一種防治菸草黑脛病的地衣芽孢桿菌菌劑及其製備方法
2023-11-07 02:42:27
專利名稱：：一種防治菸草黑脛病的地衣芽孢桿菌菌劑及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於生物農藥
技術領域：
，具體涉及一種防治菸草黑脛病的菌劑，以及該菌劑的製備方法。
背景技術：
：菸草是我國重要的經濟作物，同時也是病害危害最嚴重的作物之一，從播種到收穫，整個過程都可受到病原物的侵染。菸草黑脛病(tobaccoblackshank)是世界菸草生產中危害最嚴重的病害之一，特別是在溫帶、亞熱帶和熱帶發生較重，是我國菸草的主要病害。在我國，除個別較寒冷的地區，各主要產煙省均有不同程度的發生。其中安徽、河南、山東為歷史上的重病區；雲南、貴州、福建、廣東、湖南、四川等煙區發生也相當普遍，且多與菸草青枯病混合發生，因此為害更為嚴重。近年來，新煙區也都有發生。據不完全統計，我國菸草黑脛病平均每年發病面積高達76，373公頃，產量損失2,869.26萬公斤，產值損失超過1,23億元人民幣。菸草黑脛病是一種典型的土傳病害，目前國內在防治時主要以栽培抗病品種、輪作等農業措施和大劑量的化學農藥進行防治。但是，可供區域栽培的抗性品種很有限，難以滿足實際生產的需要。採用輪作在我國人多地少的情況下可行性越來越低。化學防治不僅成本高、防效差，而且汙染環境，影響品質，並且一些病原真菌對生產上常用的甲霜靈表現出抗藥性，使防治效果變差，防治難度加大。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種有效、無毒、安全、無殘留、使用簡便的防治菸草黑脛病的菌劑。同時，本發明還提供該菌劑的製備方法及其在防治菸草黑脛病中的應用。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。A.本發明提供了一種防治菸草黑脛病的菌劑，該菌劑的生產菌株分類命名為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)GP13,保藏號為CGMCCNo.1699;其菌株的試管斜面培養基配方為牛肉浸膏3g,大豆蛋白腖5g，葡萄糖5g,瓊脂17-20g,蒸餾水1000ml，pH6.8-7.2;其液體發麟培養基配方為大豆蛋白腖10g、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸亞鐵0.02g、硫酸鋅0.02g、硫酸錳0.02g、硫酸鎂0.3g、自來水1000ml、花生油0.1%、消泡劑0.01%、pH7.0-7.2。本發明的生產菌株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)GP13，分離自雲南華寧菸草根際土壤，經形態學、培養性狀、常規生理生化測定，該生防細菌為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的一個新菌株GP13。該菌株具有以下特徵①菌落不規則圓形，菌落邊緣裂頁狀，菌落初期光滑，後期起皺，灰白色，蠟質，不透明，菌體在液體中不易分散，不產色素,產芽孢，芽孢不膨大，亞端生；在顯微鏡下觀察菌體直杆狀，大小0.70.9x2.02.8pm。②該菌株定殖能力強、抑菌能力強、能促進菸草幼苗生長，具有殺菌、防病、促進生長的作用。該菌株可在菸草的根際和根內定殖。對該作物上的黑脛病病原菌(Bacilluslicheniformis)有顯著抑制作用，抑菌圈直徑平均為12.0-25.0mm。③具有以下生理生化特徵可厭氧生長，能在50。C、pH5.7、7。/。NaCl下生長；接觸酶陽性，甲基紅試驗陽性，VP試驗陽性；水解澱粉，液化明膠，分解酪素，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖均能產酸，不能利用甘露醇產酸；利用檸檬酸鹽、丙酸鹽、甘油。本發明生防菌株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)GP13的培養方法1.試管種培養試管斜面培養基配方為牛肉浸膏3g，大豆蛋白腖5g，葡萄糖5g,瓊脂17-20g,蒸餾水1000ml,pH6.8-7.2。