核酸包被的顆粒的製作方法

2023-12-10 06:24:17 2

專利名稱：核酸包被的顆粒的製作方法
技術領域：
本發明涉及核酸包被的顆粒，其適於通過無針裝置進行核酸的顆粒介導的遞送。特別地，本發明涉及用於向體內和來自體內(ex vivo)的哺乳動物組織遞送核酸分子的顆粒的應用。
背景技術：
基因治療和核酸免疫對於獲得性和遺傳性疾病的治療和預防均是具有前途的方法。這些技術為將所需核酸轉移到受試者中以及隨後在體內進行表達作準備。轉移可通過轉染來自體內的受試者的細胞或組織，再將經轉化的物質導入宿主中而完成。可替換地，可將核酸直接在體內施用於受體。然而，體內遞送方法必須允許核酸進入受體的細胞以使核酸能被表達。
在這些背景情況下，已發展了許多基因遞送方法。在這些基因遞送方法中，核酸的經皮遞送比口服或腸胃外遞送技術提供了許多優勢。特別地，經皮遞送相對於傳統的給藥系統提供了一種安全、方便和非侵入性的可選擇方法，方便地避免了與以下遞送相關的主要問題口服遞送(例如可變化的吸收率、胃的降解和代謝、肝臟的首過效應、胃腸刺激和/或苦味或使人厭惡的藥物味道)或腸胃外遞送(例如針痛、給接受治療的個體帶來感染的風險、由意外的針刺給衛生保健人員帶來的汙染或感染的風險和對使用過的針的處理)。
然而，核酸的經皮遞送也存在許多內在的問題。通過完整皮膚的被動遞送使通過許多結構上不同的組織的分子轉運成為必需。為能進入血液或淋巴系統，這些結構上不同的組織可包括角質層(主要的屏障)、有活力的表皮、乳頭狀真皮或毛細血管壁。因此，經皮遞送系統必須能克服由各種類型的組織呈現的各種阻力。
因此，針對被動的經皮遞送，已經開發了許多可選擇的方法。這些可選擇方法包括使用皮膚穿透增強劑或「穿透增強物」以增加皮膚的滲透性，也包括使用非化學方式如使用離子電泳、電穿孔或超聲。然而，這些可選擇的技術經常引起其自身的副作用如皮膚刺激或致敏。
最近，已開發了適於經皮遞送核酸的顆粒介導技術。使用顆粒加速裝置將攜帶有感興趣的核酸的顆粒加速到高速並擊入靶組織中。在體內，可將顆粒直接擊入受體細胞，不需要細胞吸收乘載的核酸。
適於顆粒介導的遞送的各種顆粒加速裝置是本領域已知的。現有的裝置使用爆發性的放電或放氣，以向靶細胞推進包被的載體顆粒。例如，Biolistic裝置直接將DNA包被的極小的金珠遞送到表皮細胞中(Yang等(1990)PNAS USA 879568～9572)。使用無針注射器裝置如Bellhouse等人的美國專利號5,630,796中描述的(「PowderJect無針注射器裝置」)也可遞送顆粒。
顆粒介導的裝置意欲允許安全且容易地遞送核酸。然而，需要對顆粒的物理特性進行改造以滿足無針施用的要求，其中通常以非常高的速度擊發顆粒。顆粒需要具有結構完整性，以使其可在例如注射器的氣流或與皮膚或黏膜組織的彈道式碰撞中不被破壞。顆粒具有的密度也是重要的，該密度能使該顆粒獲得足夠動量以穿透組織。然而，對於核酸遞送，顆粒應比細胞的尺寸小，這樣其能穿透細胞膜而不使細胞破裂。核酸自身對貯存期間的降解是敏感的。因此，當與顆粒結合時，需要將核酸維持在穩定條件中。然而，核酸與顆粒的結合也應該在遞送至靶細胞之後允許核酸進行有效的表達。當核酸編碼抗原時，則顆粒結合的方式也應該使該抗原在受試者中具有免疫原性。
根據一種技術，適於顆粒介導的遞送的顆粒可通過將核酸分子包被在惰性金屬載體顆粒上而形成。載體顆粒選自具有合適密度和大小的物質，如鎢或金。已知許多方法用於將DNA或RNA包被或沉澱在金或鎢顆粒上。這些方法一般是將預定量的金或鎢與質粒DNA、CaCl2和亞精胺混合。在包被過程中，將得到的溶液不斷地渦旋以確保反應混合物的均一性。在核酸沉澱後，可將包被的顆粒轉移至合適的膜上且使其在使用前乾燥，或將其包被在樣品模塊或盒的表面上，或將其裝入遞送盒中用於特定的顆粒介導的遞送設備中。

