一種助陽離子擴散蛋白DbsCDF及其編碼基因和應用的製作方法

2023-11-30 02:51:26

專利名稱：一種助陽離子擴散蛋白DbsCDF及其編碼基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物基因工程，和生物修復領域。具體地說，本發明提供了生活在酸性礦山廢水(acid mining drainage, AMD)的一種未知微生物所含有的一種對重金屬鎘抗性的基因即助陽離子擴散蛋白基因(DbsCDF)的序列，以及該序列推測編碼蛋白質分子的胺基酸序列。本發明在提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性方面有著重大的應用價值
背景技術：
隨著礦產資源的開發利用、工業發展，重金屬對環境造成的汙染日趨嚴重，土壤重金屬汙染已經成為一個危害全球環境質量的問題。土壤重金屬會影響植物的生長發育，降低農作物的產量和質量，帶來了嚴重的經濟損失。此外，受土壤重金屬汙染的作物在植物體中積累，並通過食物鏈富集到人體和動物體中，危害人畜健康，引發癌症和其他疾病等。治理重金屬汙染刻不容緩，各種修復技術和措施正在研究和應用中。各國政府和科學家著力通過兩個途徑解決這一問題一為利用物理的，化學的方法試圖清除土壤或水體的重金屬汙染二為利用現代生物技術清除汙染。自從20世紀80年代以來，生物修復技術因其具有處理費用低、對環境影響小、效率高等優點，越來越受到廣大科技人員的廣泛關注。生物修復一般分為植物修復、動物修復和微生物修復三種類型，其中植物修復和微生物修復是研究的熱點。微生物修復就是利用微生物將環境中的汙染物降解或轉化為其他無害物質的過程。近年來，基於微生物對重金屬的作用機理，以修復有毒有害金屬汙染或回收有經濟價值重金屬為目的的生物處理技術日趨成熟。植物修復指利用植物去治理水體、土壤和底泥等介質中的汙染的技術。然而用於重金屬汙染修復的生物往往會受到重金屬的毒害，生長緩慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金屬對植物和微生物的毒害作用是生物修復的主要限制因素。解決生物修復中重金屬對生物的毒害作用的根本途徑在於研究耐受重金屬的分子生物學機制，克隆對重金屬耐受的關鍵基因，通過基因工程手段獲得用於生物修復中性能優良的轉基因工程生物。由於技術上的原因，直到最近，對微生物基因資源的利用主要局限於可培養微生物。然而，已培養微生物僅佔自然界中微生物的不到1%，因此各種生境中的微生物宏基因組是一個巨大而未發掘的基因資源庫。極端環境具有豐富的微生物資源，當中許多與逆境和關鍵生命過程相關的基因在長期的適應進化中獲得了更強的耐性潛能，發掘這些抗性基因已成為國際重要的研究熱點。酸性礦山廢水(AMD)是極端生境微生物學研究的重要系統。AMD來源於採礦活動使含硫礦物(主要為黃鐵礦，FeS2)暴露於空氣和水中，在微生物催化作用下迅速氧化產酸所致，其PH值一般在1-4左右，而且富含硫酸鹽以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金屬，是採礦業面臨的最嚴重環境問題之一。在AMD中生存的原核微生物在長期的進化過程中逐漸形成了一些獨特機制，以應對低PH值、高鹽度以及高重金屬等多種極端環境協迫。因此，AMD生境成為極具特色和豐富的抗逆基因庫。助陽離子擴散蛋白(cation diffusion facilitator, Q)F)家族具有耐重金屬作用，存在於很多種生物體液泡膜上。非直接的證據顯示這些蛋白質具有運輸作用，既可以將金屬離子運輸入細胞內，也可以將金屬離子輸出細胞。並且CDF蛋白質有助於多數生物體對Zn2+、Cd2+、Co2+、Ni2+的耐受性。不同來源的⑶F家族蛋白質在結構上有著一些共性N-端信號序列，6個跨膜區，C-端陽離子輸出域，在大多數真核生物中，還存在胞內His富集域，而在原核生物中沒有。在擬南芥中有8個基因編碼的蛋白質屬於CDF家族，4種具有上述結構特徵，而其他幾種(AMtTPcl AtMTPc4)的結構略有不同包含4_5個跨膜結構域，其中3種只具有部分N-端信號序列，並缺乏His富集域。擬南芥AtMtTPl的主要功能是提高細胞的金屬耐性。有研究顯示=AtMtTPl可以對Zn2+的毒害起解毒作用。如果在光滑爪蟾卵母細胞中表達AtMTPl，則可富集更多的Zn2+。此外，通過將有鉤柱花草cDNA文庫在啤酒酵母中的表達，鑑定出4種相關的⑶F蛋白，其中ShMTPl對Mn2+有耐性。而Persuns等人從野生芥末中分離出TgMTPs基因，它編碼的CDF蛋白可以恢復啤酒酵母COTl和ZRCl (酵母中對Zn2+和Co2+有耐性的⑶F蛋白)突變體耐重金屬的能力。由上可見，植物中⑶F基因在重金屬脅迫下扮演非常重要的角色。然而，迄今為止 ⑶F基因在微生物中對重金屬鎘抗性究竟起什麼作用仍不清楚，也沒有從AMD微生物中克隆到⑶F基因的報導。AMD中重金屬含量極高，但AMD微生物中哪些基因對重金屬抗性起著關鍵作用？⑶F基因是否對AMD微生物的生長和生存起著重要的作用？這些都是目前尚未解決的問題。

