘤， 是一種單胺能細胞株)的神經營養活性測定。以未轉染BDNF-pAAV的MSCs培養上清做陰 性對照。3、結果3. 1 重組 pAAV-BDNF 的鑑定體積分數1. 5%瓊脂糖凝膠電泳顯示約860bp處有擴增條帶，片段大小與預期值 一致(圖4)。重組質粒pAAV-BDNF經雙酶切後，電泳顯示出現大小為4. 6kb和861bp的載 體片段和目的基因片段，結果與預期相符(圖4)。重組質粒pAAV-BDNF測序亦證實插入片 段BDNF與Genbank序列完全一致，全長編碼區無鹼基突變。3. 2三種載體共轉染AAV-293細胞及病毒粗提物的製備3種載體共轉染AAV-293細胞6h後，顯微鏡下觀察到培養基底部出現無數小黑色 顆粒，細胞無明顯變化。24h後觀察到AAV-293細胞部分變圓，隨著病毒增殖，細胞成串浮 起，出現細胞病理效應；48h後細胞逐漸從壁上脫落；而陰性對照組細胞則貼壁完整，無明 顯形態變化。3. 3病毒滴度測定不同稀釋度的AAV-LacZ病毒感染AAV-HT1080細胞後，細胞經固定及X_gal染色 後，在顯微鏡下可明顯觀察到藍染的細胞。在藍染細胞密度合適的細胞孔中記數全部的藍 染細胞數，計算重組病毒的滴度約為l.OXliTpfu。3. 4蛋白電泳及Western blot檢測結果(圖5，6)對照組3、10dMSCs培養基均未見明顯特異性條帶，而實驗組，轉染後3、10d取其培 養基進行檢測，可見BDNF的表達逐漸增強，並較對照組有顯著性增強，圖中的黑色條帶即 為檢測到的BDNF蛋白(圖5，6)。3. 5對PC12細胞的神經營養活性轉基因MSCs的上清能誘導PC12細胞的神經元樣分化，細胞軸突生長明顯，其末端 膨大，並可與周圍神經細胞形成連接(圖7)。未轉基因的MSC細胞上清共培養的細胞也有 小量的神經突起形成，而對照組的PC12細胞仍為單個園型或多角型細胞呈集落生長(圖 8)。實施例六、腦細胞源性神經營養因子(BDNF)轉基因骨髓MSCs對腦缺血性動物模 型的腦損傷保護作用
一、材料與方法1、BDNF轉基因骨髓MSCs按實施例二所述方法由本室自製。2、實驗動物與分組健康Wistar大鼠80隻(購自中山醫科大學實驗動物中心)，體重180g 220g。大鼠腦缺血再灌流模型的建立，根據Honma等(Honma T,Honmou 0，Iihoshi S, et al. Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat. Exp Neurol, 2006，199 =56-66.)的方法，大鼠麻醉後取頸正中切口，結紮頸總動脈、頸外動脈，於頸總動 脈分叉下方剪一切口，將一末端用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內動脈17-18mm，結紮頸 內動脈。2小時後拔線，實現再灌注。腦缺血再灌注後1天進行神經缺損評分，方法為6級 評分法0級，無功能障礙；1級，不能伸展左側前肢；2級，向左側旋轉；3級，向左側傾倒；4 級，無自主活動伴意識障礙；5級，死亡。評分2 3級者為模型製備成功，進入本實驗。假 手術組除不插尼龍線外，其餘步驟同手術組。實驗分4組假手術組(8隻)、缺血對照組(8隻)、MSCs組(8隻)、轉基因MSCs 組(8隻)。3、大鼠骨髓MSCs的分離、原代和傳代培養在無菌條件下取出大鼠股骨和脛 骨。剪掉骨頭兩端，露出骨髓腔，用無血清的DMEM培養液衝洗骨髓腔，反覆2次或3次，以 1000r/min離心5min。離心後棄上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養液重懸細胞，接 種於培養瓶中。24h後換液，後每3d全量換液1次，細胞基本鋪滿瓶壁後，以胰酶消化傳代。4、大鼠MSCs轉基因在MSCs細胞培養基中加入適量病毒液。37°C CO2孵箱中孵 育10天，經Western blot檢測能表達BDNF。