發明內容
已開發了一種新的製劑，以優化粘附於載體顆粒的核酸的穩定性而由此增長顆粒的儲存期和增加遞送給靶細胞的完整核酸量，以及優化遞送至靶細胞後核酸的表達和生理活性。具體地，已發現，在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，可將核酸穩定地粘附於惰性金屬載體顆粒上。
因此，在中性而不是鹼性pH下可將核酸沉澱在載體顆粒上，從而有助於保持核酸的完整性。此外，然後可將顆粒在水性溶液或醇溶液中洗滌而不損失核酸，從而促進增強劑結合的穩定性。核酸的凝聚與螯合劑的化學作用一起保護核酸免受諸如自由基的氧化或核酸內切酶的消化等物理損傷和化學損傷。通過有效的顆粒介導的遞送，可將本發明的顆粒遞送至細胞。儘管有核酸顆粒結合的穩定性問題，但已顯示了核酸在靶細胞中的有效表達。此外已證明了編碼抗原的核酸的免疫效能。
因此，本發明提供了適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，其中該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的。
通過在顆粒製備中使用一種或多種糖和/或鹽，和/或通過用抗氧化劑如乙醇或維生素A、C或E處理顆粒，可進一步改善顆粒製劑。
本發明還提供-一種適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒的製備方法，該方法包括以下步驟(i)在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上；和(ii)收集得到的顆粒；-一種核酸免疫的方法，該方法包括(a)提供適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，其中該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將編碼抗原的核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的；和
(b)給受試者施用有效量的顆粒；一種基因治療的方法，該方法包括(a)提供適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，其中該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將編碼治療性多肽的核酸沉澱至惰性金屬載體顆粒上而獲得的；和(b)給受試者施用有效量的顆粒；和-適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，該顆粒包含惰性金屬載體顆粒，在該惰性金屬載體顆粒表面上具有核酸、金屬離子螯合劑和一種或多種以下成分(i)核酸凝聚劑；(ii)一種或多種二糖和/或三糖；和(iii)一種或多種鹽。
本發明還提供一種用於顆粒介導的遞送裝置的劑量容器，該容器含有本發明的顆粒，以及提供顆粒介導的遞送裝置，該顆粒介導的遞送裝置裝載有本發明顆粒。
根據本文的公開，本發明的這些和其它目的、方面、具體實施方案和優點對於本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
具體實施例方式
在詳細描述本發明之前，應理解本發明不限於特定的示例性分子或方法參數，因為這些當然可以改變。也應理解這裡使用的術語只為了描述本發明的具體實施方案，而不是在於限制。此外，除非有其它明示，本發明的實施使用病毒學、微生物學、分子生物學、重組DNA技術和免疫學的常規方法，其所有方法都是在本領域的普通技術人員的知識範圍內。這些技術已經在文獻中得以充分解釋。例如參見Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(第二版，1989)；DNA CloningA PracticalApproach，第一卷和第二卷(D.Glover編輯)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編輯，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；和Fundamental Virology，第二版，第一卷和第二卷(B.N.Fields和D.M.Knipe編輯)。
無論是上文還是下文，這裡引用的所有出版物、專利和專利申請，在此全部引入作為參考。
必須指出的是，如本說明書和附帶的權利要求書中使用的，單數形式「一種」、「一個」和「所述的」包括複數指示物，除非內容清楚地指示為其它方面。
除非進行了其它方面的定義，這裡使用的所有技術術語和科學術語的含義與本發明所屬技術領域的普通技術人員的一般理解相同。雖然可使用許多與這裡描述的方法和物質相似或等效的方法和物質實施本發明，但是這裡描述的是優選的物質和方法。
A.定義在本發明的描述中，將使用以下術語，且規定為如下顯示的定義。
術語「核酸分子」和「多核苷酸」在這裡可互換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構，且可以行使任何已知或未知的功能。非限制性的多核苷酸的例子包括基因、基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、分離的任何序列的DNA、分離的任何序列的RNA、核酸探針和引物。
多核苷酸通常是由以下四種核苷酸鹼基的特定序列組成的腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(當多核苷酸是RNA時，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))。因此，術語核酸序列是多核苷酸分子的依字母順序的表達。這種依字母順序的表達可被輸入到具有中央處理器的計算機的資料庫中，並被用於生物信息學應用如功能基因組和同源性檢索。
「編碼」選定抗原的核酸序列是當將其置於適當的調控序列的控制下，在體內轉錄(在為DNA的情況下)並翻譯(在為mRNA的情況下)成多肽的核酸分子。編碼序列的範圍是由5』(氨基)末端的起始密碼子和3』(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定的。對於本發明的目的，這樣的核酸序列可包括但不限於來自病毒、原核生物或真核生物mRNA的cDNA、來自病毒或原核生物DNA或RNA的基因組序列、和甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列可定位於編碼序列的3』端。
「載體」能夠將核酸序列轉移至靶細胞(例如，病毒載體、非病毒載體、顆粒載體和脂質體)。典型地，「載體構建體」、「表達載體」和「基因轉移載體」是指任何能指導感興趣的基因進行表達的核酸構建體，其能將基因序列轉移至靶細胞。因此，該術語包括克隆載體和表達載體。「質粒」是一種染色體外遺傳元件形式的載體。
「啟動子」是啟動和調節多核苷酸轉錄的核苷酸序列。啟動子可包括誘導型啟動子(其中可操作地連接於啟動子的多核苷酸序列的表達是由分析物、輔因子、調節蛋白等誘導的)、阻抑型啟動子(其中可操作地連接於啟動子的多核苷酸序列的表達是由分析物、輔因子、調節蛋白等抑制的)和組成型啟動子。術語「啟動子」或「調控元件」意欲包括全長的啟動子區和這些區域的功能性(例如調控轉錄或翻譯)片斷。
「可操作性地連接」是指元件的排列，其中所描述的組件被配置成執行它們通常的功能。因此，當存在適當的酶時，給定的可操作性地連接於核酸序列的啟動子能影響該序列的表達。只要啟動子對指導表達發揮作用，則啟動子不必與該序列鄰近。因此，例如，可在啟動子序列和核酸序列之間存在不被翻譯但被轉錄的間插序列，但啟動子序列仍可被認為「可操作性地連接」於編碼序列。
這裡所用的「重組體」用於描述基因組、cDNA、半合成或合成來源的核酸分子(多核苷酸)，依據其來源或操作，與其天然相關聯的多核苷酸的全部或部分不相關聯，和/或與不同於其天然相連的多核苷酸相連。當兩個包含在單個重組核酸分子內的核酸序列是天然非正常相互關聯時，則它們是相互「異源」的。
「多肽」是使用其最寬泛的含義，是指兩個或更多亞單位胺基酸、胺基酸類似物或其它肽模擬物的化合物。亞單位可通過肽鍵或諸如酯、醚等其它鍵連接。如這裡使用的，術語「胺基酸」是指天然的和/或非天然的或合成的胺基酸，包括甘氨酸和D或L光學異構體，和胺基酸類似物和肽模擬物。如果肽鏈是短的，三個或更多胺基酸的肽一般稱為寡肽。如果肽鏈是長的，則該肽通常稱為多肽或蛋白質。
「抗原」是指任何物質，通常為大分子，其在個體中能引起免疫應答。該術語可用於指單個大分子或抗原性大分子的同源或異源群體。如這裡使用的，「抗原」通常用於指含有一個或多個表位的蛋白質分子或其部分。根據本發明的目的，抗原可獲自或源自任何合適的來源。此外，根據本發明的目的，只要蛋白質保持足夠的免疫原性，「抗原」包括相對於天然序列具有改變如缺失、添加和取代(通常為天然保守的)的蛋白質。這些改變可以是有目的的，例如通過定點突變，或可以是偶然的，如通過使產生抗原的宿主發生突變。
對感興趣的抗原的「免疫應答」是在個體內針對該抗原的體液和/或細胞免疫應答的發展。根據本發明的目的，「體液免疫應答」是指由抗體分子介導的免疫應答，而「細胞免疫應答」是由T-淋巴細胞和/或其它白細胞介導的免疫應答。
術語「核酸免疫」在這裡用於指將編碼一種或多種選定抗原的核酸分子導入到宿主細胞中以在體內表達一種或多種抗原。可通過經皮顆粒遞送，將核酸分子直接導入到受體個體中。可選擇地，可將該分子導入到已從受試者中移除的來自體內的細胞中。在該後者情況中，將含有感興趣的核酸分子的細胞重新導入到受試者中，以至於能針對由核酸分子編碼的抗原啟動免疫應答。在這樣的免疫中使用的核酸分子在這裡通常稱為「核酸疫苗」。
術語「經皮」遞送意指皮內的(例如進入真皮或表皮)、經皮的(例如「經由皮膚的」)和經黏膜的給藥，即將物質通過進入或經由皮膚或黏膜組織進行遞送。參見，例如Transdermal Drug DeliveryDevelopmentalIssues and Research Initiatives，Hadgraff和Guy(編輯)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications，Robinson和Lee(編輯)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery ofDrugs，第1～3卷，Kydonieus和Berner(編輯)，CRC Press，(1987)。因此，該術語包括如美國專利號5,630,796中描述的從無針注射器的遞送，也包括如美國專利號5,865,796中描述的顆粒介導的遞送。
「無針注射器」意指一種經皮遞送顆粒組合物的設備，不需要藉助於常規的針來刺穿皮膚。用於本發明的無針注射器在整個本文中作了討論。
術語「個體」和「受試者」在這裡可交互使用，是指cordata亞門的任何成員，包括但不限於人和包括非人靈長類如黑猩猩和其它猿和猴類等在內的其它靈長類；養殖動物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養哺乳動物如狗和貓；實驗室動物包括嚙齒類如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥，包括家養鳥、野生鳥和獵鳥如小雞、火雞和其它鶉雞類的鳥、鴨、鵝等。該術語不限定特定的年齡。因此，意欲包括成體和新生個體。這裡描述的方法意欲用於任何上述脊椎動物種類，這是由於所有這些脊椎動物的免疫系統以相似的方式發揮作用。
B.一般方法本發明涉及核酸的顆粒介導的遞送。特別地，本發明提供適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，且通過以下方法能獲得該顆粒，所述方法包括或在一些實施方案中基本上由以下組成在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上。
載體顆粒選自具有合適密度和合適顆粒大小的金屬以用於由顆粒介導的遞送裝置進行細胞內遞送。優選地，載體顆粒的密度例如為約15g/ml至25g/ml、約15g/ml至23g/ml或約16g/ml至20g/ml。載體顆粒可具有的直徑為約0.5μm至10μm，例如約1μm至5μm。特別優選載體顆粒具有的直徑為約0.5μm至3μm，例如約1μm至3μm或0.5μm至2μm。
金屬載體顆粒是惰性的，因為其在待施用顆粒的來自體內的細胞內或受試者的體內是不反應的。典型地，使用金、鎢、鉑或銥載體顆粒。優選金或鎢顆粒。金顆粒可以是膠體金顆粒。金顆粒提供尺寸方面的一致性(可獲自Alpha Chemicals，顆粒大小為約1μm至3μm；或可獲自Degussa，South Plainfield，NJ，顆粒大小範圍包括0.95μm)和降低的毒性。微晶金(例如金粉A1570，可獲自Engelhard Corp.，East Newark，NJ)提供不同的顆粒大小分布，典型地，範圍為約0.1μm至5μm。然而，微晶金的不規則表面區域為高效的核酸包被提供了必要的準備。很容易獲得平均直徑大小約為0.5μm至2μm的鎢顆粒。
典型地，核酸分子包括治療上相關核苷酸序列以用於遞送至受試者。優選本發明的顆粒適用於核酸免疫或基因治療。因此核酸可包含能提供免疫的序列，例如當遞送至受試者時，引起體液和/或細胞免疫應答的具有免疫原性的序列。可選擇地，核酸可包含一個或多個編碼治療性多肽的基因，所述治療性多肽例如靶細胞的基因組中具有缺陷或丟失的蛋白質或者具有所需生物學或治療作用(例如抗病毒功能)的非天然蛋白質。核酸可包含編碼具有反義或核酶功能的分子的序列。對於遺傳病症的治療，可將與特定病症中的已知缺陷基因對應的功能性基因施用於受試者。優選地，核酸為DNA。
用於遞送的合適核酸包括用於治療以下疾病的核酸炎性疾病、自身免疫、慢性和感染性疾病包括如AIDS(愛滋病)、癌症、神經疾病、心血管疾病、高膽固醇症；各種血液病症包括各種貧血、地中海貧血和血友病；遺傳缺陷如囊性纖維化、高歇氏疾病、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏、肺氣腫等。許多在治療癌症和病毒病的反義療法中有用的反義寡核苷酸(例如與mRNA翻譯起始位點(AUG密碼子)附近序列互補的短寡核苷酸)已在本領域描述了。參見，例如Han等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 884313；Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90543，Helene等(1990)Biochim.Biophys.Acta.104999；Agarwal等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857079；和Heikkila等(1987)Nature 328445。適於在這裡使用的許多核酶也已被描述了。參見，例如Chec等(1992)J.Biol.Chem.26717479和Goldberg等的美國專利5,225,347。