發明內容
本發明的目的在於提供AMD微生物中的助陽離子擴散蛋白，以及編碼該蛋白的新基因，為今後開發基因工程產品奠定物質基礎。在本發明的一個方面，提供了一種重金屬鎘抗性蛋白(酸性礦山廢水微生物中助陽離子擴散蛋白)，在本發明中稱為DbsCDF蛋白，它為如下蛋白分子⑴或(ii)(i)具有如SEQ ID NO 1所述的胺基酸序列；(ii)在入SEQ ID NO :I所限定的胺基酸序列經過取代，缺失或疊加一個或幾個胺基酸衍生的蛋白質與(i)的蛋白質具有相同的功能。在本發明的另一個方面，提供了一種DNA分子，它包括編碼所述的助陽離子擴散蛋白的核苷酸序列。發明發現Dbs⑶F蛋白具有金屬鎘抗性作用，可以在治理環境鎘汙染中應用。發明同時保護了該蛋白的編碼基因，具有如SEQ ID NO :2所示的序列；以及該基因在治理環境鎘汙染中的應用。發明用表達Dbs⑶F的基因工程菌作為試驗對象，發現在鎘脅迫下，其鎘耐受性大大高於非基因工程菌。在鎘離子濃度為200 u M以下時，尤其是150M以下時，仍有較高的存活率。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果本發明從AMD微生物中克隆了一個新的助陽離子擴散蛋白基因，命名為Dbs⑶F，並對其對重金屬鎘的抗性進行了功能分析。通過大腸桿菌轉化實驗證明該基因可以提高大腸桿菌中對鎘的抗性。應用本發明的基因序列或胺基酸序列進行轉基因開發基因工程產品面具有重大的應用價值，具體來說可用於培育高生物量的重金屬超富集植物或微生物，用於重金屬汙染土壤和水體的生態修復。


附圖I為Dbs⑶F在大腸桿菌中的表達時相；其中M :蛋白分子量標準
I :攜帶空載體pET28a的BL21 (DE3)菌株2-9 :攜帶 pET28a-DbsCDF 的 BL21(DE3)菌株分別誘導表達 O、1、2、3、4、5、6、7 小時。附圖2為表達與不表達Dbs⑶F的大腸桿菌在150 ii M鎘脅迫下的生長曲線。附圖3為表達與不表達Dbs⑶F的大腸桿菌在不同鎘濃度下培養12小時後的生長情況。
具體實施例方式實施例IDbs⑶F基因全序列的克隆野外微生物樣品採集在雲浮鉛/鋅礦選取不同酸化階段(以pH為標準)的AMD，使用0. 22 y m的濾膜收集20LAMD裡面的細胞。為了保持核酸的完整保存，保存樣品凍於液氮中，24小時內帶回實驗室，並放於-70°C冰箱長期保存。核酸的提取DNA提取採用SET方法，過程如下向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化30min後，15, OOOrpm離心15min後用氯仿抽提2次,用異丙醇沉澱過夜後,75%乙醇清洗2次，最後溶於滅菌水中。用Qiagen tip-100柱純化回收基因組DNA,用核酸蛋白分析儀檢測DNA質量及濃度。基因組測序用Roche 公司的 GS FLX Titanium General Library Preparation Kit 製備上機樣品。使用Roche 454Genome Seqencer FLX測序儀,通過進行測序,用Pyrobayer軟體獲取喊基序列。基因組序列分析去除低質量的測序結果後，對基因組進行如下分析序列拼接使用Euler-SR 及 454 公司的 GS De Novo Assembler Software 進行序列拼接。用N50指數評價拼接的效果；基因組注釋將拼接好的微生物的全基因組序列用MG和SEED系統進行基因組的注釋，發現新的基因。Dbs⑶F基因片段的克隆通過PCR方法以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物(在上遊和下遊引物分別引入不同的酶切位點)，PCR獲得一條Ikb大小的條帶，並克隆到PCR2. 1(購自invitrogen公司)載體中，序列委託invitrogen公司測定。DbsCDF基因序列分析
測序結果表明DbsCDF基因大小為957bp (見SEQ ID NO :2)，編碼318個胺基酸(見SEQ ID N0:1)。根據PSORT分析，Dbs⑶F基因表達產物很可能是細胞膜蛋白。實施例2Dbs⑶F基因的功能分析本實施例中利用大腸桿菌轉化實驗分析DbsCDF基因的功能。 構建重組表達載體設計以下一對引物，在Dbs⑶F基因5』引入BamHI酶切位點，3』引入XhoI酶切位點。DbsCDF-F(SEQ ID NO 3)5， CGCGGATCCATGGCACACGATTCTCATGACC3，DbsCDF-R(SEQ ID NO 4)5， CCGCTCGAGTCAAACCCGATGATCCGGC3』以PCR2. I-Dbs⑶F載體為模板進行PCR。分別將PCR產物和酵母穿梭表達載體pET28a用BamHI和XhoI進行酶切，將酶切產物回收、連接、並轉化大腸桿菌DH5 a。經測序並酶切鑑定，得到了 pET28a-DbsCDF重組子。