5、尾靜脈注射MSCs 腦缺血再灌注24小時後，將ImL轉基因MSCs (1 X IO6個細胞 /ml)經尾靜脈注射入轉基因MSCs組大鼠體內，將未進行轉基因MSCs (1 X IO6個細胞/ml) 經尾靜脈注入MSCs組大鼠體內，缺血對照組和假手術組大鼠體內分別注入ImL生理鹽水。6、功能評估大鼠模型製備前後每3天均採用Combs和D' Alecy(Combs DJ, D' Alecy L G. Motor performance in rat s exposed to severe forebrain ischemia effect of fasting and 1，3-butanediol. Stroke，1987，18 :503_511.)的方法進行網屏測 驗、平衡木測驗、抓握牽引測驗，觀察大鼠在行為學方面的差異。每項試驗進行兩次，取較高 的分數值作為大鼠的該項得分。7、各組大鼠於MSCs治療後28天以4%多聚甲醛灌注取腦。取腦組織冠狀面均勻 切2mm厚腦片，2% TTC染色，數位相機拍照，以圖像處理軟體測量梗死面積，計算梗死面積 與損傷側腦半球的面積比。8、統計學處理採用SPSS 13. O統計軟體，各組數據均以均數士標準差(χ士s)表 示。採用方差分析或t檢驗進行組間比較，P < 0. 05為差異有統計學意義。二、結果1、神經功能評分MSCs組大鼠神經功能恢復較缺血對照組明顯提前，MSCs治療後 第4天即出現明顯的神經功能改善，MSCs治療21天以後與缺血對照組比較無顯著差異。 而轉基因MSCs組在治療後第4天大鼠神經功能評分即與MSCs組、對照組比較均有顯著 差異(ρ <0.01)，至治療後21天效果更加明顯(ρ <0.001)，到28天時仍有顯著差異(ρ < 0. 01)。
2、腦梗死面積比較MSCs治療後28天，腦組織TTC染色顯示，梗死區與損傷側腦 半球面積比值與缺血對照組比較無顯著差異(p>0. 05)，而轉基因MSCs組腦梗死區面積明 顯縮小，梗死區與損傷側腦半球面積比值與缺血對照組比較有顯著差異(P < 0. 05)。三、結論 轉BDNF基因MSCs對大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷有明顯的治療作用，效果優 於單用MSCs。實施例七、共表達神經營養因子⑶NF和BDNF基因的自體骨髓MSCs的構建構建 本發明的共表達神經營養因子⑶NF和BDNF的轉基因骨髓MSCs，首先複製人⑶NF和BDNF 基因，構建共表達人⑶NF和BDNF基因的重組AAV ；用此重組AAV轉染人自體骨髓MSCs， 完成共表達GDNF和BDNF的轉基因修飾自體骨髓MSCs的構建。本發明採用的AAV系統為 Stratagene 公司的 AAV helper-free 系統。1、人⑶NF和人BDNF基因克隆及其N未端的構建(見實施例二 )；2、含共表達⑶NF和BDNF表達盒的pAAV_MCS載體的構建(見實施例三)；3、共表達⑶NF和BDNF的AAV的製備，具體操作過程如下1)在轉染前48小時，在加入IOml DMEM生長培養液的100毫米培養皿中接種約3 百萬個AAV-293細胞，2天後細胞密度應為70-80% ；2)解凍含上述表達盒的 pAAV-MCS、pAAV-RCH 和 pHelper 質粒 DNA，用 pH 7.5 的 TE 緩衝液調整每種質粒DNA為lmg/ml ；3)在15毫升培養管中從上述3種質粒溶液中各取10微升DNA溶液，再加入1毫 升0.4M CaCl2，輕輕混勻；4)在另一支15毫升培養管中加入1毫升2x HBS溶液，再將上述3)中的1.03毫 升的DNA/CaCl2滴入1毫升2x HBS溶液中，倒轉培養管多次，混勻；5)立即將DNA/CaCl2/HBS混懸液滴入AAV-293細胞培養皿中，並使其均勻分布在 培養液中；6)將AAV-293細胞培養皿放入37°C培養箱中6小時，隨後去除AAV-293細胞培養 皿中的培養液，加入10毫升新鮮DMEM生長培養液，在37°C培養箱中培養72小時；7)3天後觀察，如觀察到培養液顏色變化、或看到有細胞形態變園，脫離板面或漂 浮在培養液中，則表明有重組AAV病毒顆粒產生；8)此時收集細胞培養液、並收集細胞，通過4次凍/融法，裂解細胞，使其胞內重組 AAV病毒釋放出來，最後在室溫下以10，OOOg離心10分鐘，將上清液轉移至另一新管中，貯 存於_80°C冰箱保存。