例如，在治療實體瘤的方法中，可遞送以下物質以在腫瘤位點或附近進行表達編碼毒性肽(即化療劑如蓖麻毒蛋白、白喉毒素和眼鏡蛇毒因子)的基因、抑瘤基因如p53、編碼與轉化癌基因反義的mRNA序列、抗腫瘤的肽如腫瘤壞死因子(TNF)和其它細胞因子的基因，或轉化癌基因的反式顯性的陰性突變體。
同樣地，也可施用編碼已知顯示抗病毒和/或抗菌活性或刺激宿主免疫系統的多肽的核酸。核酸可編碼各種細胞因子(或其功能片段)的一種，如白介素、幹擾素和集落刺激因子。核酸可編碼抗原以用於治療或預防多種病症，包括但不限於癌症、過敏症、由病原體引起的毒性和感染，所述病原體例如但不限於真菌；病毒包括人乳頭狀病毒(HPV)、HIV(人免疫缺陷病毒)、HSV2/HSV1(單純皰疹病毒2/單純皰疹病毒1)、流感病毒(A、B和C型)、脊髓灰質炎病毒、RSV病毒(Rous肉瘤病毒)、鼻病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒、諾沃克病毒群、腸道病毒、星狀病毒、麻疹病毒、Par流感病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒(E-B病毒)、腺病毒、風疹病毒、人T細胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒、馬爾堡病毒和伊波拉病毒；細菌包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、衣原體屬(Chlamydia)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、志賀菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、霍亂弧菌(Vibrio Cholera)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidua)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布魯氏菌(Brucella)、弗朗西絲氏菌(Franciscella tulorensis)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、鉤端螺旋體(Leptospria interrogaus)、嗜肺軍團菌(Legionella pnumophila)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、鏈球菌(Streptococcus，A和B型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、腦膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza，b型)、弓形體(Toxoplama gondic)、Complybacteriosis、黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、腹股溝肉芽腫(Donovanosis)和放線菌病(Actinomycosis)；真菌病原體包括念珠菌病和麴黴病；寄生性病原體包括絛蟲、吸蟲、線蟲、阿米巴病、賈第蟲病、隱孢子蟲屬、血吸蟲、卡氏肺孢子蟲、毛滴蟲病和旋毛蟲病。核酸也可用於提供合適的針對許多獸類疾病的免疫應答，所述獸類疾病如口蹄疫、冠狀病毒、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、螺桿菌、尋常圓線蟲(Strongylus vulgaris)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumonia)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、肺炎克雷白菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌(E.Coli)、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertusssis)和支氣管膿毒博德特氏菌(Bordetellabrochiseptica)。因此在一個方面，本發明的顆粒可用作疫苗。
本發明也可用於反義療法中，例如用於遞送能與特定的互補序列雜交的寡核苷酸從而抑制這些序列的轉錄和/或翻譯。因此可靶向編碼特定疾病進程所需的蛋白質的DNA或RNA，從而阻斷該疾病的進程。反義療法和許多能特異且可預期與某個核酸靶序列結合以抑制或調節致病基因的表達的寡核苷酸是已知的，且對於本領域的技術人員來說是容易獲得的。Uhlmann等(1990)Chem Rev.90543，Neckers等(1992)Int.Rev.Oncogenesis 3，175；Simons等(1992)Nature 359，67；Bayever等(1992)Antisense Res.Dev.2109；Whitesell等(1991)Antisense Res.Dev.1343；Cook等(1991)Anti-cancer Drug Design 6585；Eguchi等(1991)Ann.Rev.Biochem.60631。因此，這裡提供在宿主細胞中可選擇性地與靶序列結合的反義寡核苷酸以用於反義治療中。
典型地，以表達載體形式提供核酸。該表達載體可在分子生物學領域中常規地構建，並例如可包括使用質粒DNA和合適的起始密碼子、啟動子、增強子和其它元件如例如可能必需的聚腺苷酸化信號，且其被置於正確的方向，以允許插入序列的表達。合適的載體對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。在這方面作為進一步的實例可參考Sambrook等，1989。
合適的表達載體包含本發明中使用的可操作性地連接於調控序列的多核苷酸，所述調控序列典型地為啟動子，啟動子能為宿主細胞表達該多核苷酸提供必要準備。優選地載體適用於基因治療方法或核酸免疫方法。可使用來自體內的載體，例如轉化宿主細胞，然後將其再導入到受試者中。可選擇地，可在體內使用載體以直接遞送至受試者。
典型地，載體是一種具有以下元件的質粒複製起點、用於多核苷酸表達的啟動子和可選擇的該啟動子的調節子。載體可含有一個或多個選擇性標記基因，例如氨苄青黴素抗性基因。
選擇啟動子和其它表達調節信號以使其與設計進行表達的宿主細胞相容。可使用誘導型、阻抑型或其它可控制的啟動子。為在哺乳動物宿主或哺乳動物宿主細胞中進行表達，可使用真核和噬菌體控制元件。
合適的哺乳動物啟動子包括能對重金屬如鎘發生應答而被誘導的金屬硫蛋白啟動子和β-肌動蛋白啟動子。組織特異性的啟動子是特別優選的。合適的病毒啟動子包括例如莫洛尼鼠類白血病病毒長末端重複(MMLVLTR)、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、SV40啟動子、人巨細胞病毒(hCMV)立即早期(IE)啟動子、腺病毒、HSV啟動子(如HSV IE啟動子)或HPV啟動子，特別是HPV上遊調節區(URR)。所有這些啟動子是本領域中容易獲得的。
典型地，在每一翻譯終止密碼子的3』端位置，還存在轉錄終止和聚腺苷酸化序列。優選地，在每一編碼序列5』端位置，還存在使翻譯起始優化的序列。轉錄終止/聚腺苷酸化信號的例子包括如Sambrook等所述的源自SV40的那些，也包括牛生長激素終止子序列。此外可包括增強子元件以增強表達水平。合適的增強子的例子包括SV40早期基因增強子(Dijkema等(1985)EMBOJ.4761)、源自Rous肉瘤病毒的長末端重複(LTR)的增強子/啟動子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 796777)和源自人或鼠CMV的元件(Boshart等(1985)Cell 41521)，例如包括在CMV內含子A序列中的元件。
本發明中使用的核酸凝聚劑以將核酸凝聚成更緊密結構的方式與核酸發生相互作用。凝聚後的核酸通常比未凝聚的形式更加穩定，且通常具有更加有序的結構，例如環狀或杆狀。凝聚劑通常是鹼性分子，其與核酸發生相互靜電反應以中和其負電荷。已報導，例如為發生有效的凝聚需要88％-90％的電荷中和(Deng H.和V.A.Bloomfield(1999)Biophys J 771556～1561)。通常，凝聚劑以相對較高的親和力與核酸結合。
可使用任何合適的核酸凝聚劑，包括陽離子聚合物和多價陽離子。在一個實施方案中，凝聚劑是陽離子聚合物或其生理學上可接受的鹽。這樣的藥學上可接受的鹽包括例如無機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴化物、磷酸鹽和硫酸鹽等；和有機酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽等。典型地，所述鹽為鹽酸鹽或硫酸鹽。
優選地，陽離子聚合物為多胺。可使用的多胺包括精蛋白、腐胺、亞精胺、精胺、海美溴銨(Polybrene)、聚精氨酸和聚賴氨酸，或前述多胺的生理學上可接受的鹽。陽離子聚合物可以是含有多胺的肽。
優選地，多胺為鹼性胺基酸的陽離子聚合物。典型地，鹼性胺基酸選自賴氨酸、精氨酸或組氨酸。該聚胺基酸可很容易從Sigma-Aldrich獲得。
聚胺基酸可以是鹼性胺基酸的同聚物。例如，聚精氨酸、聚賴氨酸或聚組氨酸。可選擇地，聚胺基酸可以是一個或多個鹼性胺基酸的聚合物，也可選擇性地包含一個或多個非鹼性胺基酸。因此聚胺基酸可包含一個或多個鹼性胺基酸和選擇性地一個或多個其它胺基酸。該共聚物典型地包含佔主要部分的鹼性胺基酸。例如，共聚物中50％～100％的胺基酸可為鹼性，優選地60％～90％或70％～80％為鹼性。在一個實施方案中，共聚物中至少75％，例如至少85％、95％、98％或99％的胺基酸為鹼性。一般而言，鹼性胺基酸包含一個或多個賴氨酸、組氨酸和精氨酸。當共聚物包含一個或多個非鹼性胺基酸時，優選這些不為酸性胺基酸，如天冬氨酸或穀氨酸。一個或多個非鹼性胺基酸可包括具有脂肪族或芳香族側鏈的胺基酸，例如蘇氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸或苯丙氨酸。
任何上述聚胺基酸中的胺基酸可以是L或D型胺基酸。優選地，使用L-胺基酸。
在一個優選的實施方案中，多胺為精氨酸的同聚物(Arg)x或賴氨酸的同聚物(Lys)x。優選聚L-精氨酸或聚L-賴氨酸，特別是聚L-精氨酸。典型地，同聚物的分子量約為500至15000，例如為500至10000、500至5000或500至1000。在一個實施方案中，上述式子中的x的範圍可為2至100，例如為2至50、2至30或2至20。
特別優選小肽同聚物，例如具有分子量範圍為500至1500，如500至1250或700至1000的那些小肽同聚物。典型地，在小肽中，x的取值為2至10，例如4至8。當x＝4或6的同聚物，例如(Arg)4或(Arg)6在本發明中是特別有用的。
凝聚劑可以是蛋白質的精蛋白家族成員，例如硫酸精蛋白。精蛋白是鹼性蛋白質，其代替組蛋白與精子DNA結合。因此精子核提供例如以下精蛋白的優良來源來自鮭魚精子的鮭精蛋白、來自鯡魚精子的鯡精蛋白、來自鱒魚精子的鱒精蛋白、來自鱘魚精子的鱘精蛋白和來自鯖魚精子的鯖精蛋白。精蛋白、硫酸精蛋白、磷酸精蛋白和精子核可很容易地從Sigma-Aldrich獲得。
其它合適的多胺如腐胺、亞精胺和精胺，與其生理學上可接受的鹽一起也可很容易地例如從Sigma-Aldrich獲得。
凝聚劑也可包含多價陽離子或其生理學上可接受的鹽。這樣的多價陽離子包括例如烏洛託品鈷(III)氯化物(Cohex)、三(乙二胺)鈷(III)氯化物(Coen)和鈷(III)sepulchrate氯化物(Cosep)。合適的生理學上的鹽包括上述列出的與陽離子聚合物相關的鹽。
本領域已知許多能用於鑑定核酸凝聚劑的試驗。一般測定待測核酸分子特性的改變，其中該改變是與凝聚過程關聯的，例如核酸凝縮為固體、核酸分子電荷的中和，或對於諸如核酸內切酶和轉錄因子等物質先前易接近的識別位點的隱藏或封閉。
指示液態核酸製劑凝聚的測定包括但不限於電子或原子力顯微術、顆粒大小、ζ電位、螢光光譜測定、溴乙錠排除測定、凝膠移位、圓二色性和核磁共振。有用的文獻引用的例子為J.Mol Biol(1978)121，311～326；Biophysical Journal(1996)，70，2847～2856，Nucleic Acids Res(1999)27(8)，1943～1949；J.Amer.Chem.Soc.，(1998)120(35)，8903～8909；J.PharmSci(1998)87(6)，678～683和Int.J.Pharm(2000)210(1-2)，97～107。
本發明中使用的螯合劑螯合溶液中的金屬離子。一般發生螯合作用的金屬離子包括Fe2+、Fe3+、Cr3+、Ca2+和Na+離子。優選地，該試劑螯合Ca2+或Na+離子。可選擇地，優選該試劑螯合Fe2+或Fe3+離子。該試劑可以是單個或多個齒狀。例如，合適的試劑包括但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸鹽、多磷酸、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鋰、蘋果酸鈉、蘋果酸鉀、蘋果酸鋰、除鐵靈和乙二胺-二(鄰羥基-苯乙酸)(EDDHA)。典型地，使用EDTA、DTPA或除鐵靈，特別是EDTA或其鹽，例如依地酸二鈉。
還優選在一種或多種二糖和/或三糖的存在下，將核酸沉澱至惰性金屬載體顆粒上。一種或多種糖有助於增加核酸/金屬顆粒的穩定性。
合適的糖包括但不限於蔗糖、蔗糖單月桂酸酯、海藻糖、乳糖、棉子糖和甘露醇。優選地，糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖和棉子糖。
在一個實施方案中，使用一種或多種二糖或三糖的混合物。例如，可使用上述列出的一種或多種糖的混合物。特別優選蔗糖/棉子糖的混合物。典型地，蔗糖/棉子糖以3∶1的重量比混合。
也可在一種或多種鹽的存在下，將核酸沉澱至惰性金屬載體顆粒上。所述一種或多種鹽進一步提供穩定性。該鹽為除了根據本發明可用作螯合劑的任何鹽之外的鹽。因此，該鹽通常是指非螯合性鹽。例如，典型地，該鹽不是蘋果酸鹽或琥珀酸鹽。該鹽也是除了根據本發明可用作核酸凝聚劑的生理學上可接受的鹽之外的鹽。
在一個優選的實施方案中，一種或多種鹽選自氯化物、醋酸鹽、檸檬酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽。合適的鹽包括但不限於醋酸鉀、氯化鈣、氯化鋰、醋酸鈉、硝酸鎂、檸檬酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉和硫酸鉀。優選所述鹽為醋酸鉀。
在一個優選的實施方案中，攜帶有核酸的顆粒與抗氧化劑如乙醇或維生素A、維生素C或維生素E接觸。典型地，用抗氧化劑處理顆粒增加穩定性。典型的處理可包括用抗氧化劑洗滌顆粒。
