Ca6抗原特異性細胞毒性偶聯物及其應用方法

2023-11-07 14:53:02

專利名稱：Ca6抗原特異性細胞毒性偶聯物及其應用方法
技術領域：
本發明涉及鼠抗-CA6糖表位(glycotope)單克隆抗體及其人源化或表面重構形式(humanized or resurfaced versions)。本發明也涉及抗-CA6糖表位單克隆抗體的表位結合片段(epitope-binding fragments)，以及抗-CA6糖表位單克隆抗體的人源化或表面重構形式的表位結合片段。
本發明進一步涉及包含細胞結合劑和細胞毒性試劑的細胞毒性偶聯物，包含所述偶聯物的治療組合物，應用所述偶聯物來抑制細胞生長和治療疾病的方法，及包含所述細胞毒性偶聯物的試劑盒。具體而言，細胞結合劑為單克隆抗體或其表位結合片段，其識別並結合CA6糖表位或其人源化或表面重構形式。
背景技術：
對開發抗癌治療劑已經有很多的嘗試，抗癌治療劑需要特異性地靶向癌細胞，而不傷害周圍的非癌細胞和組織。這樣的治療劑有潛力極大改善在人患者中的癌症的治療。
一個有前景的方法是連接細胞結合劑例如單克隆抗體與細胞毒性藥物(Sela等，在Immunoconjugates 189-216(C.Vogel，ed.1987)；Ghose等，在TargetedDrugs 1-22(E.Goldberg，ed.1983)；Diener等，在Antibody mediated delivery systems1-23(J.Rodwell，ed.1988)；Pietersz等，在Antibody mediated delivery systems 25-53(J.Rodwell，ed.1988)；Bumol等，在Antibody mediated delivery systems 55-79(J.Rodwell，ed.1988)。取決於對細胞結合劑的選擇，基於在這樣的細胞的表面上所表達的分子的表達情況，這些細胞毒性偶聯物可以被設計為僅僅識別和結合特定類型癌細胞。
細胞毒性藥物，例如甲氨蝶呤、柔紅黴素、阿黴素、長春新鹼、長春鹼、美法侖、絲裂黴素C和苯丁酸氮芥已被用在這樣的細胞毒性偶聯物中，其被連接到各種鼠單克隆抗體上。在一些情形中，藥物分子通過中間載體分子被連接到抗體分子上，中間載體分子例如血清白蛋白(Garnett等，46 Cancer Res.2407-2412(1986)；Ohkawa等，23Cancer Immunol.h-nmunother.81-86(1986)；Endo等，47Cancer Res.1076-1080(1980))，葡聚糖(Hurwitz等，2 Appl.Biochem.25-35(1980)；Manabi等，34 Biochem.Pharmacol.289-291(1985)；Dillman等，46 Cancer Res.4886-4891(1986)；Shoval等，85 Proc.Natl.Acad.Sci.8276-8280(1988))，或聚穀氨酸(Tsukada等，73 J.Natl.Cane.Inst.721-729(1984)；Kato等，27 J.Med.Chem.1602-1607(1984)；Tsukada等，52 Br.J.Cancer 111-116(1985))。
已經顯現出一些前景的特異性偶聯物的例子為C242抗體和美登素衍生的DM1的偶聯物，C242抗體針對CanAg，CanAg為表達在結腸直腸和胰腺瘤上的抗原(Liu等，Proc Natl Acad Sci USA，938618-8623(1996))。在體外對該偶聯物的評價顯示，它對表達在細胞表面上的CanAg的結合親和力很高，其表觀Kd值為3×10-11M，而且它對CanAg陽性細胞的細胞毒性效力(potency)很高，其IC50為6×10-11M。此細胞毒性是抗原依賴性的，因為細胞毒性作用被過量的非偶聯抗體阻斷，而且因為抗原陰性細胞對該偶聯物的敏感性要低大於100倍。對各自的靶細胞具有高親和力以及具有高抗原選擇性細胞毒性的抗體-DM1偶聯物的其它例子包括huN901的偶聯物，其為抗人CD56抗體的人源化形式；huMy9-6的偶聯物，其為抗CD33抗體的人源化形式；huC242的偶聯物，其為抗CanAg Muc1表位的抗體的人源化形式；huJ591的偶聯物，其為抗PSMA的脫免疫抗體(deimmunized antibody)；曲妥珠單抗，其為抗Her2/neu的人源化抗體；和bivatuzumab，其為抗CD44v6的人源化抗體。