將(Bacilluslicheniformis)GP13移到試管斜面培養基上，在30°C±1。C恆溫培養12天，獲得試管種。2.搖瓶液體發酵培養液體發酵培養基配方為大豆蛋白腖10g、蔗糖5g、酵母膏2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸亞鐵0.02g、硫酸鋅0.02g、硫酸錳0.02g、硫酸鎂0.3g、自來水1000ml、花生油0,1%、消泡劑0.01%、pH7.0-7.2。將每支試管斜面加無菌水5-10ml，用接種環刮下菌苔，並搖勻形成細菌懸液，以0.5%的體積比接入裝培養液量為30%~50%(裝培養液的容積與容器的容積比)的三角瓶中，於30。C士rC恆溫、150-200轉/分鐘轉速振蕩培養12小時，可轉接至發酵罐中進行發酵生產。3.發酵罐液體發酵條件罐溫發酵罐的罐溫均控制在28-32。C，通過插入培養基的溫度探頭測量，以夾層內通入冷卻水或熱水的方法進行調節。罐壓發酵罐的罐壓控制在0.5公斤/平方釐米，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進行調節。攪拌發酵罐的撹拌速度為200轉/分鐘。抽樣檢查和培養條件調節每2小時自取樣管取樣1次，測定pH，塗片、結晶紫染色、鏡檢，觀察菌體形態、菌體是否產芽孢等，判斷有無雜菌的汙染，待鏡檢菌體芽孢數佔整個菌體的5%以上時，減少通風量和降低培養溫度至25t:左右，其它條件不變，繼續培養和抽樣檢查，待鏡檢菌體芽孢數佔整個菌體的85%以上時，停止培養，鏡檢計數，並用培養基平板方法進行活菌的計數。培養周期發酵罐的培養周期約為24-36小時。B.本發明提供了所述防治菸草黑脛病的菌劑的製備方法，根據實際需要，可將其分別製成液體發酵菌劑或者固體菌劑。1.製備液體發酵菌劑的方法發酵後的菌液經平板計數測定含菌量，當含菌量達150億CFU/ml以上時，加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%~10%的甲霜靈錳鋅(58°/。的甲霜靈與代森錳鋅混劑)，50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恆速連續攪拌15分鐘，裝入塑料旋蓋瓶中。該液體發酵菌劑保質期1年，施用時需要充分攪勻，可結合裝填育苗基質、追肥、中耕等農事操作同時進行。2.製備固體菌劑的方法發酵後的菌液經平板計數測定含菌量，當含菌量達150億CFU/ml以上時，加入填充劑、板框過濾、打漿、乾燥、粉碎，製成可溼性粉劑。具體過程如下①加入填充劑將發酵液壓入貯罐，根據以下計算公式加入1:1的硅藻土與輕質碳酸鈣作為填充劑，50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恆速連續攪拌30分鐘。②填充劑硅藻土與輕質碳酸鈣的加入量(公斤)=〖發酵液菌數(億/毫升)x放罐體積(升)x收率〗/成品菌數-發酵液中的殘存物(公斤)。③板框過濾用2公斤/平方釐米壓力將物料由貯罐壓入板框，通過7號濾布過濾，壓力應隨時調節，使濾液中的含菌量不超過0.2億/亳升；④打漿將濾餅卸入打漿罐，按加入填充劑量的8%加入濃乳IOO號，或按3。/。加入SDS，加入適量的濾液均勻攪拌30分鐘。混勻將打漿後的含菌硅藻土與輕質碳酸鈣粉碎，陰乾，加5-10%的甲霜靈錳鋅(58%的甲霜靈與代森錳鋅混劑)作為增效劑，再加填充劑按5倍體積稀釋，攪拌混勻。乾燥在溫度6(TC以下的烘乾房內通風乾燥至含水量5%~8%。粉碎粉碎時出料溫度不能超過6(TC，以防止菌體失活。成品質量指標測定含菌量、含水量、懸浮率、細度的測定均參照國家企業標準(Q/KWL02-2003)進行，含菌量200億/克，其餘各項指標均符合標準。⑦按100g/袋裝入塑或鋁塑封袋中。其包裝應經過嚴格的檢驗，符合可溼性粉劑農藥的包裝標準。該固態菌劑保質期2年，施用時需要充分攪勻，可結合裝填育苗基質、追肥、中耕等農事操作同時進行。本發明與現有技術相比，具有以下有益效果1.本發明通過地衣芽孢桿菌(Bacz7/ws〃/c&m/orm")GP13菌株的試管培養、搖床擴大培養、發酵罐發酵培養，製備為菌劑，並將其成功地應用用於防治菸草黑脛病，測定表明其對菸草黑脛病的防治具有顯著效果。