在一個實施方案中，一個或多個用於顆粒製備的組分與所得的顆粒合併或結合。因此，本發明提供適於從顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，該顆粒包含或有時基本上由以下組分組成惰性金屬載體顆粒，在該惰性金屬載體顆粒的表面上具有核酸、金屬離子螯合劑和一種或多種以下成分(i)核酸凝聚劑；(ii)一種或多種二糖和/或三糖；和(iii)一種或多種鹽。
每一顆粒組分如上面所述。優選地，顆粒至少包含(i)和/或(ii)。
本發明還提供一種本發明顆粒的製備方法。該方法包括或在一些實施方案中基本上由以下步驟組成(i)在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，將核酸沉澱至惰性金屬載體顆粒上；和(ii)收集所得的顆粒；典型地，步驟(i)包括在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過混合使核酸與惰性金屬載體顆粒接觸。優選在接觸過程中不斷地渦旋混合物以確保反應混合物的均一性。優選地，核酸和核酸凝聚劑直到凝聚要發生的時候是相互分離的(例如在分離的溶液中)，例如直到也存在載體顆粒和螯合劑的時候是相互分離的。特別優選將凝聚劑加入到已包含有載體顆粒和核酸的混合物中，以避免核酸過早地發生沉澱。那麼，金屬離子螯合劑可存在於以下兩者或之一中凝聚劑製劑，以及載體顆粒和核酸的混合物。可逐步地例如逐滴地加入凝聚劑。
可選擇地，凝聚劑和載體顆粒的混合物可與核酸製劑混合。
上面已描述了金屬顆粒、核酸、核酸凝聚劑和螯合劑。
在沉澱步驟中該混合物可另外包括一種或多種二糖和/或三糖，例如蔗糖、蔗糖單月桂酸酯、海藻糖、乳糖、棉子糖或甘露醇，或它們的組合。優選地，所述糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖和棉子糖或它們的組合。可使用一種或多種二糖和/或三糖的混合物。例如可使用一種或多種上述糖的混合物。蔗糖棉子糖的混合物是特別有用的，特別是重量比為3∶1的蔗糖棉子糖。
沉澱混合物也可包含一種或多種鹽。該鹽是除了根據本發明可用作螯合劑的任何鹽之外的鹽。因此，該鹽通常是指非螯合性鹽。例如，典型地，該鹽不是蘋果酸鹽或琥珀酸鹽。該鹽也是除了根據本發明可用作核酸凝聚劑的生理學上可接受的鹽之外的鹽。
在一個優選的實施方案中，一種或多種鹽選自氯化物、醋酸鹽、檸檬酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽。合適的鹽包括但不限於醋酸鉀、氯化鈣、氯化鋰、醋酸鈉、硝酸鎂、檸檬酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉和硫酸鉀。典型地，該鹽不是磷酸鋁。優選地，該鹽為醋酸鉀。
糖和/或鹽可存在於待混合的最初製劑例如凝聚劑製劑或載體顆粒/核酸製劑的任一或兩者中。
在一個實施方案中，將包含有預定量的核酸凝聚劑、糖和金屬離子螯合劑的溶液逐滴加入到包含有預定量的金屬載體顆粒、核酸、糖和金屬離子螯合劑的溶液中。鹽可存在於上述溶液的任一或兩者中。
步驟(i)中組分的濃度可以是變化的而基本上不影響所得顆粒中的核酸的穩定性。金屬載體顆粒可以任何合適的量存在，例如在懸液中為0.1mg/ml至100mg/ml如0.1mg/ml至10mg/ml或1mg/ml至10mg/ml。優選地，核酸濃度為0.01mg/ml至10mg/ml，如0.1mg/ml至1mg/ml。典型地，凝聚劑的濃度在0.1mg/ml至10mg/ml，例如0.1mg/ml至1mg/ml。優選地，金屬離子螯合劑濃度為0.1mM至1M，如1mM至0.1M，例如10mM至50mM。如果存在糖，則糖的濃度可例如為0.1mg/ml至1g/ml，優選1mg/ml至0.1g/ml，例如10mg/ml至50mg/ml。如果存在鹽，則鹽的濃度典型地在0.1mM至1M如1mM至0.1M，如10mM至50mM。
本發明的方法可另外包括使核酸顆粒與抗氧化劑接觸。通常該處理包括用抗氧化劑溶液洗滌顆粒。例如可使用乙醇。優選地，該乙醇是蔗糖飽和的乙醇。其它合適的抗氧化劑包括維生素A、維生素C和維生素E。此外，或可選擇地，可用水性溶液或醇溶液如水或異丙醇洗滌核酸顆粒一或多次。
可將包被的、選擇性洗滌的顆粒轉移至合適的膜且使其在使用前乾燥，或將其包被在樣品模塊或盒的表面上，或將其裝入遞送盒中以特別用於顆粒介導的遞送裝置中。可使用任何合適的乾燥方法。優選地在氮氣流條件下進行乾燥。
可將本發明的顆粒包裝於單一單位劑量或多劑量容器中。這樣的容器可包含封入適量顆粒的密封容器。可將顆粒包裝成無菌製劑，因此可對密封容器進行設計以保持該製劑的無菌性直到用於給受試者遞送。容器優選適宜直接用於顆粒介導的遞送裝置中。典型地，這樣的容器採用膠囊、箔袋、香袋、盒等形式。也可以含有合適劑量的包被的顆粒的預裝載狀態提供顆粒遞送裝置。然後也可將預裝載的裝置預先包裝在密封容器中。
可對其中包裝有顆粒的容器進行進一步標記以識別組合物和提供相關的劑量信息。此外，容器可用政府機構例如食品和藥品管理部門規定的形式進行標註，其中，標註顯示在製造業聯邦法律下由該機構批准、其中含有的用於人類施用的核酸製劑的使用或出售。
適於顆粒介導遞送的顆粒加速裝置是本領域已知的。現有的基因槍裝置使用爆發性的放電或放氣以向靶細胞推進包被的載體顆粒。包被的載體顆粒可釋放性地附著於活動的載體薄片上，或可移動地附著於氣流沿著經過的表面，將顆粒從表面提起並使其朝向目標加速。放氣裝置的例子描述於美國專利號5,204,253。一種爆發式的裝置描述於美國專利號4,945,050中。這裡適用的放電裝置的一個例子描述於美國專利號5,120,657中。另一個放電裝置描述於美國專利號5,149,655中。所有這些專利所公開的內容全部引入本文作為參考。
也可使用無針注射器裝置施用本發明的包被的顆粒，所述無針注射器裝置如描述於Bellhouse等人的美國專利5,630,796(「PowderJect無針注射器裝置」)和國際公開號WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513和WO 96/20022中的裝置，所有這些作為參考引入本文。
可提供如美國專利號5,630,796中描述的裝置作為筆形的設備，其以線性順序從頂端到底部移動，含有氣缸、顆粒盒或包、和與消音介質關聯的超聲波噴嘴。在合適的容器內提供顆粒，所述的合適的容器例如由兩個可破裂的聚合物膜形成的盒，所述膜被熱密封成墊圈形狀的墊片以形成配套的密封單元。可選擇膜材料以達到特定類型的打開和爆發壓力，其決定啟動超聲波流的情況。
在操作中，開動裝置將壓縮氣體從氣缸中釋放到裝置內的膨脹室中。釋放的氣體與顆粒盒相接觸，並當增大到足夠的壓力時，突然突破盒膜，席捲顆粒進入用於隨後進行遞送的超聲波噴嘴中。對噴嘴進行設計以獲得特定的氣體速度和流動模式以將一些顆粒遞送至預定區域的目標表面。使用消音器以減弱超聲波氣流產生的噪音。
描述於國際公開號WO 96/20022中的遞送系統也使用壓縮氣體來源的能量以加速和遞送粉狀組合物。然而，其區別於美國專利號5,630,796的系統，其使用衝擊波代替氣流來使顆粒加速。更具體的，由柔性圓頂後面產生的衝擊波提供的瞬間壓力增加擊打圓頂的背面，導致柔性圓頂在目標表面方向上的突然外翻。該突然外翻以足夠的速度例如動量彈射粉末組合物(其位於圓頂的外面)以穿透靶組織例如口腔黏膜組織。在圓頂將要完全外翻的時候釋放粉末組合物。該圓頂也用於完全容納高壓氣流，因此該高壓氣體不與組織接觸。因為在該遞送操作期間不釋放氣體，所以該系統內在就是安靜的。該設計可用於其它封閉的或其它需要靈敏度高的應用例如用於將顆粒遞送至最低侵入程度的手術位點。
本發明的包被的顆粒可在體內直接遞送至受試者，或遞送至取自受試者體內的細胞，然後將轉化的細胞再移植到受試者中。對於在體內遞送，顆粒注射典型地為經皮下、表皮、皮膚內、黏膜內(例如經鼻、直腸和/或陰道)、腹膜內、靜脈內、口或肌肉內施用。優選地，遞送是針對終末分化細胞的；然而，也可將顆粒遞送給未分化的或部分分化的細胞如造血幹細胞和皮膚成纖維細胞。最優選地，遞送是針對皮膚表皮細胞的。
包被的顆粒以與劑量製劑相容的方式和預防和/或治療有效量的方式施用於受試者。本發明顆粒組合物的「治療有效量」將足以引起疾病或病症症狀的治療或預防，且在可由常規試驗測定的相對寬的範圍內。一般地，顆粒以0.001μg至1000μg的量遞送，更優選地每劑為0.01μg至10.0μg的核酸。然而，精確的所需量將依據被治療個體的年齡和一般狀況及選擇的特定核酸序列和其它因素的不同而不同。合適的有效量可很容易地通過臨床試驗測定。為了測定所需量，「醫師用藥參考(Physicians DeskReference)」和「Goodman和Gilman的治療的藥理學基礎(ThePharmacological Basis of Therapeutics)」是有用的。
C.實驗性以下是用於實施本發明方法的具體實施方案的例子。提供這些例子的目的僅用於闡明，而不是旨在以任何方式限制本發明的範圍。已盡力保證使用的數字(例如含量、溫度等)的準確性，但一些實驗誤差和偏差當然應該是允許的。
實施例1在三種DNA/金顆粒製劑「DSEP」(實驗A)、「聚精氨酸」(實驗B)和「修飾的亞精胺」(實驗C)中進行了一系列的實驗以評價不同的糖、螯合劑和其它賦形劑/添加劑的效果。
根據以下一個或多個標準評價不同的顆粒(i)通過洗脫和A260時分光光度測定法或螢光測定法測定顆粒上的DNA產量
(ii)通過凝膠分析或HPLC(高效液相色譜)評價顆粒上的DNA的物理穩定性；(iii)通過光學顯微鏡或驅動進入凝膠來評價顆粒的凝聚作用；(iv)將攜帶有該基因的顆粒導入CHO細胞後，通過測定CHO細胞中螢光素酶報告基因的表達來評價顆粒上的DNA的表達活性；(v)通過測定小鼠血清中抗體的效價來評價顆粒的免疫效能，該小鼠已用攜帶有DNA的顆粒進行了接種，所述DNA編碼與該抗體特異結合的抗原。
對於每一製劑，用上述標準將顆粒按等級排序。
實驗ADSEP製劑根據以下配方製備顆粒金顆粒-DNA-糖-鹽-其它測試的糖選自蔗糖單月桂酸酯、甘露醇、海藻糖、乳糖、棉子糖和蔗糖單癸酸酯。測試的鹽選自醋酸鉀、氯化鈣、氯化鋰、醋酸鈉、硝酸鎂、檸檬酸鈉、磷酸鈉、磷酸鋁、氯化鈉、硫酸鈉和氯化鎂。
如以下所示使用糖和鹽的不同組合。也評價了用蔗糖飽和的乙醇進行洗滌的效果。
結果如下所示，對於每一標準從最大或理想效果到最小效果將不同的糖或鹽按等級排序。例如，對於DNA產量，最高等級的糖導致相對高的DNA產量；對於凝聚作用，最高等級的糖導致相對低水平的凝聚作用。
(i)顆粒上的DNA產量糖蔗糖-蔗糖單月桂酸酯～海藻糖～乳糖～棉子糖＞＞＞蔗糖單癸酸酯(無產量)鹽醋酸鉀～氯化鈣～氯化鋰～醋酸鈉～硝酸鎂＞檸檬酸鈉～磷酸鈉＞＞＞磷酸鋁其它用蔗糖飽和的乙醇進行洗滌不會從金粉中除去DNA在缺少任何鹽時產量非常低(ii)顆粒上的DNA的物理穩定性糖蔗糖＞海藻糖＞甘露醇～乳糖～棉子糖＞蔗糖單月桂酸酯＞蔗糖單癸酸酯鹽醋酸鉀～醋酸鈉～檸檬酸鈉～磷酸鈉＞氯化鈉＞硫酸鈉＞氯化鋰其它用蔗糖飽和的乙醇進行洗滌有助於穩定性磷酸鋁防止沉澱(iii)凝聚作用糖蔗糖單癸酸酯＜棉子糖～乳糖～蔗糖單月桂酸酯＜蔗糖～海藻糖鹽醋酸鉀～氯化鋰～磷酸鈉～檸檬酸鈉～氯化鈉～硫酸鈉＜氯化鈣～氯化鎂＜硝酸鎂(iv)顆粒上的DNA的表達活性蔗糖/醋酸鈉～醋酸鉀/棉子糖～蔗糖/硝酸鎂～醋酸鉀/蔗糖單月桂酸酯(v)小鼠的免疫效能對於室溫下存儲的配方的實時期限3個月時蔗糖/醋酸鈉～亞精胺/CaCl2核酸顆粒1個月時棉子糖/醋酸鉀～蔗糖單月桂酸酯/醋酸鉀～亞精胺/CaCl2核酸顆粒實驗B聚精氨酸製劑根據以下配方製備顆粒金顆粒-DNA-糖-螯合劑-聚精氨酸肽。
測試的糖選自海藻糖、蔗糖和棉子糖。測試的螯合劑選自EDTA、DTPA和除鐵靈(DFO)。測試的聚精氨酸肽選自分子量(Mw)為13000的聚精氨酸、(Arg)6和(Arg)4。測試了糖、螯合劑和聚精氨酸的不同組合。
結果顯示如下，也按最優選組合至最不優選組合或按有效性等級排序。
(i)顆粒上的DNA產量測試的糖海藻糖、蔗糖、棉子糖螯合劑EDTA、DTPA、除鐵靈(DFO)其它13,000Mw、(Arg)6、(Arg)4任一的聚精氨酸肽上述所有組合的產量都超過了理論產量的50％。
(ii)顆粒上的DNA的物理穩定性糖蔗糖＞海藻糖＞棉子糖螯合劑EDTA＞DTPA＞除鐵靈(DFO)其它所有聚精氨酸肽均給出相似的穩定性(iii)凝聚作用對於該製劑沒有問題(iv)顆粒上的DNA的表達活性海藻糖/EDTA/(Arg)4～海藻糖/DTPA/(Arg)4。
使用DNA、金顆粒和亞精胺製備的顆粒顯示了與這些製劑相似水平的表達活性。
(v)小鼠的免疫效能蔗糖/EDTA/(Arg)4＞海藻糖/EDTA/(Arg)4～海藻糖/DTPA/(Arg)4～蔗糖/DTPA/(Arg)4用DNA、CaCl2、金顆粒和亞精胺製備的顆粒產生與海藻糖/EDTA/(Arg)4顆粒相似的免疫效能。
實驗C修飾的亞精胺製劑根據以下配方製備顆粒金顆粒-DNA-亞精胺-糖-鹽-其它。
測試的糖選自蔗糖、海藻糖和棉子糖。測試的鹽選自氯化鎂、硝酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉、硫酸鉀和溴化鈉。
也測試了亞精胺濃度的作用和用特定水/醇溶液處理顆粒的作用。
結果如下所示。
(i)顆粒上的DNA的產量糖棉子糖＞海藻糖＞蔗糖鹽MgCl2～MgNO3～CaCl2＞硫酸鈉～硫酸鉀～溴化鈉其它亞精胺濃度和醇/水％也影響產量。
(ii)顆粒上的DNA的物理穩定性糖棉子糖＞海藻糖＞蔗糖鹽MgCl2＞MgNO3＞CaCl2＞硫酸鈉～硫酸鉀～溴化鈉(iii)凝聚作用對於該製劑沒有問題實施例2不同的DNA包被的顆粒的穩定性研究使用不同比例的硫酸精蛋白、EDTA、水、和海藻糖、蔗糖或乳糖中的一種製備包被的顆粒。根據10種不同比例製備顆粒，如示於表1的10個配方。在4℃和60℃且在第0、7和14天時間點測試根據每一比例製備的顆粒的穩定性。
方法對於每一比例，根據表1製備試管A和B。將試管A和B的內含物以高速渦旋10秒，或直到每一溶液均很好地混合。當以中等速度渦旋試管A時，用5ml移液管逐滴加入試管B的內含物。將試管A進一步渦旋15秒，然後使內含物靜止5分鐘。移去試管A中的上清液並將剩餘沉澱用1ml的100％異丙醇洗滌一次。將該試管的內含物渦旋並使之沉澱。除去異丙醇並用氮流將沉澱乾燥至粉末。
秤取各顆粒製劑3mg～5mg的並放入1.5ml的微量離心管以用於在4℃或60℃孵育。在第0、7和14天時間點，通過瓊脂糖凝膠電泳和HPLC測試各顆粒製劑中DNA的穩定性。
結果顆粒製劑在整個測試中顯示出相似的穩定性。選擇根據「比例4」(配方4，表1)製備的顆粒做進一步工作。
表1.使用實驗性DOE來優化製備顆粒用的糖和EDTA的濃度。該表頂部橫向的數字為每一試管中糖和EDTA的最終濃度。該表內的數字為以μl為單位加入試管中的各組分。
最終的糖 50 50 50 50 150 150 150 150 100 100 100 100 25 25175 175 100 100 100 100(mg/ml)最終的EDTA 11551155333333 33 0066(mg/ml)