在不斷改進用於治療癌症患者的方法中，開發特異性識別特定類型癌細胞的其它的細胞毒性偶聯物將是重要的。
為了此目標，本發明涉及抗體的開發，所述抗體識別並結合表達在癌細胞表面上的分子/受體，和涉及新型細胞毒性偶聯物的開發，所述偶聯物包含細胞結合劑例如抗體和細胞毒性試劑，所述細胞毒性試劑特異靶向表達在癌細胞表面上的分子/受體。
更具體而言，本發明涉及位於由癌細胞表達的Muc1粘蛋白受體上的新CA6唾液糖表位(sialoglycotope)的表徵，涉及抗體的預備，優選人源化抗體，其識別Muc1粘蛋白的新CA6唾液糖表位，而且在存在細胞毒性試劑的情況下，可以被用來抑制表達CA6糖表位的細胞的生長。
發明概述[11]本發明包括抗體或其表位結合片段，所述抗體特異性識別並結合Muc1粘蛋白受體的新型CA6唾酸糖表位(sialoglycotope)。在另一個實施方案中，本發明包括人源化抗體或其表位結合片段，其識別Muc1粘蛋白受體的新型CA6唾酸糖表位(「CA6糖表位」)。
在優選的實施方案中，本發明包括鼠抗-CA6單克隆抗體DS6(「DS6抗體」)和DS6抗體的表面重構或人源化形式，其中，在輕鏈和重鏈中，抗體或其表位結合片段的暴露於表面的殘基被取代，以更接近已知的人抗體表面。本發明的人源化抗體及其表位結合片段具有改進的性質，因為與完全的鼠形式相比，它們在其被給予的人對象中具有更少的免疫原性(或完全是非免疫原性的)。因此，本發明的人源化DS6抗體及其表位結合片段特異性識別Muc1粘蛋白受體上的新型唾酸糖表位，即CA6糖表位，而對人是沒有免疫原性的。人源化抗體及其表位結合片段可以與藥物例如美登素類(maytansinoid)結合，通過將該藥物定向於Muc1 CA6唾酸糖表位，形成對抗原表達細胞具有特異細胞毒性的藥物前體(prodrug)。因此可以使用包含這樣的抗體和小的高毒性藥物(例如美登素類、紫杉類(taxanes)及CC-1065類似物)的細胞毒性偶聯物作治療劑，用於治療腫瘤，例如乳房和卵巢腫瘤。
本發明的DS6抗體的人源化形式就以下方面在本文中被完整表徵輕鏈和重鏈可變區的各自胺基酸序列，輕鏈和重鏈可變區基因的DNA序列，CDRs的鑑定，其表面胺基酸的鑑定和其以重組方式表達的方法的公開。
在一個實施方案中，提供人源化DS6抗體或其表位結合片段，其具有包含CDRs的重鏈，所述CDRs具有SEQ ID NOS1-3所示的胺基酸序列SYNMH(SEQ ID NO1)，YIYPGNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO2)，GDSVPFAY(SEQ ID NO3)，並具有包含CDRs的輕鏈，所述CDRs具有SEQ ID NOS4-6所示的胺基酸序列SAHSSVSFMH(SEQ ID NO4)，STSSLAS(SEQ ID NO5)，QQRSSFPLT(SEQ ID NO6)[15]也提供了人源化DS6抗體及其表位結合片段，其具有輕鏈可變區，所述輕鏈可變區具有這樣的胺基酸序列，即，此序列與SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示的胺基酸序列具有至少90％的序列同一性QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO7)EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO8)。
