一種從人血漿中提取高密度脂蛋白及分離純化載脂蛋白apoA-I的方法
2023-12-06 17:45:16
一種從人血漿中提取高密度脂蛋白及分離純化載脂蛋白apoA-I的方法
【專利摘要】本發明提供一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白（HDL）及分離純化高純度載脂蛋白apoA-I的方法。它包括以下步驟：1）用中性鹽調節血漿到不同密度，採用序列梯度密度超速離心法，排除雜蛋白，獲取高純度HDL組分；2）獲得的高純HDL組分在低溫冷凍狀態下用一定比例醇醚溶劑進行流加法脫脂獲取脫脂後apoHDL沉澱；3）用含1-8M尿素的TBS緩衝液體系復溶apoHDL沉澱並過濾，濾液先後經過分子篩層析和陰離子交換層析，分離純化獲得高純度的apoA-I溶液。本發明的方法能夠將很難除掉的白蛋白組分與HDL分離，本方法製備的apoA-I具有非常高的純度和活性，純度可達98%以上，被倍比稀釋64倍後仍能與抗血清發生清晰沉澱反應，且操作安全方便，提取周期短，適於工業化生產。
【專利說明】一種從人血漿中提取高密度脂蛋白及分離純化載脂蛋白apoA-1的方法
【技術領域】
[0001]本發明生物【技術領域】，具體涉及一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白(HDL)及分離純化高純度載脂蛋白apoA-1的方法。
【背景技術】
[0002]流行病學調查表明，血漿高密度脂蛋白(HDL)水平與動脈粥樣硬化(AS)發病率呈負相關，並具有對抗AS的作用。
[0003]HDL主要由載脂蛋白和脂質組成，是血漿中密度最高但組成極不均一的一類脂蛋白。HDL中的蛋白質主要由apoA-1和apoA-1I構成，另還含有少量的apoA-1V、C1、CI1、CIII及E，其中apoA-1的含量最多而且又是HDL的主要功能蛋白質，因此用apoA_I的含量就可以反映HDL的含量，間接診斷AS的發病與否。apoA-1還具有抗炎抗內毒素的功能，因此是脂類代謝研究的重點之一。由於apoA-1具有肝臟靶向作用的特點，在靶向藥物研究中也有良好的應用前景。
[0004]目前，獲得HDL的常用方法為超速離心法、聚合物及鹽離子序列沉澱法等，但這些方法具有一些不可避免的缺點:1)處理方法繁瑣，因HDL是血漿中密度最高但組成極不均一的一類脂蛋白，成分和條件複雜，無法僅靠沉澱法就能將HDL與其他成分完全分開，尤其是在血漿中含量最為豐富的白蛋白，而一旦在提取HDL階段引入白蛋白，很難在後續色譜純化中將其剔除；2)沉澱法整個處理過程需要將HDL組分經歷多次液相/固相轉換過程，處理期間溫度變化頻繁易導致HDL中所含蛋白氧化、變性，進而導致蛋白活性損失，無法後續利用。雖然超速離心法需要昂貴的儀器設備，但要獲得高純度、高活性的HDL及其蛋白組分，超速離心法仍然是目前提取的最佳`選擇。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，研究設計一種超速離心法獲取高純度HDL的方法，尤其適用於對HDL及apoA-1的純度要求非常高的原料的獲取。
[0006]本發明提供了一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白(HDL)及分離純化高純度載脂蛋白apoA-1的方法。
[0007]該方法包括下列步驟:
[0008]I)血漿組分用中性鹽調節密度至L05-L 15g/ml，30000-80000rpm超速離心10-30h,收集下層深黃色組分I ;
[0009]2)組分I用中性鹽調節密度至1.15-1.35g/ml, 30000-80000rpm超速離心10_30h，
收集上層淺黃色組分II ；
[0010]3)配置密度為1.15-1.35g/ml中性鹽水溶液，組分II和中性鹽水溶液按體積比1:3-5 (V/V)混合，並調節混合溶液密度至1.15-1.35g/ml，30000-80000rpm超速離心5_30h，收集上層淺黃色組分III ;[0011]4)重複步驟3) 1-3次，收集獲取上層淺黃色組分，即為除去雜蛋白的高純度HDL ；
[0012]5)採用改進Scanu (1971)法對HDL進行低溫醇醚脫脂，得apoHDL沉澱；
[0013]6)復溶apoHDL沉澱並過濾；
[0014]7)步驟6)的濾液利用GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統，先後經分子篩層析及陰離子交換層析，純化獲得高純度的apoA-1溶液。
[0015]所述步驟I)中血漿為健康人群捐獻的正常人血漿；
[0016]所述步驟1)、2)、3)中調節密度所使用的中性鹽優選而不局限於KBr、NaBr、NaCl、KCl，最優選NaBr。
[0017]所述步驟1)、2)、3)中超速離心的轉速為30000-80000rpm，優選而不局限於50000rpmo
[0018]所述步驟1)、2)、3)中超速離心的離心時間為5_30h，優選而不局限於24h。
[0019]所述步驟4)中使用生理鹽水配置的密度為1.15-1.35g/ml，優選1.21g/mlNaBr密度液稀釋HDL粗提組分，30000-80000rpm,優選而不局限於50000rpm，離心10-24小時，優選而不局限於24h，收集上層淺黃色組分；重複次數為1-3次，優選而不局限於2次。
[0020]所述步驟5)中脫脂方法為改進Scanu (1971)法，使用的無水乙醇/無水乙醚的體積比為1-5:1，優 選而不局限於3:2。