此即為表達人源GAD65、BDNF和⑶NF基因的重組AAV母液，下一步 可進行病毒擴增、病毒滴定度檢測及GDNF和BDNF基因表達產物的檢測。4、骨髓MSCs的分離和培養(參見實施例一)；5、轉基因骨髓MSCs的構建在75cm2的培養瓶中培養約3 5百萬個MSCs，將4毫升含約5百萬個pAAV_GDNF/ BDNF重組AAV顆粒轉染骨髓MSCs約4小時，然後加入適量的骨髓MSCs培養液，置37°C二 氧化碳培養箱過夜。6、共表達⑶NF和BDNF的轉基因骨髓MSCs的鑑定待轉基因骨髓MSCs培養24 48小時後，收集部分培養的轉基因骨髓MSCs和培養上清液，進行PT-PCR反應和western blotting反應，確定轉基因的骨髓MSCs是否共表 達GDNF和BDNF及其表達水平。7、共表達⑶NF和BDNF的轉基因骨髓MSCs的應用應用外科神經核定位技術及微管輸送系統，將共表達⑶NF和BDNF的轉基因骨髓 幹細胞定點移植至中樞神經系統相關部位，觀察對中樞神經系統相關疾病，如腦血管疾病、 腦缺氧和腦外傷導致的腦功能損傷以及早老性痴呆疾病；以及移植至中樞神經核如絞狀 體、豆狀核和黑質等，觀察對中樞神經系統退行性疾病帕金森氏病的治療效應。實施例八、轉BDNF基因臍血MSCs對體外培養人骨髓MSCs增殖的影響。一、材料與方法
1、主要試劑見實施例一和實施例五。2、臍血間充質幹細胞(umbilical cord blood-derived MSCs, UBMSCs)的分離培 養(參見實施例一)，細胞培養擴增至3 X IO6左右進行凍存，共三管，每管1 X IO6左右。3、轉 BDNF 基因的 UBMSCs (transgene UBMSCs, TUBMSCs)的製備在 UMSCs 細胞培 養基中加入適量轉BDNF基因的AAV病毒液，37°C 5% CO2中孵育2天，經Western blot檢 測能表達BDNF。細胞培養擴增至3 X IO6左右進行凍存，共三管，每管IXlO6左右。4、人骨髓單個核細胞的製備53歲成人，參照實施例一的方法製備骨髓單個核細 胞，細胞總數為2. BXlO805、UBMSCs和TUBMSCs作為飼養層細胞的製備收集第3代的UBMSCs和TUBMSCs，分 別加入絲裂黴素C (浙江海正藥業，國藥準字H33020786，100 μ g/ml，用DMEM培養基配製) 處理lh，用DMEM培養液洗滌4次，用骨髓MSCs培養基稀釋成0. 5 X 105/ml細胞濃度待用。6、分組試驗1)對照組成人骨髓單個核細胞，用骨髓MSCs培養基稀釋成IX 106/ml加入24孔 板中，每孔0. 5ml，每組4孔。2)UBMSCs飼養層細胞對照組(對照U)絲裂黴素處理後的UBMSCs，0. 25X 105/ml 細胞濃度加入以24孔板內，每孔0. 5ml，每組4孔。3) TUBMSCs飼養層細胞對照組(對照T)絲裂黴素處理後的TUBMSCs，0. 25 X IO5/ ml細胞濃度加入以24孔板內，每孔0. 5ml，每組4孔。4) UBMSCs飼養層細胞+成人骨髓單個核細胞培養實驗組(實驗U)用骨髓MSCs 培養基調整細胞終濃度為絲裂黴素處理後的UMSCs，0. 25XlOVml細胞濃度；骨髓小單核 細胞，1 X106/ml細胞濃度；加入24孔板中，每孔0. 5ml，每組4孔。5) TUBMSCs飼養層細胞+成人骨髓單個核細胞培養實驗組(實驗T)用骨髓MSCs 培養基調整細胞終濃度為絲裂黴素處理後的TUBMSCs，0. 25XlOVml細胞濃度；骨髓小單 核細胞，1 XlO6Ail細胞濃度；加入24孔板中，每孔0. 5ml，每組4孔。7、上述細胞於培養後第三天第一次全部換液，以後每二天換液一半，維持二周，其 間在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待有細胞生長到融合時用胰酶消化和進行細胞計 數。8、統計學處理採用t檢驗和分組方差分析，ρ <0.01顯示有顯著性差異。二、結果1、形態學觀察