同樣地，提供了人源化DS6抗體及其表位結合片段，其具有重鏈可變區，所述重鏈可變區具有這樣的胺基酸序列，即，此序列與SEQ ID NO9、SEQ ID NO10或SEQ ID NO11所示的胺基酸序列具有至少90％的序列同一性QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO9)QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO10)QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO11)。
在另一個實施方案中，提供了人源化DS6抗體及其表位結合片段，其具有人源化或表面重構的輕鏈可變區，所述輕鏈可變區具有對應於SEQ ID NO8的胺基酸序列EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO8)。
同樣地，提供了人源化DS6抗體及其表位結合片段，其具有人源化或表面重構的重鏈可變區，所述重鏈可變區具有分別對應於SEQ ID NO10或SEQ ID NO11的胺基酸序列QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO10)QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO11)。
本發明的人源化DS6抗體及其表位結合片段也可以包括在輕鏈和/或重鏈胺基酸殘基中的取代，所述取代發生在表1中帶星標的殘基所定義的一個或多個位置上，所述帶星標的殘基代表了被發現位於CDR的5埃之內的、需要變為人殘基的鼠表面構架殘基(murine surface framework residues)。例如，在鼠序列(SEQ ID NO7)中的第一胺基酸殘基Q被E代替(SEQ ID NO8)，以人源化抗體。然而，由於該殘基與CDR接近，可能需要回復突變為鼠殘基Q，以維持抗體親和力。
表1
這在表2中被進一步顯示，其中muDS6可變區表面殘基被顯示，與三個最同源的人可變區表面殘基比對。表1中的胺基酸殘基對應於表2中有下劃線的胺基酸殘基。
表2
本發明進一步提供了細胞毒性偶聯物，其包含(1)細胞結合劑，其識別並結合CA6糖表位，和(2)細胞毒性試劑。在細胞毒性偶聯物中，細胞結合劑對CA6糖表位具有高親和力，細胞毒性試劑對表達CA6糖表位的細胞具有高度的細胞毒性，因此本發明的細胞毒性偶聯物形成了有效的殺傷劑。
在一個優選的實施方案中，所述細胞結合劑為抗-CA6抗體或其表位結合片段，更優選為人源化抗-CA6抗體或其表位結合片段，其中細胞毒性試劑直接地或通過可切割的或不可切割的連接子被共價連接到抗體或其表位結合片段。在更優選的實施方案中，細胞結合劑為人源化DS6抗體或其表位結合片段，細胞毒性試劑為紫杉醇(taxol)、美登素類、CC-1065或CC-1065類似物。
在本發明優選的實施方案中，細胞結合劑為人源化抗-CA6抗體，細胞毒性試劑為細胞毒性藥物，例如美登素類或紫杉烷類(taxane)。
更優選地，細胞結合劑為人源化抗-CA6抗體DS6，細胞毒性試劑為美登素化合物，例如DM1或DM4。
本發明也包括抑制表達CA6糖表位的細胞生長的方法。在優選的實施方案中，用於抑制表達CA6糖表位的細胞生長的方法在體內進行，並導致細胞死亡，儘管也包括在體外和離體應用。
本發明也提供了治療組合物，其包含細胞毒性偶聯物和藥物學可接受載體或賦形劑。
本發明進一步包括使用所述治療組合物治療患癌的對象的方法。在優選的實施方案中，細胞毒性偶聯物包含抗-CA6抗體和細胞毒性試劑。在更優選的實施方案中，細胞毒性偶聯物包括人源化DS6抗體-DM1偶聯物、人源化DS6抗體-DM4或人源化DS6抗體-紫杉烷偶聯物，所述偶聯物與藥物學可接受載體或賦形劑一起被施用。
本發明也包括試劑盒，其包括抗-CA6抗體-細胞毒性試劑偶聯物和使用說明。在優選的實施方案中，抗-CA6抗體為人源化DS6抗體，細胞毒性試劑為美登素化合物，例如DM1或DM4，或紫杉烷類藥物，所述說明是關於使用該偶聯物來治療患癌對象。試劑盒也包括用於製備藥物學上可接受的製劑所必需的組分，例如稀釋劑——如果偶聯物是處於凍幹狀態或濃縮形式的話，並且包括用於施用該製劑的組分。
本發明也包括特異性結合和識別CA6糖表位的抗體的衍生物。在優選的實施方案中，通過表面重構或人源化結合CA6糖表位的抗體而製備抗體衍生物，其中衍生物具有降低的對宿主的免疫原性。