2.本發明提供的菌劑有效、無毒、安全、無殘留、使用簡便。3.隨著人類對生存環境的日益重視，要求減少化學農藥使用量的呼聲曰益高漲，對菸草安全的意識也逐步加強。本發明對降低化學農藥的使用量、減少環境汙染和農藥危害，克服病原抗藥性，提高菸葉品質，增強菸草農田生態系統穩定性，保障菸草產業的可持續發展，使農民增收具有重要的現實意義和廣闊的應用前景，將會在未來的竟爭中佔有有利的地位。保藏生物材料的說明本發明採用的細菌菌株，已於2006年4月24曰在位於中國北京中關村的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，分類命名為地衣芽孢桿菌CSac/〃w//c/zew/ow^)GP13，保藏登記入冊編號為CGMCCNo.1699。具體實施例方式通過下面給出的具體實施例和應用實施例，可以進一步清楚地了解本發明。但它們並不是對本發明保護範圍的限定。實施例1一一液體發酵菌劑製備方法1(1)菌種製備將formulaseeoriginaldocumentpage7移到試管斜面培養基(牛肉浸膏3g，大豆蛋白腖5g，葡萄糖5g,瓊脂17-20g,蒸餾水1000ml，pH6.8-7.2)上，在30。C恆溫培養l-2天，獲得試管種。(2)液體發酵將每支試管斜面加無菌水10ml,用接種環刮下菌苔，並搖勻形成細菌懸液，以0.5%的體積比接入已滅菌冷卻至3(TC、裝有200ml培養液(大豆蛋白腖10g、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸亞鐵0.02g、硫酸鋅0.02g、硫酸錳0.02g、硫酸鎂0.3g、自來水1000ml、花生油0.1%、消泡劑0.01%、pH7.0-7.2)的500ml三角瓶中，於30。C恆溫150-200轉/分鐘轉速振蕩培養36小時。要求發酵後的菌液經平板計數測定含菌量，含菌量達150億CFU/ml以上。(3)製劑化加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的甲霜靈錳鋅(58%的甲霜靈與代森錳鋅混劑)，高速萬能粉碎機攪拌混勻IO分鐘，裝入250ml塑料旋蓋瓶中。即得本發明的液體菌劑。實施例2一一液體發酵菌劑製備方法2(1)菌種製備將Sa"'//Ms〃z'c/zem/ormz'sGP13移到容量為150ml的東形瓶斜面培養基(牛肉浸膏3g,大豆蛋白腖5g,葡萄糖5g,瓊脂17-20g,蒸餾水1000ml,pH6.8-7.2)上，在3(TC恆溫培養l-2天，獲得斜面菌種。(2)液體發酵將每隻茶形瓶斜面加無菌水100ml，用接種環刮下菌苔，並搖句形成細菌懸液，以0.5。/。的體積比接入已滅菌冷卻至3(TC的液體培養液(大豆蛋白腖IOg、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸亞鐵0.02g、硫酸鋅0.02g、硫酸錳0.02g、硫酸鎂0.3g、自來水1000ml，pH7.0-7.2)的發酵罐中，按本發明所述的液體發酵條件，於30'C恆溫200轉/分鐘，發酵培養36小時。要求發酵後的菌液經平板計數測定含菌量，含菌量達150億CFU/ml以上。(3)製劑化加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的甲霜靈錳鋅(58%的甲霜靈與代森錳鋅混劑),50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恆速連續攪拌15分鐘，裝入250ml塑料旋蓋瓶中。即得本發明的液體菌劑。實施例3一一固體菌劑製備方法1將液體發酵菌劑製備方法l獲得的液體菌劑，按液體50%加1:1的硅藻土與輕質碳酸鈣作為填充劑，7號濾布真空過濾，通風陰乾，高速萬能粉碎機粉碎，按100g/袋裝入塑或結塑封袋中。其包裝應經過嚴格的檢驗，符合可溼性粉劑農藥的包裝標準。成品質量指標測定含菌量、含水量、懸浮率、細度的測定均參照國家企業標準(Q/KWL02-2003)進行，含菌量200億/克，其餘各項指標均符合標準。