對照組第一次細胞培養換液後，可見少量細胞貼壁生長，細胞形態呈多樣性，可 見少量梭形細胞生長。培養二周後梭形細胞呈增多趨勢。對照U組和對照T組細胞形態相似，第一次細胞換液後，細胞呈梭形，排列有一定 方向性，細胞生長密度約為30%，10天後細胞密度未見明顯增加。實驗U組在第一次換液後細胞呈梭形生長，至第8天細胞多呈長梭形，排列有方 向性，呈螺旋狀生長，至第10天細胞密度已達約70-80%。實驗T組在第一次換液後細胞呈梭形生長，至第8天細胞多呈長梭形，排列有方 向性，呈螺旋狀生長，至第10天細胞密度已達約90-95%。2、細胞計數，各組細胞計數結果見表2。表2，各組細胞培養至第10天時的計數結果(X士SD，η = 4) 結果提示用臍血MSCs做飼養層細胞，可使細胞擴增數量增加約6倍((實驗U組 細胞數_飼養層細胞數)/對照細胞數=5. 6)；而用轉基因臍血MSCs做飼養層細胞，可使 細胞擴增數增加10倍((實驗T組細胞數-飼養層細胞數)/對照細胞數=10. 0)。三、結論用臍血MSCs做飼養細胞，可明顯促進老年人骨髓MSCs的生長和擴增；而用轉 BDNF基因的臍血MSCs做飼養細胞，骨髓MSCs擴增更明顯。實施例九轉BDNF基因臍血MSCs對體外培養人骨髓MSCs增殖和定向分化的影 響。發明人在利用轉BDNF基因臍血MSCs促進體外培養人骨髓MSCs增殖時研究發現， 部分骨髓MSCs出現多突起的改變，狀似神經細胞。為此，發明人進行了轉BDNF基因臍血 MSCs促進體外培養人骨髓MSCs向神經細胞分化的實驗研究。一、材料和方法1、轉BDNF基因的UMSCs (transgene UMSCs, TUMSCs)和人骨髓單個核細胞的製備 見實施例五。2,TUMSCs和人骨髓單個核細胞共培養。取終濃度TUMSCs細胞，0. 25X 105/ml ；骨 髓小單核細胞，IX 106/ml細胞濃度，25cm2的培養瓶，用骨髓MSCs培養基(見實施例一)每 瓶5ml進行培養。
3、每3-4天換液1次。待貼壁細胞達80% -90%融合時，以0. 125%胰酶消化，按1 3比例傳代。
4、待細胞出現明顯的多突起時，以1 X IOVcm2接種於預鋪有蓋玻片的6孔培養板 中製備細胞爬片，以人MSCs為分化對照，同時製備細胞爬片。每孔加入含10% FBS的DMEM 培養液2ml，達80%融合時終止培養。5、以免疫細胞化學方法檢測神經細胞表面標誌物NSE的表達。人MSCs和混合培養 MSCs細胞爬片，用4%多聚甲醛室溫下固定30min，0. 2% TritonX-IOOPBS滲透細胞5min， 0. 3%過氧化氫室溫下封閉30min，羊血清封閉30min。加NSE多克隆抗體(1 400稀釋 度)，4°C孵育12h過夜。加入生物素標記的二抗，室溫下孵育30min，加入鏈酶親和素-過 氧化物酶複合物(SABC)，37°C孵育60min。DAB顯色，中性樹脂封固，光學顯微鏡觀察。二、結果1、細胞接種36h後可見少量細胞貼壁，呈梭形，類似成纖維細胞，成集落樣生長， 以後逐漸增多。培養1周左右，細胞形態開始變化，可見較多指狀突起細胞。培養至12天 時，細胞融合成片。將混合細胞傳代培養於載玻片上，五天後部分細胞呈現梭形、多角形、錐 形或星形，似神經細胞，相互接成網(見圖11)。2、細胞表面標誌物的變化載玻片上混合培養的MSCs與單純骨髓MSCs比較，細胞 NSE染色明顯增強。三、結論骨髓MSCs具有向神經細胞分化的能力，轉BDNF基因的臍血MSCs能促進MSCs向 神經細胞方向定向分化。實施例十、轉⑶NF基因臍帶MSCs對體外培養人骨髓MSCs增殖的影響。