本發明進一步提供了人源化抗體或其片段，其進一步被標記以便用於研究或診斷應用中。在優選的實施方案中，所述標記為放射性標記、螢光團、生色團、顯像劑或金屬離子。
也提供用於診斷的方法，其中所述標記的人源化抗體或其表位結合片段被施給懷疑患癌的受體，並測量或監測標記在對象體內的分布。
本發明也提供了用於治療患癌對象的方法，通過施用本發明的人源化抗體偶聯物——或者單獨施用或者與其它細胞毒性試劑或治療劑聯合施用——來完成。所述癌可以是例如乳癌、結腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、骨肉瘤、子宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、其中CA6被表達的肉瘤或腫瘤的一種或多種，或待確定的其它癌，其中CA6糖表位被顯著表達。
除非有其它說明，本文所引用的所有參考文獻和專利被引入作為參考。


圖1顯示了用以測定DS6抗體結合所選擇的癌細胞株表面的能力的研究的結果。通過流式細胞術測量用DS6一抗和FITC偶聯的抗鼠IgG(H+L)二抗溫育的細胞株的螢光。DS6抗體結合Caov-3(圖1A)和T-47D(圖1B)細胞分別具有1.848nM和2.586nM的表觀Kd。抗原陰性細胞株，SK-OV-3(圖1C)和Colo205(圖1D)顯示無抗原特異性結合。
圖2顯示了表位表達的點印跡分析的結果。Caov-3(圖2A圖2B)、SKMEL28(圖2C)和Colo205(圖2D)細胞裂解物被分別點到硝化纖維膜上，然後用鏈黴蛋白酶(pronase)、蛋白酶K、神經氨酸酶或過碘酸溫育。然後用DS6抗體(圖2A)、CM1抗體(圖2B)、R24抗體(圖2C)或C242抗體(圖2D)免疫印跡該膜。
圖3顯示了DS6抗原表達的點印跡分析的結果。將Caov-3細胞裂解物各自點到PVDF膜上，然後在三氟甲磺酸(TFMSA)存在的條件下溫育。然後用CM1抗體(12)或DS6抗體(34)免疫印跡該膜。
圖4顯示了DS6抗原的糖表位分析的結果。將用N-聚糖酶(″N-gly″)、O-聚糖酶(″O-gly″)和/或唾液酸酶(″S″)預處理的Caov-3裂解物點樣至硝化纖維上，然後用DS6抗體或CM1抗體(Muc-1VNTR)進行免疫印跡。
圖5顯示了DS6抗原的蛋白質印跡分析的結果。細胞裂解物用DS6抗體進行免疫沉澱(″IP″)和免疫印跡。抗原對應於大於250kDa的蛋白條帶，如在抗原陽性Caov-3(圖5A和圖5B)和T47D(圖5C)細胞中觀察到的。抗原陰性SK-OV-3(圖5D)和Colo205(圖5E)細胞系不顯示此條帶。免疫沉澱反應之後，用(圖5A)神經氨酸酶(″N″)或(圖5B)過碘酸(″PA″)溫育Caov-3細胞裂解物的蛋白質G珠子。在同一凝膠上分析抗體(″α″)、IP前(″Lys″)和IP後穿流物(″FT″)裂解物對照。也用N-聚糖酶(″N-gly″)、O-聚糖酶(″O-gly″)和/或唾液酸酶(″S″)溫育Caov-3免疫沉澱物(請見圖5F)，其中用生物素化-DS6和鏈黴親合素-HRP探查印跡。
圖6顯示了DS6抗體和CM1抗體在Caov-3(圖6A)和HeLa(圖6B)細胞裂解物上的免疫沉澱反應和/或免疫印跡的結果。疊加CM1和DS6蛋白印跡信號，表明DS6抗原在Muc1蛋白上。在HeLa裂解物中，Muc1雙產物來自於Muc1的表達，該表達由串連重複數目不同的不同等位基因指導。
圖7顯示了DS6抗體夾心ELISA設計(圖7A)和標準曲線(圖7B)。使用已知濃度的商業可得的CA15-3標準(其中1CA15-3單位＝1DS6單位)產生標準曲線。
圖8顯示了定量ELISA標準曲線。使用已知濃度的生物素-DS6，其或者由板上的羊抗鼠IgG(圖8A)捕獲，或直接結合到ELISA板上(圖8B)，測定檢測抗體(鏈黴親合素-HRP/生物素-DS6)信號的標準曲線(圖8C)。
圖9顯示了鼠DS6抗體的輕鏈(圖9A)和重鏈(圖9B)可變區的cDNA和胺基酸序列。每個序列中的三個CDR被加以下劃線(Kabat定義)。
