中藥複方藥物組合物的新用途

2023-12-03 09:10:01

中藥複方藥物組合物的新用途
【專利摘要】本發明公開了含有下述重量配比的原料藥在製備提高母胎免疫耐受的藥物中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山藥8-16份、枸杞子9-12份、菟絲子8-16份、鹿角膠8-16份。本發明補腎複方可以提高母體的母胎免疫耐受性，有望治療母胎免疫失衡導致的習慣性流產、妊高徵、IUGR等病理性妊娠，臨床應用前景良好。
【專利說明】中藥複方藥物組合物的新用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種中藥複方藥物組合物的新用途，具體地，是在製備提高母胎免疫 耐受的藥物中的用途。

【背景技術】
[0002] 妊娠是一個複雜的生理過程。從免疫學角度看，帶有父方抗原的胎兒及其附屬物 類似半異體移植物，將引致母體免疫系統對其進行免疫識別及應答；從妊娠結局來看，又與 移植不同，母體對胎兒存在免疫耐受，即母胎免疫耐受，使胎兒不致被排斥。母胎免疫耐受 對於成功妊娠十分重要，一旦母胎免疫失衡，將發生習慣性流產、妊高徵、IUGR等病理性妊 娠。
[0003] 傳統上人們普遍認為，任何細胞膜上都有MHC-I作為其表面標誌，MHC-I反映了 細胞內部的基因構成。然而研究進展，母胎免疫耐受的機制是直接接觸母血液及免疫系統 的胎兒滋養細胞，表面卻不表達反映細胞內部基因構成的MHC-I抗原，而是表達不具備多 態性的HLA-G。
[0004]HLA-G，人白細胞抗原-G(humanleucocyteantigen-G)，其與MHC-I有相似的結 構域功能，但是其在不同物種見具有高度同型特徵，因此母體NK細胞不能識別表達了此抗 原的滋養細胞，故對胎兒胎盤不具備殺傷力。此外，HLA-G還有免疫趨化作用，這種作用在 胎兒發育中起到關鍵作用。對HLA-G的識別導致母體免疫細胞釋放特定的化學信號，這些 信號對妊娠期免疫系統進行調。研究發現。在體外受精時，排卵前可溶性HLA-G水平過低 與早期流產有關；另外，HLA-G在正常妊娠的滋養細胞上表達增加，而在先兆子癇患者的胎 盤中則減少或缺乏。換句話說，HLA-G表達水平是反應機體母胎免疫耐受情況的重要指標， 可以通過檢測HLA-G表達水平的變化來判斷機體母胎免疫耐受情況。
[0005] 此外，研究發現，腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF)受體超家族Fas/ FasL、卩引哚胺 2, 3-二氧化酶（indoleamine2, 3-dioxygenase,IDO)、avP3 也在母胎免疫 耐受中具有關鍵作用，它們的表達水平可以反應機體母胎免疫耐受情況。


【發明內容】

[0006] 本發明的技術方案是提供了中藥複方藥物組合物的新用途。具體地，是在製備提 高母胎免疫耐受的藥物中的用途。
[0007] 本發明含有下述重量配比的原料藥在製備提高母胎免疫耐受的藥物中的用途：熟 地18-30份、山茱萸9-12份、山藥8-16份、枸杞子9-12份、菟絲子8-16份、鹿角膠8-16份。
[0008] 其中，所述原料藥的重量配比如下：熟地24份、山茱萸9-12份、山藥12份、枸杞子 9-12份、菟絲子12份、鹿角膠12份。
[0009] 其中，所述原料藥的重量配比如下：熟地24份、山茱萸12份、山藥12份、枸杞子12 份、菟絲子12份、鹿角膠12份。
[0010] 優選地，所述藥物是以前述組合物為活性成分，加上藥物上可接受的輔料或者輔 助性成分製備而成的製劑。
[0011] 其中，所述的製劑是口服製劑。
[0012] 所述的口服製劑是顆粒劑、散劑、丸劑、膠囊劑、片劑或口服液。
[0013] 本發明補腎複方可以上調HLA-G、Fas/FasL、IDO和aV33基因的表達，表明其具 有提高母體的母胎免疫耐受性的作用，可以製備成為提高母胎免疫耐受的藥物，有望治療 母胎免疫失衡導致的習慣性流產、妊高徵、IUGR等病理性妊娠，臨床應用前景良好。
[0014] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0015] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容 所實現的技術均屬於本發明的範圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1左歸丸含藥血清組、陽性對照組及空白組中各種基因轉錄表達情況；縱坐標 為2A et，其中與" 表示兩組比較p< 〇.〇5 ;
[0017] 圖2左歸丸含藥血清組、陽性對照組及空白組中各種基因轉錄表達情況；縱坐標 為2A'其中與"表示兩組比較p < 〇. 〇5 ;
[0018] 圖3為10%濃度的含藥血清各基因時間梯度表達情況，橫坐標為基因，縱坐標為 2Aet，其中與"表示兩組比較P< 〇.〇5 ;
[0019] 圖4左歸丸含藥血清組、陽性對照組及空白組中aVe3蛋白表達情況；縱坐標為 ng/mgprot，其中與表示兩組比較P< 0? 05 ;
[0020] 圖5左歸丸含藥血清組、陽性對照組及空白組中HLA-G蛋白表達情況；縱坐標為 ng/mgprot，其中與表示兩組比較P< 0? 05 ;
[0021] 圖610%濃度的含藥血清av運3蛋白表達的時間梯度情況；橫坐標為時間，縱坐 標為ng/mgprot，其中與"表示兩組比較P< 0? 05 ;
[0022] 圖710%濃度的含藥血清HLA-G蛋白表達的時間梯度情況橫坐標為時間，縱坐標 為ng/mgprot，其中與"表示兩組比較P< 0? 05 ;