[0021]所述步驟6)中復溶apoHDL的復溶液為25mM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽)緩衝液，內含尿素濃度為3-8M，優選而不局限於6M，復溶液的pH為7.0-9.0，優選而不局限於8.0。
[0022]所述步驟6)復溶後溶液採用0.2-0.5 μ m濾膜過濾，優選而不局限於0.22 μ m。
[0023]所述步驟7)中使用的分子篩層析柱為Superdex G75分子篩層析柱，使用的離子交換柱為DEAE陰離子交換層析柱。
[0024]所述步驟7)中分子篩層析的步驟為:用如上所述的步驟6)的蛋白復溶液為分子篩層析液，層析液中添加離子強度為50-350mM的NaCl，優選而不局限於150mM的NaCl，以降低凝膠的非特異性吸附；洗脫流速為0.5-2ml/min，優選而不局限於lml/min ;上樣體積為層析柱柱床體積的1-5%,優選而不局限於3% ；
[0025]所述步驟7中DEAE陰離子交換層析的步驟為:已經分子篩層析初步純化的apoA-1層析液調整為ρΗ7.0-9.0，優選而不局限於8.0, Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽)緩衝液濃度為10-30mM,優選而不局限於25mM (內含尿素濃度為3-8M,優選而不局限於6M)後上DEAE陰離子交換柱，然後採用0-1M的NaCl線性洗脫，獲得高純度的apoA_I溶液。
[0026]本發明方法通過調節不同的浮選密度搭配，利用序列超速離心法，很好的將血漿中豐度非常高並與HDL物理性質相近的白蛋白雜質與HDL分開，解決了以往傳統HDL提取方法中仍含有少量白蛋白的難點，尤其適用於對HDL及apoA-1的純度要求非常高的原料的獲取。本方法製備的apoA-1具有非常高的純度和活性，純度可達98%以上，被倍比稀釋64倍後仍能與抗血清發生清晰沉澱反應，且操作安全方便，提取周期短，適於工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1Superdex G75分子篩層析圖譜；[0028]圖2Superdex G75分子篩層析分組分收集後SDS-PAGE圖譜:
[0029]Marker:自上而下 97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD ；
[0030]條帶1:HDL ;條帶2:G75峰I ;條帶3:G75峰1、峰2交叉組分；條帶4:G75峰3 ；
[0031]圖3DEAE陰離子交換層析圖譜；
[0032]圖4DEAE陰離子交換層析後SDS-PAGE圖譜:
[0033]Marker:自上而下 97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD ；
[0034]從左至右條帶2為純化後apoA-1 ；
[0035]圖5BCA法測總蛋白含量擬合直線圖譜:
[0036]X軸:標準蛋白濃度(微克/毫升)'Y軸:標準蛋白A570吸光度值；
[0037]擬合公式:y=0.0Ollx+0.1402 ;線性相關係數:R2=0.9965。
【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。`
[0039]以下原料通過市售得到。
[0040]實施例1:超速離心法提取HDL
[0041]正常人血漿500ml用溴化鈉(分析純)調密度(Dl)到1.09g/ml,日立離心機超速離心50000rpm，8°C，24hr ;棄去離心管頂部黃色組分，收集管底深黃色組分I，用溴化鈉調密度(D2)到1.21g/ml，相同條件下離心24hr，收集離心管上層三分之一的淺黃色組分II約120ml，再用2倍體積的密度為1.21的溴化鈉溶液稀釋混勻，日立離心機超速離心50000rpm, 8°C，24hr,相同條件下重複一次,得到頂層淺黃色組分為純HDL約20ml。
[0042]實施例2:改進Scanu法脫脂
[0043]將實施例1離心獲得的HDL溶液20ml超濾濃縮到較高濃度，低溫(_21°C )條件下逐滴滴加到700ml的-21 °C預冷的無水乙醇/無水乙醚(V/V)3:2中，-21V條件下攪拌6hr，靜置過夜，_4°C條件下5000rpm離心lOmin，去上清，留沉澱，將沉澱復溶於無水乙醇/無水乙(V/V) 3:2，重複以上步驟一次，後將沉澱復溶於預冷的50ml無水乙醚中，離心去除上清，將沉澱在通風處揮幹，_21°C保存即為脫脂後apoHDL。
[0044]實施例3:apoHDL的分子篩層析純化
[0045]將實施例2脫脂後apoHDL約500mg復溶在IOml 25mM Tris-HCl緩衝液(內含0.1%EDTA、0.1% NaN3、150mM NaCl、6M 尿素)，pH 8.0，使 apoHDL 終濃度達 50mg/3ml，0.22 μ m 過濾後上樣:採用GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統,Superdex G75分子篩層析預裝柱，洗脫流速為lml/min，分吸收峰收集，層析圖譜及電泳圖譜見圖1、2。
[0046]實施例4:apoA-1的陰離子交換層析精細純化
[0047]將實施例3收集分子篩層析所得的峰組分約40ml，用25mM Tris-HCl緩衝液(內含0.1% EDTA、0.1% NaN3、、6M尿素)，pH 8.0透析，不斷更換透析液以降低離子強度，然後過DEAE陰離子交換柱:採用25-1000mM NaCl線性洗脫，洗脫體積為10個柱床體積，收集apoA-1組分，層析圖譜及電泳圖譜見圖3、4。[0048]實例5:純化apoA-1純度的鑑定