圖10顯示了按照Kabat定義確定的鼠DS6抗體的輕鏈(圖10A)和重鏈(圖10B)CDRs。對於重鏈CDRs，AbM建模軟體產生稍微不同的定義(圖10C)。
圖11顯示了鼠DS6抗體的輕鏈(″muDS6LC″)(SEQ ID NO7的1-95殘基)和重鏈(″muDS6HC″)(SEQ ID NO9的1-98殘基)胺基酸序列，它們與IgV？ap4(SEQ ID NO23)和IgVh J558.41(SEQ ID NO24)基因的胚系序列進行比對(align)。灰色表示序列差異。
圖12顯示了在Brookhaven資料庫中具有解析結構(solved structure)文件的10個輕鏈和重鏈抗體序列，它們與鼠DS6(muDS6)輕鏈(″muDS6LC″)和重鏈(″muDS6HC″)序列最同源。以最多同源到最少同源的順序排列這些序列。
圖13顯示了用於預測鼠DS6抗體輕鏈可變區的哪些骨架殘基(frameworkresidues)為表面可及的表面可及性(surface accessibility)數據和計算。具有25-35％的平均表面可及性的位置被標記(′？？*)，它們要經歷第二輪分析。DS6抗體輕鏈可變區(圖13A)和重鏈可變區(圖13B)。
圖14顯示了prDS6 v1.0哺乳動物表達質粒圖。該質粒被用來建立和表達重組嵌合的和人源化的DS6抗體。
圖15顯示了鼠(″muDS6″)和人源化(″huDS6″)(v1.0v1.2)DS6抗體輕鏈(圖15A)和重鏈(圖15B)可變結構域的胺基酸序列。
圖16顯示了人源化DS6抗體(″huDS6″)(v1.0和v1.2)的輕鏈可變區的cDNA和胺基酸序列。
圖17顯示了人源化DS6抗體v1.0(圖17A)和v1.2(圖17B)的重鏈可變區的cDNA和胺基酸序列。
圖18顯示了來自在WISH細胞上進行的分析的muDS6和huDS克隆流式細胞術結合曲線。(圖18A)嵌合，v1.0和v1.2人DS6克隆的結合親和力(Kd＝3.15，3.71和4.20nM)與(圖18B)裸DS6和生物素化鼠DS6(Kd＝1.93和2.80nM)進行比較。
圖19顯示了huDS6抗體與muDS6的競爭結合測定的結果。(圖19A)用生物素-muDS6和鏈黴親合素-DTAF溫育WISH細胞，產生表觀Kd為6.76nM的結合曲線。(圖19B)變化濃度的裸muDS6、huDS6 v1.0和v 1.2與2nM生物素-muDS6和鏈黴親合素-DTAF二級試劑混合。
圖20顯示了未偶聯的DS6抗體和DS6抗體-DM1偶聯物的結合親和力的測定結果。結果顯示，DM1偶聯沒有不利地影響抗體的結合親和力。DS6抗體-DM1偶聯物的表觀Kd(3.902nM)(″DS6-DM1″)較裸抗體(2.020nM)(″DS6″)稍大。
圖21顯示了在抗鼠IgG(H+L)DM1偶聯物(2°Ab-DM1)存在或缺乏的情況下，使用DS6抗體進行的間接細胞存活率測定的結果。僅在存在二級偶聯物(secondaryconjugate)(″DS6+2°Ab-DM1″)的情況下，以依賴於DS6抗體的方式殺死抗原陽性Caov-3細胞(IC50＝424.9pM)。
圖22顯示了DS6抗體和人源化DS6抗體的補體依賴性細胞毒性(CDC)測定的結果。結果表明，在HPAC(圖22A)和ZR-75-1(圖22B)細胞上，不存在DS6抗體或人源化DS6抗體的CDC介導效應(mediated effect)。
圖23顯示了DS6抗體-DM1偶聯物和游離的美登素在體外的細胞毒性測定的結果。在集落生成試驗(clonogenic assay)中，將DS6抗原陽性卵巢(圖23A)、乳房(圖23B)、子宮頸(圖23C)和胰腺(圖23D)癌細胞系連續暴露於DS6抗體-DM1偶聯物，測試了細胞毒性(左圖)。通過72h暴露於游離的美登素，類似地測定了這些細胞系的美登素敏感性(右圖)。被測試的卵巢癌細胞系是OVCAR5、TOV-21G、Caov-4和Caov-3。被測試的乳癌細胞系是T47D、BT-20和BT-483。被測試的子宮頸癌細胞系是KB、HeLa和WISH。被測試的胰腺癌細胞係為HPAC、Hs766T和HPAF-11。