實施例4一一固體菌劑製備方法2發酵車間發酵後的菌液經平板計數測定含菌量，當含菌量達150億CFU/ml以上時，加入填充劑、板框過濾、打漿、乾燥、粉碎，製成可溼性粉劑。具體過程如下加入填充劑將發酵液壓入貯罐，根據以下計算公式加入1:1的硅藻土與輕質碳酸鈣作為填充劑，50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恆速連續攪拌30分鐘。填充劑硅藻土與輕質碳酸鈣的加入量(公斤)=d發酵液菌數(億/毫升)x放罐體積(升)x收率〗/成品菌數-發酵液中的殘存物(公斤)。板框過濾用2公斤/平方釐米壓力將物料由貯罐壓入板框，通過7號濾布過濾，壓力應隨時調節，使濾液中的含菌量不超過0.2億/毫升。打漿將濾餅卸入打漿罐，按加入填充劑量的8%加入濃乳100號，或按3。/。加入SDS，加入適量的濾液均勾攪拌30分鐘。混勻將打漿後的含菌硅藻土與輕質碳酸鈣粉碎，陰乾，加5%的甲霜靈錳鋅(58%的甲霜靈與代森錳鋅混劑)作為增效劑，再按5倍體積稀釋，攪拌混勻。乾燥在溫度6(TC以下的烘乾房內通風乾燥至含水量6。/。。粉碎粉碎時出料溫度不能超過6(TC,以防止菌體失活。成品質量指標測定含菌量、含水量、懸浮率、細度的測定均參照國家企業標準(Q/KWL02-2003)進行，含菌量200億/克，其餘各項指標均符合標準。按100g/袋裝入塑或鋁塑封袋中。其包裝應經過嚴格的檢驗，符合可溼性粉劑農藥的包裝標準。應用實施例1不同施用時期防治菸草黑脛病的效果。a.試驗藥劑本發明固態菌劑，甲霜靈錳鋅；試驗品種為紅花大金元；試驗地點分別於宜良九鄉德馬村、孟自雨過鋪江水地村等地進行試點，每點面積約1.5畝。b.試驗方法試驗處理設置:分別在假植時(如釆用漂浮育苗，則與基質混勻)、移栽澆定根水時、移栽後10天，500倍稀釋成懸浮液，假植後溼潤營養土或灌根培土，採用甲霜靈錳鋅作藥劑對照、灌清水作空白對照，共5個處理。各處理列於表l。各處理形成的小區隨機排列，3次重複，共15個小區，每小區植煙50-80株。株行距設置、施肥、管理與當地菸草生產推廣要求相同(除不施用任何土壤殺菌劑外，追肥要澆施)。表1.不同施用時期的試驗處理設置tableseeoriginaldocumentpage10注對照中，每次施用的水量同生防菌菌劑稀釋成的澆水量相同，各處理各時期除施藥外，需按農事操作正常澆水、追肥(澆施)。C.病情調查生防菌菌劑施用完畢，即中耕培土、追肥後，進行一次病情基數調查，以後20天、40天、60天調查病情。病害的嚴重度按菸草病害調查的行業標準YC/T39-1996進行，計算病情指數以及相對防效。d.結果與分析不同施用時期防治效果見表2，從表2可看出本發明菌劑對菸草黑脛病的防治效果在40.1%~90.5%,三個時期以成活後施用，防治效果較好，移栽期效果稍差，假植期防效相對較差。這可能與育苗方式有關，由於兩試點均釆用漂浮育苗方式直播成苗，對幼苗生長的基質消毒較好，又無假植時對幼苗根系造成的傷害，因此苗床期煙株可免受菸草黑脛病菌的侵染。菸草黑脛病菌的侵染主要發生在大田本田內，其侵染源來自大田帶菌土壤，由於煙苗移栽成活後進入伸根期，此時的根系生長較旺盛，自然造成的根傷害較多，又加之雲南天氣往往是雨季，這個階段是煙株較感病的時期，因此菌劑此時施用後就能較好地發揮其拮抗作用，達到較好的防治效果。與對照藥劑甲霜靈錳鋅相比，生防菌防效稍差。表.2.不同施用時期對菸草黑脛病防治效果(病情基數均為0)tableseeoriginaldocumentpage11應用實施例2不同施用濃度防治菸草黑脛病的效果a.材料與方法試驗藥劑為本發明固態菌劑，甲霜靈錳鋅；試驗品種為紅花大金元；試驗地點分別於宜良九鄉德馬村、孟自雨過鋪江水地村等地進行試點，每點面積約1.5畝。b.試驗方法在移栽澆定根水時，分別按500、1000、2000倍的用量稀釋成懸浮液，灌根，採用500倍甲霜靈錳鋅作藥劑對照、灌清水作空白對照，共5個處理(編號分別為I、II、III、IV、V)，每處理每煙株灌注500ml(1巿斤)。各處理形成的小區隨機排列，3次重複，每小區植煙50-80株。株行距設置、施肥、管理與當地菸草生產推廣要求相同(除不施用任何土壤殺細菌劑外，追肥要澆施)。c.病情調查菌劑施用完畢，煙株成活後，進行一次病情基數調查，以後20天、40天、60天調查病情。