MTT比色法(噻唑藍法)主要用於檢測細胞內琥珀酸脫氫酶的活力，它可反映細 胞的增殖活力和細胞數量。本實驗用MTT法檢測轉GDNF基因臍帶MSCs對體外培養人骨髓 MSCs增殖的影響。一、材料與方法1、主要試劑見實施例一和實施例五。2、臍帶間充質幹細胞(umbilical cord MSCs, UMSCs)的分離培養(參見實施例 一)，細胞培養擴增至3 X IO6左右進行凍存，共三管，每管1 X IO6左右。3、轉 GDNF 基因的 UMSCs(transgene UMSCs, TUMSCs)的製備在 UMSCs 細胞培養基 中加入適量轉⑶NF基因的AAV病毒液，37°C 5% CO2中孵育2天，經Western blot檢測能 表達⑶NF。細胞培養擴增至3-4X106左右進行凍存，共三管，每管IXlO6左右。4、人骨髓單個核細胞的製備53歲成人，參照實施例一的方法製備骨髓單個核細 胞，細胞總數為2. BXlO805、UMSCs和TUMSCs作為飼養層細胞的製備收集第3代的UMSCs和TUMSCs，分別 加入絲裂黴素C (浙江海正藥業，國藥準字H33020786，100 μ g/ml，用DMEM培養基配製)處 理lh，用DMEM培養液洗滌4次，用骨髓MSCs培養基稀釋成0. 5 X 105/ml細胞濃度待用。6、分組試驗1)對照組成人骨髓單個核細胞，用骨髓MSCs培養基稀釋成1 X 106/ml加入96孔 板中，每孔0. 1ml，每組8孔。2)UMSCs飼養層細胞對照組(對照U)絲裂黴素處理後的UMSCs，0. 25X 105/ml細胞濃度加入以96孔板內，每孔0. lml，每組8孔。3) TUMSCs飼養層細胞對照組(對照T)絲裂黴素處理後的TUMSCs，0. 25X 105/ml 細胞濃度加入以96孔板內，每孔0. 1ml，每組8孔。4) UMSCs飼養層細胞+成人骨髓單個核細胞培養實驗組(實驗U)用骨髓MSCs培 養 基調整細胞終濃度為絲裂黴素處理後的UMSCs，0. 25 XlOVml細胞濃度；骨髓小單核細 胞，1 X106/ml細胞濃度；加入96孔板中，每孔0. 1ml，每組8孔。5) TUMSCs飼養層細胞+成人骨髓單個核細胞培養實驗組(實驗T)用骨髓MSCs 培養基調整細胞終濃度為絲裂黴素處理後的TUMSCs，0. 25XlOVml細胞濃度；骨髓小單 核細胞，1 XlO6Ail細胞濃度；加入96孔板中，每孔0. 1ml，每組8孔。7、上述細胞於培養後第三天第一次全部換液，以後隔天換液一半，第三次 換液後 48 小時，每孔加入 5mg/ml 噻唑藍(3-(4，5)-dimethylthiahiazo (_z-yl)-3， 5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)PBS 液 20ulo繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加lOOOulDMSO，振蕩 10分鐘，使結晶物充分融解。MK3型酶標儀(Thermo公司，美國)測定570nm波長附近的吸光度，計算光密度值 (OD)。8、統計學處理採用t檢驗和分組方差分析，ρ <0.01顯示有顯著性差異。二、結果各組細胞光密度值測量結果見表3。表3.轉⑶NF基因UMSCs對人MSCs生長的影響(0D值，X士 sd，η = 8) *，同對照組比較，ρ < 0. 05 ；#，同對照組比較，ρ < 0.01 ；+，同實驗U組比較，ρ < 0. 01 ；三、結論用臍帶MSCs做飼養細胞，可明顯促進老年人骨髓MSCs的生長；而用轉⑶NF基因 的臍帶MSCs做飼養細胞，骨髓MSCs生長更明顯。序列表(SEQUENCELISTING)廣州和竺生物科技有限公司表達神經營養因子家族相關基因的間充質幹細胞及其應用6
PatentIn version 3. 4