圖24顯示了DS6抗體-DM1偶聯物在體外的細胞毒性測定結果。在MTT細胞存活率分析中，以依賴於DS6抗體-DM1偶聯物的方式殺死人卵巢(圖24A，圖24B圖24C)、乳房(圖24D圖24E)、子宮頸(圖24F圖24G)和胰腺(圖24H圖24I)癌細胞。裸DS6沒有不利地影響這些細胞的生長，這表明DM1偶聯對於細胞毒性是被要求的。
圖25A顯示了在已建立的皮下KB腫瘤異種移植物上的DS6抗體-DM1偶聯物的體內抗腫瘤功效研究結果。在0天接種腫瘤細胞，在第6天給與第一次治療。連續每天進行免疫偶聯物治療，總計5個劑量。一旦腫瘤體積超過1500mm3，則對PBS對照動物實施安樂死。以150或225μg/kg DM1的劑量施用偶聯物，分別對應5.7和8.5mg/kg的抗體濃度。在研究期間監測鼠的體重(圖25B)。
圖26顯示了在已建立的皮下腫瘤異種移植物上的DS6抗體-DM1偶聯物的體內抗腫瘤功效研究結果。在0天接種OVCAR5(圖26A和圖26B)、TOV-21G(圖26C和圖26D)、HPAC(圖26E和圖26F)和HeLa(圖26G和圖26H)細胞，在第6天和第13天給予免疫偶聯物治療。一旦腫瘤體積超過1000mm3，則對PBS對照動物實施安樂死。以600μg/kg DM1的劑量施用偶聯物，對應27.7mg/kg的抗體濃度。在研究期間監測鼠的腫瘤體積(圖26A，圖26C，圖26E和26G)和體重(圖26B，圖26D，圖26F和圖26H)。
圖27顯示了在腹膜內OVCAR5腫瘤上的DS6抗體-DM1偶聯物的體內功效研究結果。在0天腹膜內注射腫瘤細胞，在第6天和第13天給予免疫偶聯物治療。一旦體重損失超過20％，則對動物實施安樂死。
圖28顯示了在HeLa細胞上的裸DS6和紫杉烷類偶聯的DS6抗體的結合親和力研究的流式細胞術結合曲線。紫杉烷類化合物(MM1-202)偶聯沒有不利地影響抗體的結合親和力。DS6-MM1-202偶聯物的表觀Kd(1.24nM)比裸DS6抗體的(620pM)稍大。
發明詳述[62]本發明提供了抗-CA6單克隆抗體、抗-CA6人源化抗體和抗-CA6抗體的片段。本發明的每個抗體和抗體片段被設計為特異性識別並結合在細胞表面上的CA6糖表位。已知CA6可被許多人類腫瘤表達95％的漿液性卵巢癌(serous ovariancarcinomas)、50％的子宮內膜卵巢癌(endometrioid ovarian carcinomas)、50％的子宮頸瘤(neoplasms of the uterine cervix)、69％的子宮內膜瘤(neoplasms of theendometrius)、80％的外陰瘤(neoplasms of the vulva)、60％的乳癌、67％胰腺瘤和48％的膀胱上皮瘤(tumors of the urothelium)，但它很少被人正常組織表達。
在Kearse等人在Int.J.Cancer 88(6)866-872(2000)上發表的報告中，當他們使用雜交瘤上清液鑑定在上面發現有CA6表位的蛋白時，他們錯誤鑑定其為具有包含CA6表位的N聯糖的80kDa蛋白。使用純化的DS6，我們已經證明，CA6表位被發現位於大於250kDa的非二硫鍵連接糖蛋白的O聯糖上。此外，該糖蛋白經鑑定為粘蛋白，Muc1。因為不同的Muc1等位基因在不確定數目串連重複(VNTR)結構域中具有數目不同的串連重複，因此細胞經常表達兩種具有不同尺寸的不同Muc1蛋白(Taylor-Papadimitriou，Biochim.Biophys.Acta 1455(2-3)301-13(1999)。由於在VNTR結構域中的重複數目不同以及糖基化作用中的差異，Muc1的分子重量從細胞繫到細胞系是變化的。
CA6免疫反應性對過碘酸的敏感性表明，CA6是糖類表位「糖表位(glycotope)」。CA6免疫反應性對用來自霍亂弧菌(Vibrio cholera)的神經氨酸酶處理的另外的敏感性表明，CA6表位是唾液酸依賴性糖表位，因此為「唾酸糖表位(sialoglycotope)」。