病害的嚴重度按菸草病害調查的行業標準YC/T39-1996進行，計算病情指數以及防效。d.結果與分析表3不同施用濃度對菸草黑脛病的防治效果(病情基數均為O)地點項目-不同施用濃度IIIIIIIVV第--次調查病指1.53.15.42.315.9第二:次調查病指1.53.66.52.322.7宜良第三.次調查病指1.53.66.92.327.5九鄉第--次調查防效90.6%80.5%66.0%85.5%—第—.次調查防效93.4%84.1%71.4%89.9%—第二.次調查防效94.5%86.9%74.9%91.6%一第一-次調查病指2.72.74.02.74.7第二.次調査病指2.93.14.72.76.0蒙自第三.次調査病指3.04.26.72.78.0雨過鋪第一次調查防效42.6%42.6%14.9%42.6%—-—.次調査防效51.7%48.3%21.7%55.0%—第三次調查防效62.5%47,5%16.3%66.3o/o一從表3的結果來看，隨著濃度的提高，其防效有所提高，其中500倍菌劑的防效與對照藥劑相當，防效42.6%~94.5%，宜良點除了與其它點在移栽時施用外，還在移栽成活後IO天、20天各加施一次，其防效普遍提高。因此，本發明固態菌劑以500倍稀釋施用對黑脛病的防治效果較好，如病害嚴重於伸根期加施，效果則更為明顯。試驗結果表明，本發明用於防治菸草黑脛病有很好的應用前景。權利要求1.一種防治菸草黑脛病的菌劑，其特徵在於該菌劑的生產菌株的分類命名為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)GP13，保藏號CGMCCNo.1699。2.根據權利要求1所述防治菸草黑脛病的菌劑，所述菌株的固體和液體培養基配方如下①試管斜面培養基配方為牛肉浸膏3g，大豆蛋白腖5g,葡萄糖5g,瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml,pH6.8-7.2;②液體發酵培養基配方為大豆蛋白腖10g、蔗糖5g、、酵母膏2g、磷酸二氫鉀lg、硫酸亞鐵0.02g、硫酸鋅0.02g、硫酸錳0.02g、硫酸鎂0.3g、自來水1000ml、花生油0.1%、消泡劑0.01%、pH7.0畫7.2。3.—種防治菸草黑脛病的菌劑的製備方法，其特徵在於採用以下步驟發酵後的菌液經平板計數測定含菌量，當含菌量達150億CFU/ml以上時，加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%10%的甲霜靈錳鋅，50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恆速連續撹拌15分鐘，裝入塑料旋蓋瓶中，即得到所需的液體發酵菌劑。4.一種防治菸草黑脛病的菌劑的製備方法，其特徵在於採用以下步驟發酵後的菌液經平板計數測定含菌量，當含菌量達150億CFU/ml以上時，加入填充劑，經板框過濾、打漿、乾燥、粉碎，即得到所需的可溼性粉劑。5.權利要求1或2所述的菌劑在防治菸草黑脛病中的應用。全文摘要本發明公開了一種防治菸草黑脛病的菌劑及其製備方法。該菌劑的生產菌株的分類命名為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)GP13，保藏號CGMCCNo.1699。所述菌株的固體和液體培養基配方如下①試管斜面培養基配方為牛肉浸膏3g，大豆蛋白腖5g，葡萄糖5g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH6.8-7.2；②液體發酵培養基配方為大豆蛋白腖10g、蔗糖5g、酵母膏2g、磷酸二氫鉀1g、硫酸亞鐵0.02g、硫酸鋅0.02g、硫酸錳0.02g、硫酸鎂0.3g、自來水1000ml、花生油0.1％、消泡劑0.01％、pH7.0-7.2。試驗結果表明，本發明用於防治菸草黑脛病有很好的應用前景。文檔編號C12R1/10GK101385468SQ200810233500公開日2009年3月18日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者宋春滿,方敦煌,鄧雲龍,鄧建華申請人:雲南省菸草科學研究所