161DNA人工合成1gtgctagcca tatgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt cttgcacttg 60t61252DNA人工合成2actaagtctt gcacttgtca caaacagttc tgagaagaag cgccggggat ca52334DNA人工合成3tcaagcttgg atcctcagat acatccacac cttt34464DNA人工合成4gtccatggcc cgggatgtac aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac 60ttgt64555DNA人工合成5actaagtctt gcacttgtca caaacagtca ctctgaccct gcccgccgag gggag55641DNA人工合成6gcctctagaa agcttctatc ttcccctttt aatggtcaat g4權利要求
一種能表達神經營養因子家族相關基因的間充質幹細胞，其特徵在於，所述間充質幹細胞是按以下步驟製備的A)從骨髓、臍帶或臍血中提取幹細胞；B)採用腺相關病毒或者其它病毒載體或非病毒載體為載體，將神經營養因子家族相關基因重組到AAV載體上；C)製備表達神經營養因子家族相關基因的AAV；D)將上述AAV顆粒感染分離、純化的間充質幹細胞，得到表達神經營養因子家族相關基因的間充質幹細胞。
2.根據權利要求1所述的間充質幹細胞，其特徵在於所述間充質幹細胞的提取分離 方法採用密度遞度離心法、免疫吸附法、流式細胞分篩法和細胞貼壁生長法。
3.根據權利要求1所述的間充質幹細胞，其特徵在於所述步驟B中，所述的其它病毒 載體或非病毒載體包括腺病毒載體、皰疹病毒、慢病毒、逆轉錄病毒等現行常用病毒載體 或非病毒載體如轉座子、原核或真核表達載體。
4.根據權利要求1所述的間充質幹細胞，其特徵在於所述步驟C中，所述的所述神經 營養因子家族相關基因包括膠質細胞源性神經營養因子即GDNF和腦細胞源性神經營養因 子即BDNF。
5.根據權利要求1所述的間充質幹細胞，其特徵在於所述步驟B中，包括以下步驟a)神經營養因子家族相關基因的克隆及其N未端的構建；b)含神經營養因子家族相關基因表達盒的AAV載體的構建。
6.根據權利要求4所述的間充質幹細胞，其特徵在於所述步驟a中，所述神經營養因 子家族相關基因包括膠質細胞源性神經營養因子即GDNF和/或腦細胞源性神經營養因子 即 BDNF。
7.根據權利要求4所述的間充質幹細胞，其特徵在於所述步驟b中，所述神經營養 因子家族相關基因包括膠質細胞源性神經營養因子即GDNF和腦細胞源性神經營養因子即 BDNF,所構建的AAV載體為pAAV-MCS載體。
8.如權利要求1所述的間充質幹細胞用於促進骨髓幹細胞或神經幹細胞的培養擴增 的飼養層細胞的用途。
9.如權利要求1所述的間充質幹細胞用於促進骨髓幹細胞或神經幹細胞的定向分化 的飼養層細胞的用途。
10.如權利要求1所述的間充質幹細胞用於製備治療神經系統疾病如腦血管疾病、運 動神經元病和脊髓損傷等的藥物製劑的用途。
全文摘要
本發明涉及一種骨髓、臍帶或臍血間充質幹細胞及其在細胞移植、幹細胞培養、擴增與定向分化領域的用途。本發明所述的表達神經營養因子家族相關基因的間充質幹細胞，該間充質幹細胞是按以下步驟製備的從骨髓、臍帶或臍血中提取間充質幹細胞；採用腺相關病毒(AAV)為載體，將神經營養因子家族相關基因重組到AAV載體上；製備表達神經營養因子家族相關基因的AAV；將上述AAV顆粒感染分離、純化的間充質幹細胞，得到表達神經營養因子家族相關基因的間充質幹細胞。本發明將其作為飼養層細胞為幹細胞培養、擴增和定向分化提供人工可控的微環境，促進幹細胞增殖和定向分化，以達到為人類疾病提供一種新的治療手段。
文檔編號A61K35/28GK101857854SQ20091003858
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月13日 優先權日2009年4月13日
發明者李遠友, 王尚武, 鄒清雁, 陳文明 申請人:廣州和竺生物科技有限公司