實施例3基於根據「比例4」(配方4)製備的顆粒的進一步穩定性研究根據表1中比例4如實施例2中所述製備顆粒，但以更大規模(350mg金顆粒)，和任一的(a)無二糖(對照)；或(b)海藻糖；或(c)蔗糖；或(d)乳糖。
在4℃和60℃孵育顆粒，8周後通過瓊脂糖凝膠電泳評價顆粒上的DNA的穩定性。
實施例4四精氨酸製劑的開發在對一些配方進行試驗以驗證不同長度的聚精氨酸具有將DNA沉澱在金微粒上的能力之後，通過研究產量和穩定性，建立實驗以研究使用什麼樣的聚精氨酸長度。也研究了糖和螯合劑的選擇，其已在先前的配方中顯示出能提高穩定性。
結果顯示，4和6個單體的聚精氨酸比分子量為13000的聚合物(約80個單體)更有利於穩定性。研究的糖和螯合劑的表現相當。海藻糖和蔗糖都是很好的糖。EDTA和DTPA都是很好的螯合劑。選擇精氨酸四聚物，是由於其比6聚物可能更快地與DNA分離，其也可能形成更少的降解產物。將得到的用於進一步研究的配方命名為TA101.1(DNA、蔗糖、EDTA)、TA101.2(DNA、蔗糖、DTPA)、TA101.3(DNA、海藻糖、EDTA)、TA101.4(DNA、海藻糖、DTPA)。
將這四種配方在長期的穩定性方面排序和在4、25和40攝氏度進行相互間和亞精胺/CaCl2對照(其中亞精胺和氯化鈣用於將DNA沉澱在金微粒上)的研究。它們的穩定性示於表2中。在小鼠研究和螢光素酶表達實驗(DNA編碼的螢光素酶)中還測試這些配方的生物學活性。
表2101系列的衰變率(SC帶的)