[0049]將實施例4純化後組分的總蛋白含量用BCA法蛋白濃度定量試劑盒
(ThermoFisher公司pierce? BCA Protein Assay Kit)檢測；BCA法是世界上常用的蛋白濃
度監測方法之一，參考文獻:Smith, P.K.etal.Anal.Biochem.，150，76-85 (1985).[0050]擬合曲線(見圖5)後代入公式y=0.0011x+0.1402測得純化後組分總蛋白濃度為
0.849*2=1.699mg/ml;
[0051]組分中apoA-1的濃度用市售上海復星長徵醫學科學有限公司生產的人載脂蛋白
A/B定量檢測試劑盒，在全自動生化檢測分析儀(日立AU400)上檢測，在全自動生化檢測分
析儀上檢測，檢測到PA含量為1.67mg/ml;
[0052]apoA-1 純度為(1.67/1.699) *100%=98.3%。
[0053]。
[0054]表1BCA法測總蛋白含量標準蛋白與待測蛋白的A5700D值
[0055]
【權利要求】
1.一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白及分離純化高純度載脂蛋白apoA-1的方法，其特徵在於，該方法包括下列步驟: 1)血漿組分用中性鹽調節密度至1.05-1.15g/ml, 30000-80000rpm超速離心10_30h，收集下層深黃色組分I ; 2)組分I用中性鹽調節密度至1.15-1.35g/ml, 30000-80000rpm超速離心10_30h，收集上層淺黃色組分II ； 3)配置密度為1.15-1.35g/ml中性鹽水溶液，組分II和中性鹽水溶液按體積比1:3-5混合，並調節混合溶液密度至1.15-1.35g/ml,30000-80000rpm超速離心5_30h，收集上層淺黃色組分III ; 4)重複步驟3)1-3次，收集獲取上層淺黃色組分，即為除去雜蛋白的高純度HDL ； 5)採用改進Scanul971法對HDL進行低溫醇醚脫脂，得apoHDL沉澱； 6)復溶apoHDL沉澱並過濾； 7)步驟6)的濾液利用GEAKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統，先後經分子篩層析及陰離子交換層析，純化獲得高純度的apoA-1溶液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟1)、2)或3)中調節密度所使用的中性鹽選自KBr、NaBr、NaCl、KCl ;優選為NaBr。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟1)、2)或3)中超速離心的轉速為 30000-80000rpm，優選為 50000rpm。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟1)、2)或3)中超速離心的離心時間為5-30h，優選為24h。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟4)中使用生理鹽水配置的密度為1.15-1.35g/ml，優選為1.21g/ml NaBr密度液稀釋HDL粗提組分；離心10-24小時，優選24h，轉速30000-80000rpm，優選50000rpm，收集上層淺黃色組分；重複次數為1-3次，優選為2次。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟5)中脫脂方法為改進Scanul971法，使用的無水乙醇/無水乙醚的體積比為1-5:1，優選3:2。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟6)中復溶apoHDL的復溶液為25mM Tris-HCl緩衝液，內含尿素濃度為3-8M，優選6M，復溶液的pH為7.0-9.0，優選8.0。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟6)復溶後溶液採用0.2-0.5 μ m濾膜過濾，優選0.22 μ mo
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟7)中使用的分子篩層析柱為Superdex G75分子篩層析柱,使用的離子交換柱為DEAE陰離子交換層析柱。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟7)中分子篩層析的步驟為:用如上所述的步驟6)的濾液蛋白復溶液為分子篩層析液，層析液中添加離子強度為50-350mM 的 NaCl，優選 150mM 的 NaCl，；洗脫流速為 0.5-2ml/min,優選 lml/min ;上樣體積為層析柱柱床體積的1_5%，優選3% ;已經分子篩層析初步純化的apoA-1層析液調整為PH7.0-9.0，優選而不局限於8.0, Tris-HCl緩衝液濃度為10_30mM，優選25mM，內含尿素濃度為3-8M，優選6M後，上DEAE陰離子交換柱，然後採用0-1M的NaCl線性洗脫，獲得高純度的apoA-1溶液。
【文檔編號】C07K14/775GK103833840SQ201210492192
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月27日 優先權日:2012年11月27日
【發明者】張海濤, 張躍建, 孫衛兵 申請人:上海復星醫藥（集團）股份有限公司, 上海復星長徵醫學科學有限公司