可以在實施例2中找到CA6的表徵細節(參閱下述)。可以在WO 02/16401；Wennerberg等，Am.J.Patlzol.143(4)1050-1054(1993)；Smith等，Human Antibodies961-65(1999)；Kearse等，Int.J.Cancer 88(6)866-872(2000)；Smith等，Int.JGynecol.Pathol.20(3)260-6(2001)和Smith等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.10(2)152-8(2002)中找到有關CA6的另外的細節。
本發明也包括含兩種主要組分的細胞毒性偶聯物。第一組分為細胞結合劑，其識別並結合CA6糖表位。所述細胞結合劑應當以高度的特異性識別在Muc1上的CA6唾酸糖表位，因此所述細胞毒性偶聯物僅僅識別並結合所期望的細胞。高度的特異性允許該偶聯物以靶向方式發揮作用，幾乎不具有由非特異性結合而導致的副作用。
在另一個實施方案中，本發明的細胞結合劑也以高度的親和力識別CA6糖表位，因此該偶聯物將與靶細胞接觸足夠的時間，從而使得該偶聯物的細胞毒性藥物部分可以在細胞上起作用，和/或使得有足夠的時間可以被細胞內化。
在一個優選的實施方案中，細胞毒性偶聯物包含抗-CA6抗體作為細胞結合劑，更優選為鼠DS6抗-CA6單克隆抗體。在一個更優選的實施方案中，細胞毒性偶聯物包含人源化DS6抗體或其表位結合片段。DS6抗體能以高度的特異性識別CA6，以靶向方式將細胞毒性試劑引導至異常細胞或組織，例如癌細胞。
本發明的細胞偶聯物的另一組分為細胞毒性試劑。在優選的實施方案中，該細胞毒性試劑為紫杉醇，美登素類例如DM1或DM4、CC-1065或CC-1065類似物。在優選的實施方案中，本發明的細胞結合劑直接地或通過可切割的或不可切割的連接子(linker)與細胞毒性試劑共價連接。
細胞結合劑、細胞毒性試劑和連接子被更詳細地在下面予以討論。
細胞結合劑[71]本發明的化合物作為治療劑的有效性取決於對合適的細胞結合劑的仔細選擇。細胞結合劑可以是目前已知的任何種類，或將要已知的任何種類，而且包括肽和非肽。細胞結合劑可以是可以特異或非特異方式結合細胞的任何化合物。一般而言，這些試劑可以是抗體(特別是單克隆抗體)、淋巴因子、激素、生長因子、維生素、營養轉運因子(例如轉鐵蛋白)或任何其它細胞結合分子或物質。
可以被使用的細胞結合劑的更具體的例子包括(a)多克隆抗體；(b)單克隆抗體；(c)抗體片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv(Parham，J.Immunol.1312895-2902(1983)；Spring等，J Immunol.113470-478(1974)；Nisonoff等，Arch.Biochem.Biophys.89230-244(1960))；(d)幹擾素(例如α、β、γ)；(e)淋巴因子，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6；(f)激素，例如胰島素、TRH(促甲狀腺素釋放激素)、MSH(促黑激素)、類固醇激素，例如雄激素和雌激素；(g)生長因子和集落刺激因子，例如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess，Immunology Today 5155-158(1984))；(h)轉鐵蛋白(O′Keefe等，J.Biol.Chem.260932-937(1985))；和(i)維生素，例如葉酸。
抗體[73]選擇適合的細胞結合劑是選擇的關鍵，這取決於欲靶向的具體細胞群體，但是一般而言，如果適合的抗體可以被利用或可以被製備，則優選抗體，更優選單克隆抗體。
單克隆抗體技術允許以特異性單克隆抗體的形式產生非常特異性的細胞結合劑。通過用感興趣的抗原——例如完整的靶細胞、從靶細胞中分離出的抗原、完整病毒、減毒完整病毒和病毒蛋白諸如病毒衣殼蛋白——免疫接種小鼠、大鼠、倉鼠或任何其它哺乳動物而製造出單克隆抗體的技術在本領域是極為熟知的。也可以使用敏化的人細胞。製造單克隆抗體的另一種方法是使用scFv(單鏈可變區)的噬菌體文庫，尤其是人scFv(請參閱例如，Griffiths等，U.S.美國專利5,885,793和5,969,108；McCafferty等，WO 92/01047；Liming等，WO 99/06587)。