這些活性實驗顯示，該101系列都是有活性的、表達的，且約與亞精胺/CaCl2相等。配方TA101.1和TA101.3的穩定性比TA101.2和TA101.4的穩定性好。這表明螯合劑EDTA比DTPA更穩定，但當製成粉末時，在海藻糖(3和4)和蔗糖(1和2)之間幾乎不存在差別。101系列四精氨酸配方的配方組成示於表3中。
表3101系列的組成

然後，進行兩個實驗，其中海藻糖和EDTA的飽和水平用作製劑環境。隨同這些篩選的為多級乙醇水平。這些製劑利用接近飽和的溶液能將更多

表2

表5在不同溫度條件下TA的穩定性

表4加熱溫度和凝膠性質

表5加熱時間和凝膠性質

透明度評價T透明，透光度為10％T或以上T/C半透明，透光度為1％T到小於10％TC白色渾濁，透光度小於1％T實施例1高濃度凝膠用食物切割機將上面製備實施例中所得的酸性可溶的大豆蛋白質切割以製備固體含量按重量計為14％的糊。向糊中加入0.03％蔗糖素(sucralose)(San-Ei Gen F.F.I.，Inc.)和0.2％桔子香料(InternationalFlavors Fragrances Inc.)並將混合物勻漿並去泡沫。將混合物置於耐熱容器中，然後在恆溫箱中80℃下加熱30分鐘。所得凝膠食物是清澈的並且質地是有適當彈性的和所希望的。
這些數據清楚地顯示，根據用1mg載體顆粒裝載2μg DNA劑量在ND5.5轉染的動物上進行的抗體ELISA(酶聯免疫吸附測定)和ELISPOT(酶聯免疫斑點測定)應答測試中，配方TA201.5與亞精胺/CaCl2是競爭性的。在ELISPOT數據(根據Mann-Whitney標準)中，該配方顯示了持續大於或等於亞精胺/CaCl2的性能。
測定了配方TA201.5的最終組成。表7顯示從TA201.5粉末測定的全部組成範圍。
表7TA201.5的最終全部組成和範圍

*在EDTA 4(-)狀態中測定EDTA，且報導作為該物質的質量(沒有鈉、水或氫，如參見容器上的F.W.(分子式質量))。
表8顯示了用於製造四精氨酸製劑的原料。
表8原料