蛋白表達將重組子pET28a_DbsCDF轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，通過PCR驗證篩選陽性克隆。挑取含重組質粒的菌體單斑至IOml LB (含Kan50 u g/ml)中37°C過夜培養。將Iml菌液加入到含100ml LB培養基(含Kan50 u g/ml)，37°C震蕩培養至0D600約為0. 4-1. 0 (最好0. 6，大約需2hr)。加入IPTG至終濃度為ImM進行誘導，每隔I小時收集Iml菌液，離心12000gX60s收穫沉澱，用80iil ddH20重懸，加入20iil 5 X SDS-PAGE上樣緩衝液，混勻，沸水浴lOmin。取上清作為樣品做SDS-PAGE分析(見附圖I)。轉化子對重金屬鎘抗性的測定挑取含重組質粒的菌體單斑至IOml LB (含Kan 50 U g/ml)中37°C過夜培養。將IOOul 菌加入至Ij IOml Cd2+濃度分別為 0iiM、50iiM、100iiM、150iiM、200iiM 的 LB 培養基(含 Kan 50 u g/ml, IPTGlmM)中，37°C、200rpm 震蕩培養 12 小時，分別測定 0D600 值。根據實驗結果，選取Cd2+濃度為150 PM作為脅迫條件，進行了生長曲線的測定。挑取含重組質粒的菌體單斑至IOml LB (含Kan 50 u g/ml)中37°C過夜培養。將IOOul菌加入至Ij IOml Cd2+濃度為 150 PM 的 LB 培養基(含 Kan 50 u g/ml, IPTGlmM)中，37°C、200rpm震蕩培養，每隔2小時測定0D600值。實驗結果表明，表達Dbs⑶F基因的BL21(DE3)在0_200iiM Cd2+濃度下都可以正常生長，而空載體對照在Cd2+濃度超過150 ii M時便不能生長(見附圖2)。在150 ii MCd2+濃度下，表達Dbs⑶F基因的BL21(DE3)在培養過程中都可以生長，而空載體對照的生長一直受到抑制(見附圖3)。實驗結果說明，Dbs⑶F對重金屬鎘的防禦起著重要作用。SEQ ID NO 1MAHDSHDHAGHTAGHHHTHAHSHAHGPANYGRAFAIGVALNLSFVLAEVVFGMIGHSLALLADAGHNMSDILGLLMAWGATALSRRQPSARFTYGLRSSSILVALANAVFLLVVTGGIAWEAIQRLLHPTPVASDIVIGVAAFGVAINTGTALLFMAGRK⑶LNIRAAFLHMA⑶AAVSLGVVLAGIGMLFTGffFffLDPTVSLLISAVIVIATffGLLRDSLNLTLHGVPEGIETQAVRAYLAALPDVAAVHDLHIWAMSTTETALTVHLVMPNGYP⑶ALLNRISNELQRRFRI卜
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權利要求
1.一種助陽離子擴散蛋白，其特徵在於胺基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.權利要求I所述的蛋白作為金屬鎘抗性相關蛋白的應用。
3.權利要求I所述的蛋白在治理環境鎘汙染中的應用。
4.編碼權利要求I所述的助陽離子擴散蛋白分子的核苷酸序列，其特徵在於核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.如權利要求4所述的核苷酸序列在治理環境鎘汙染中的應用。
6.含有權利要求4所述核苷酸序列的表達載體。
7.一種基因工程菌，其特徵在於是由權利要求6所述的表達載體轉染大腸桿菌得到的。
8.如權利要求7所述基因工程菌在治理環境鎘汙染中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於環境鎘汙染中的鎘離子濃度為200剛以下。
10.權利要求I或3所述的蛋白或核苷酸序列在開發金屬鎘抗性轉基因工程產品上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種金屬鎘抗性相關蛋白DbsCDF及其編碼基因和應用。該鎘抗性相關蛋白DbsCDF胺基酸序列如SEQIDNO:1所示，其編碼基因如SEQIDNO:2所示。通過轉化大腸桿菌實驗證明該基因在大腸桿菌中的表達可以提高其對重金屬鎘的抗性。本發明的DbsCDF編碼基因可用於提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性，進一步用於清除環境重金屬汙染，為生物修復提供性能優良的生物資源。
文檔編號C12R1/19GK102617711SQ20121007983
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者俞陸軍, 廖斌, 束文聖, 胡敏, 許光遠, 謝麗娟, 陳亮 申請人:中山大學