典型的抗體由通過二硫健連接的兩個相同的重鏈和兩個相同的輕鏈組成。可變區為抗體重鏈和輕鏈的一部分，其在抗體中有著不同的序列，而且它整合了每個特定抗體對其抗原的結合性及特異性。可變性通常並不是在整個抗體可變區均勻分布的。它典型地集中在可變區的三個片段之內，其被稱作互補性決定區(CDRs)或高度可變區，位於輕鏈和重鏈可變區內。可變區的具有更高保守性的部分被稱作骨架區。重鏈和輕鏈的可變區包括四個骨架區，主要採用β-摺疊構型，其中各個骨架區通過三個CDRs連接起來，所述三個CDRs形成連接β-摺疊結構的環結構，在一些情況下，構成β-摺疊的一部分。在每個鏈中的CDRs通過骨架區被保持處於位置接近的狀態，並且與來自另一鏈的CDRs一起幫助形成抗體的抗原結合部位(E.A.Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，1991，NIH)。
恆定區為重鏈的一部分。雖然不直接參與抗體與抗原的結合，然而它的確顯示各種效應子功能(effector functions)，例如抗體參與抗體依賴性的細胞毒性。
用在本發明中的適合的單克隆抗體包括鼠DS6單克隆抗體(美國專利6,596,503；ATCC保藏號PTA-4449)。
人源化或表面重構DS6抗體[78]優選地，人源化抗-CA6抗體被用作本發明的細胞結合劑。這樣的人源化抗體的優選實施方案為人源化DS6抗體，或其表位結合片斷。
人源化的目標是減少引入到人體的異種抗體例如鼠抗體的免疫原性，同時保持該抗體完整的抗原結合親和力及特異性。
使用幾種技術可以產生人源化抗體，例如表面重構(resurfacing)和CDR移植(grafting)。正如本文所用，表面重構技術使用了分子建模、統計分析和誘變的組合，來改變抗體可變區的非CDR表面，以模擬靶宿主的已知抗體的表面。
在美國專利5,639,641(Pedersen等)中公開了用於抗體的表面重構的策略和方法，以及用於減少抗體在不同的宿主內的免疫原性的其它方法，在此引入其全部內容作為參考。簡言之，在一個優選的方法中，(1)產生一系列抗體重鏈和輕鏈可變區的位置比對(allignments)，以提供一組在重鏈和輕鏈可變區骨架表面暴露的位置，其中所有可變區的比對位置有至少大約98％是相同的；(2)為嚙齒類動物抗體(或其片斷)定義一組在重鏈和輕鏈可變區骨架表面暴露的胺基酸殘基；(3)鑑定一組在重鏈和輕鏈可變區骨架表面暴露的胺基酸殘基，其與所述嚙齒類動物表面暴露胺基酸殘基組最接近相同；(4)用在步驟(3)中鑑定的那組重鏈和輕鏈可變區骨架表面暴露胺基酸殘基取代在步驟(2)中定義的那組重鏈和輕鏈可變區骨架表面暴露胺基酸殘基，除了那些位於嚙齒類動物抗體的互補性決定區的任何殘基的任何原子的5之內的胺基酸殘基；和(5)產生具有結合特異性的人源化嚙齒類動物抗體。
可以使用多種其它技術來人源化抗體，包括CDR-移植(EP 0 239 400；WO91/09967；美國專利5,530,101；和5,585,089)，鑲面(veneering)或表面重構(EP0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.，1991，Molecular Immunology 28(4/5)489-498；Studnicka G.M.等，1994，Protein Engineering 7(6)805-814；Roguska M.A.等，1994，PNAS 91969-973)和鏈重排(美國專利5,565,332)。可以通過多種在本領域已知的技術製備人抗體，包括噬菌體展示方法。參閱美國專利4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和國際專利申請
發明者G·佩恩, P·丘, D·J·塔瓦雷斯 申請人:伊繆諾金公司