隨後的過程用於配製35mg金粉規模的TA201.5。
設備天平渦旋器超聲波儀離心機2ml的離心(eppendorf)管1ml、200μl移液管空氣流試劑的製備11.3mg/ml四精氨酸(批號523352)稱重0.8至1.0mg四精氨酸。每mg重量加入88.5μl的H2O。這會交換許多不同的內含物。
海藻糖溶液稱重至少30mg海藻糖(供應商示於原料列表中)。每30mg重量加入120μl的H2O，或比海藻糖多4倍量的水(以質量或μl，因為單位為1mg/μl)。
500mM的Na2EDTA溶液形式的該物質可從Sigma預定(見原料列表的產品目錄號)。
方法試管B在將乙醇和DNA加入到試管A之前準備好試管B。加入螯合劑溶液、糖溶液、乙醇和四精氨酸溶液。高速渦旋10秒。
試管A將金稱重到試管中。加入螯合劑溶液和糖溶液。超聲30秒，高速渦旋1分鐘。當渦旋時逐滴加入乙醇。加入DNA溶液。加入DNA後，如下所述將試管B加入到試管A。
配製步驟當以中等速度渦旋試管A時(確信金被混合到整個溶液中)，逐滴加入試管B的內含物。當已將試管B的所有物質加入到試管A後，將含有最終的四精氨酸製劑的試管A高速渦旋1分鐘。使該製劑靜置5分鐘。渦旋，然後離心10秒。用移液管移出上清液，並將其保存以用於分析。用250μl乙醇洗滌沉澱。渦旋30秒，超聲3秒。將沉澱離心下來10秒並移去乙醇。用250μl乙醇再次洗滌沉澱。渦旋30秒，超聲3秒。將沉澱離心下來10秒並移去乙醇。用空氣流以0.5L/分鐘的流速乾燥粉末2小時。
試管A 試管B·金粉，35mg·EDTA，26.25μl ·EDTA，26.25μl·海藻糖，70μl·海藻糖，70μl·超聲30秒，渦旋1分鐘 ·四精氨酸，70μl·乙醇，183.75μl渦旋時逐滴加入·乙醇，183.75μl·DNA，70μl ·渦旋10秒試管A和試管B 當渦旋時將試管B逐滴加入到試管A中 渦旋1分鐘 使靜置5分鐘 離心10秒並移去上清液 用250μl醇洗滌，渦旋30秒，超聲3秒，離心10秒，移去 用250μl醇洗滌，渦旋30秒，超聲3秒，離心10秒，移去 在空氣或氮氣中乾燥2小時在配方TA201.5的整個製備過程中，該配製過程是先製備每一成分的單獨貯存液，然後將其以一定順序加入到配製試管中。然而，潔淨室內配製該配方將需要無菌過濾步驟。開始進行「主液混合(master mixing)」實驗以滿足該需要(NB2334-80)。該策略利用試管A(主液A)和試管B(主液B)中所有水性成分的主液混合物。然後將混合物用注射器過濾至無菌，過濾後物質進入製劑試管中。主液混合實驗將由主液混合過程和標準過程製備的粉末根據穩定性和全部組成進行相互比較。
表9主液混合實驗中的最終的組成

表10主液與標準的穩定性

-表10中的半衰期是通過將兩個半衰期計算值進行平均來計算的。一個源自ng SC的衰變率(60℃相對於4℃)，而另一個源自％SC的衰變率(60℃相對於4℃)。
由於兩個方法生產出相同的最終產物，因此可認為主液混合策略是沒有問題的，且可用於後面TA201.5粉末的粉末製劑。進行進一步的方法實驗以決定哪個方法步驟是關鍵的實驗以70mg規模由相同的貯存溶液製備配方1～9。通過以製劑比例混合EDTA、海藻糖和DNA溶液，然後用注射器過濾，來製備試管A的主液混合物。通過以製劑比例混合EDTA、海藻糖和四精氨酸溶液，然後用注射器過濾，獲得試管B的主液混合物。然後通過以下過程製備配方1試劑的製備(用於10、70mg製劑)DNA以1mg/ml提供質粒和編碼螢光素酶的DNA的儲存液。以SC18螢光素酶為9∶1的體積比混合該兩種DNA溶液。
1500μl的SC18+166.7μl的螢光素酶DNA。
11.3mg/ml四精氨酸稱重約20mg四精氨酸。每mg重量加入88.5μl的H2O。
海藻糖溶液稱重至少700mg的海藻糖。每35mg重量加入140μl的H2O，或比海藻糖多4倍量的水(以質量或μl，因為單位為1mg/μl)。
500mM的EDTA溶液形式的該物質可從Sigma預定(產品目錄號E-7889)。
主液A體積比1500μl海藻糖、562.5μl的EDTA、1500μl的DNA(1mg/ml)將主液A用注射器過濾主液B體積比1500μl海藻糖、562.5μl的EDTA、1500μl的四精氨酸將主液B用注射器過濾試管A 試管B70mg金332.5μl的主液混合物A 332.5μl的主液混合物B367.5μl的乙醇，在渦旋時逐滴加入 367.5μl的乙醇超聲30秒，渦旋10秒渦旋10秒試管A和試管B當渦旋時將試管B逐滴加入到試管A中當加入試管B的所有物質後，高速渦旋1分鐘使靜置5分鐘渦旋5秒，然後離心10秒，*移去上清液用500μl的乙醇洗滌，渦旋30秒，超聲3秒，離心10秒，*移去重複最後的步驟1次以0.5L/分鐘在空氣下將沉澱乾燥1小時該過程是對照製劑。下表顯示了粉末2～9的方法變化。

剩餘的製劑為加入順序改變的配方，以評價該製劑中1主液混合物的可能性。該方法與對照相似。
主液混合物的體積比400μl海藻糖、150μl的EDTA和200μl四精氨酸將主液混合物用注射器過濾配方1070mg金525μl的主液混合物735μl乙醇，在渦旋時逐滴加入超聲30秒，渦旋10秒140μl的DNA，在渦旋時逐滴/慢慢地(兩滴之間暫停5秒)加入加入B的所有物質後，高速渦旋1分鐘使靜置5分鐘渦旋5秒，然後離心10秒，*移去上清液用500μl的乙醇洗滌，渦旋30秒，超聲3秒，離心10秒，*移去重複最後的步驟1次以0.5L/分鐘在空氣下乾燥沉澱*離心後從沉澱中移去液體是用1000μl移液管移除大部分液體，接著用200μl移液管移去剩餘的液體進行的，以儘可能少地留在粉末上。
分析所有的粉末的全部組成、穩定性、CHO細胞中螢光素酶表達和凝膠射擊(gel shots)。
表11方法穩健性實驗的組成

表1260℃條件下方法穩健性實驗的穩定性

-上面的數字是根據從配製日期起至13和20天在納克的超螺旋DNA中的變化計算的。
比例和半衰期相互很接近。這顯示了配製方法在穩定性方面是穩健的。配方5和7具有比其它配方稍好的穩定性，但配方9和10具有顯著的穩定性優勢(3X)。配方9是沒有洗滌的(且不適宜處理)，而配方10是通過加入順序的變化獲得的。
表達數據顯示了配方是很相似的(300～400千次計數/秒)。新製備的亞精胺/CaCl2配方表達更多(或在分析細胞時具有更多的表達物質)，而且測得更高的釋放質量。配方10和7相對於其它四精氨酸配方具有一些螢光素酶表達優勢(450～600千次計數/秒)。總體上，該實驗證明該方法是非常穩健的。
穩健性的另一方面是改變用於製備配方的加入和過程順序的作用。在一個這樣的實驗(NB2251-124)中，研究用相同的精確原料(量和濃度)製備配方的不同方法。該實驗僅考慮設計用於以不同順序使組分沉澱的配方的穩定性。這大概具有很大的作用，原因在於能將DNA在穩定劑之前、同時或之後直接沉澱在金上。
配製方法1.試管A和B方法。除了A具有DNA，而B具有四精氨酸之外，試管A和B具有相同的組成。將兩者都很好地混合，然後將B逐滴加入到A中。
2.另一種試管A和B方法。這次，在試管A(具有金)中，在加入DNA溶液之前加入乙醇，以在DNA加入之前用過量的糖預包被金。然後將DNA加入到試管A中，然後立即將試管B加入到試管A中。
3.該方法被設計成同時沉澱DNA和穩定劑。除了DNA和乙醇之外，將所有組分加入到一個試管中。然後，將DNA和乙醇一起混合併加入。
4.該方法在乙醇加入之前沉澱DNA。除了DNA、四精氨酸和乙醇之外，將所有組分加入到一個試管中。這些最後組分的加入順序分別為DNA、四精氨酸和乙醇。
5.除了在DNA之前加入四精氨酸之外，該方法與4相同。乙醇仍然為最後。
將這些製劑置於4℃和60℃的孵育箱中，且配製後2周進行分析。通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，雖然粉末4和5(乙醇最後，在乙醇之前DNAARG4絡合)稍微更加穩定，這些粉末之間總體上沒有區別。
因此，已描述了新的適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的核酸包被的顆粒、製備該顆粒的方法，和使用該顆粒進行基因治療和核酸免疫的方法。雖然已對本發明的優選實施方案做了一些詳細描述，但應理解，在不脫離所附權利要求中定義的本發明的精神和範圍內，可進行顯而易見的改變。
權利要求
1.適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的。
2.如權利要求1所述的顆粒，其中所述的惰性金屬載體顆粒選自金、鎢、鉑或銥顆粒。
3.如權利要求2所述的顆粒，其中所述的惰性金屬載體顆粒為直徑約為1μm至3μm的金顆粒。
4.如前述任一項權利要求所述的顆粒，其中所述的核酸編碼抗原。
5.如權利要求4所述的顆粒，其中所述的抗原選自病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
6.如權利要求1至3任一項所述的顆粒，其中所述的核酸編碼治療性多肽。
7.如前述任一項權利要求所述的顆粒，其中所述的核酸為DNA。
8.如前述任一項權利要求所述的顆粒，其中所述的核酸凝聚劑為陽離子聚合物。
9.如權利要求8所述的顆粒，其中所述的核酸凝聚劑為多胺。
10.如權利要求9所述的顆粒，其中所述的多胺選自精蛋白、亞精胺、精胺、腐胺或它們的生理學上可接受的鹽。
11.如權利要求9所述的顆粒，其中所述的多胺為聚精氨酸或聚賴氨酸。
12.如權利要求11所述的顆粒，其中所述的聚精氨酸為(Arg)4或(Arg)6。
13.如前述任一項權利要求所述的顆粒，其中所述的金屬離子螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸鹽、多磷酸、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鋰、蘋果酸鈉、蘋果酸鉀、蘋果酸鋰、除鐵靈或乙二胺-二(鄰羥基-苯乙酸)(EDDHA)。
14.如前述任一項權利要求所述的顆粒，其中所述沉澱是在一種或多種二糖和/或三糖的存在下進行的。
15.如權利要求14所述的顆粒，其中所述的一種或多種糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖或棉子糖。
16.如權利要求15所述的顆粒，其中所述的一種或多種糖為蔗糖和棉子糖的混合物。
17.如前述任一項權利要求所述的顆粒，其中所述沉澱是在一種或多種鹽的存在下進行的。
18.如權利要求17所述的顆粒，其中所述一種或多種鹽選自醋酸鉀、氯化鈣、氯化鋰、醋酸鈉、硝酸鎂、檸檬酸鈉、磷酸鈉或氯化鎂。
19.如前述任一項權利要求所述的顆粒，其中得到的顆粒與抗氧化劑接觸。
20.如權利要求19所述的顆粒，其中所述抗氧化劑選自乙醇、維生素A、維生素C或維生素E。
21.如權利要求1所述的顆粒，其中該顆粒是在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，通過將DNA沉澱在金載體顆粒上而獲得的。
22.一種用於顆粒介導的遞送裝置的劑量容器，該容器含有以下顆粒，該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的。
23.一種顆粒介導的遞送裝置，該遞送裝置裝載有以下顆粒，該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的。
24.如權利要求23所述的顆粒介導的遞送裝置，該遞送裝置為無針注射器。
25.一種適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒的製備方法，該方法包括以下步驟(i)在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑存在下，將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上；和(ii)收集所得的顆粒。
26.如權利要求25所述的方法，其中在步驟(i)中將核酸凝聚劑加入到包含有惰性金屬載體顆粒和核酸的混合物中。
27.如權利要求25或26所述的方法，其中所述的惰性金屬載體顆粒選自金、鎢、鉑或銥顆粒。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述的惰性金屬載體顆粒為直徑約為1μm至3μm的金顆粒。
29.如權利要求25至28任一項所述的方法，其中所述的核酸編碼抗原。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述的抗原選自病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
31.如權利要求25至28任一項所述的方法，其中所述的核酸編碼治療性多肽。
32.如權利要求25至31任一項所述的方法，其中所述的核酸為DNA。
33.如權利要求25至32任一項所述的方法，其中所述的核酸凝聚劑為陽離子聚合物。
34.如權利要求33所述的方法，其中所述的核酸凝聚劑為多胺。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述的多胺選自精蛋白、亞精胺、精胺、腐胺或它們的生理學上可接受的鹽。
36.如權利要求34所述的方法，其中所述的多胺為聚精氨酸或聚賴氨酸。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述的聚精氨酸為(Arg)4或(Arg)6。
38.如權利要求25至37任一項所述的方法，其中所述的金屬離子螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸鹽、多磷酸、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鋰、蘋果酸鈉、蘋果酸鉀、蘋果酸鋰、除鐵靈或乙二胺-二(鄰羥基-苯乙酸)(EDDHA)。
39.如權利要求25至38任一項所述的方法，其中步驟(i)進一步在一種或多種二糖和/或三糖的存在下進行。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述一種或多種糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖或棉子糖。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述一種或多種糖為蔗糖和棉子糖的混合物。
42.如權利要求25至41任一項所述的方法，其中步驟(i)進一步在一種或多種鹽的存在下進行。
43.如權利要求42所述的方法，其中所述一種或多種鹽選自醋酸鉀、氯化鈣、氯化鋰、醋酸鈉、硝酸鎂、檸檬酸鈉、磷酸鈉或氯化鎂。
44.如權利要求25至43任一項所述的方法，其中由步驟(i)得到的顆粒與抗氧化劑接觸。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述抗氧化劑選自乙醇、維生素A、維生素C或維生素E。
46.如權利要求25所述的方法，該方法包括以下步驟(i)在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，將DNA沉澱在惰性金顆粒上；和(ii)收集所得的顆粒。
47.一種核酸免疫的方法，該方法包括(a)提供適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，其中該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將編碼抗原的核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的；和(b)給受試者施用有效量的該顆粒。
48.一種基因治療的方法，該方法包括(a)提供適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，其中該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將編碼治療性多肽的核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的；和(b)給受試者施用有效量的該顆粒。
49.如權利要求47或48所述的方法，其中所述的惰性金屬載體顆粒選自金、鎢、鉑或銥顆粒。
50.如權利要求49所述的方法，其中所述惰性金屬載體顆粒為直徑約為1μm至3μm的金顆粒。
51.如權利要求47至50任一項所述的方法，其中所述的核酸為DNA。
52.如權利要求47至51任一項所述的方法，其中所述的核酸凝聚劑為陽離子聚合物。
53.如權利要求52所述的方法，其中所述的核酸凝聚劑為多胺。
54.如權利要求53所述的方法，其中所述的多胺選自精蛋白、亞精胺、精胺、腐胺或它們的生理學上可接受的鹽。
55.如權利要求53所述的方法，其中所述的多胺為聚精氨酸或聚賴氨酸。
56.如權利要求55所述的方法，其中所述的聚精氨酸為(Arg)4或(Arg)6。
57.如權利要求47至56任一項所述的方法，其中所述的金屬離子螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸鹽、多磷酸、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鋰、蘋果酸鈉、蘋果酸鉀、蘋果酸鋰、除鐵靈和乙二胺-二(鄰羥基-苯乙酸)(EDDHA)。
58.如權利要求47至57任一項所述的方法，其中所述沉澱是在一種或多種二糖和/或三糖存在下進行的。
59.如權利要求58所述的方法，其中所述一種或多種糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖或棉子糖。
60.如權利要求59所述的方法，其中所述一種或多種糖為蔗糖和棉子糖的混合物。
61.如權利要求47至60任一項所述的方法，其中所述沉澱在一種或多種鹽的存在下進行的。
62.如權利要求61所述的方法，其中所述一種或多種鹽選自醋酸鉀、氯化鈣、氯化鋰、醋酸鈉、硝酸鎂、檸檬酸鈉、磷酸鈉或氯化鎂。
63.如權利要求47至62任一項所述的方法，其中所得的顆粒與抗氧化劑接觸。
64.如權利要求63所述的方法，其中所述抗氧化劑選自乙醇、維生素A、維生素C或維生素E。
65.如權利要求47所述的方法，該方法包括以下步驟(a)提供適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，其中該顆粒是在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，通過將編碼抗原的DNA沉澱在金顆粒上而獲得的；和(b)給受試者施用有效量的該顆粒。
66.如權利要求48所述的方法，該方法包括以下步驟(a)提供適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，其中該顆粒是在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，通過將編碼治療性多肽的DNA沉澱在金顆粒上獲得的；和(b)給受試者施用有效量的該顆粒。
67.適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒，該顆粒包含惰性金屬載體顆粒，在該惰性金屬載體顆粒的表面上具有核酸、金屬離子螯合劑和一種或多種以下成分(i)核酸凝聚劑；(ii)一種或多種二糖和/或兩種三糖；和(iii)一種或多種鹽。
全文摘要
本申請提供一種適於由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的顆粒。該顆粒是在核酸凝聚劑和金屬離子螯合劑的存在下，通過將核酸沉澱在惰性金屬載體顆粒上而獲得的。本申請還描述了製備該顆粒的方法，和使用該顆粒的治療方法，其中包括核酸免疫的方法和基因治療的方法。
文檔編號A61K48/00GK1694721SQ03825135
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月29日 優先權日2002年9月27日
發明者克裡斯·羅伯特·萊夫利, 羅伯特·德朗 申請人:磨粉機械研究有限公司