【具體實施方式】
[0023] 實施例1本發明藥物組合物的製備
[0024] 稱取原料：熟地24g、山茱萸12g、山藥12g、枸杞子12g、菟絲子12g、鹿角膠12g;
[0025] 製備方法：以上六味，除鹿角膠外，其餘熟地黃等五味粉碎成細粉，過篩混勻。取鹿 角膠烊化，與上述細粉混勻，烘乾密封保存，為粉末散劑，兌水服用；或每l〇〇g粉末加煉蜜 l〇g與適量的水，泛丸，乾燥，得丸劑；或取粉末，加入藥學上可接受的輔料或者輔助性成分 製備成顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液。
[0026] 實施例2本發明藥物組合物的製備
[0027] 稱取原料：熟地24g、山茱萸9g、山藥12g、枸杞子9g、菟絲子12g、鹿角膠12g;
[0028] 按實施例1方法製備。
[0029] 實施例3本發明藥物組合物的製備
[0030] 稱取原料：熟地18g、山茱萸9g、山藥8g、枸杞子9g、寬絲子8g、鹿角膠8g;按實施 例1方法製備。
[0031] 實施例4本發明藥物組合物的製備
[0032] 稱取原料：熟地30g、山茱萸12g、山藥16g、枸杞子12g、寬絲子16g、鹿角膠16g;按 實施例1的方法製備。
[0033] 上述原料可以用原生藥,也可以用原生藥的炮製品。
[0034] 以下是通過實驗例證明本發明的有益效果：
[0035] 實驗例1本發明補腎複方上調母胎免疫耐受相關基因的表達
[0036] 1 材料
[0037] 1. 1標本來源標本來自2013年10月至2014年4月在成都中醫藥大學附屬醫院孕 5?10周行人工流產術的正常妊娠婦女的孕早期絨毛組織。
[0038] 1. 2實驗儀器細胞培養箱（Thermo公司，3111型），電熱恆溫水浴箱（上海醫療七 廠），倒置顯微鏡（Leica公司，DMI3000B型），酶標儀（Thermo公司，Multiskanspectrum)， 定量PCR儀（Bio-Rad公司，CFX96)，內切式組織勻漿器（ART-MICCRA)，紫外分光光度儀 (BECKMAN)〇
[0039] 1. 3試劑及引物RPMI1640培養液、胎牛血清、I型膠原酶、EDTA、雙 抗（Gibco-BRL，MD，USA);無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷（成都科龍化工試劑廠）； DiagnosticKitforHumanleukocyteantigenG(HLA-G)(ELISA)(Sichuanxinchuang Biotechco.，CTD);HumanTotalIntegrinav|3 3ELISA(R&DSystems,Catalog No.DYC30502,USA) ；Trizol?reagents(Macherey-Nagel，15596-026);iScriptcDNA SynthesisKit(BI0-RAD，Lot: 170-8891) ;Q-PCR分析試劑盒（Roche公司，FastStart UniversalSYBRGreenMaster(ROX));引物（上海捷瑞生物工程有限公司、英濰捷基貿易 有限公司）。
[0040] 2 方法
[0041] 2. 1絨毛組織培養手術前將負壓吸引瓶等手術器械高壓滅菌，取材後，用PBS洗滌 絨毛組織隨即放入RPMI1640培養液（青鏈黴素：100U/ml)中。在顯微鏡下除去血凝塊等 雜質，挑選絨毛短、分支多、有微絨毛的部分，PBS清洗，置平皿中剪成糜狀，加入2mg/mlI 型膠原酶（0. 02%EDTA)水浴消化10-20min，用等體積RPMI1640培養液（10%胎牛血清） 終止消化，l〇〇〇rpm/min，離心3min,棄上清。如此漂洗1?2次，加入少量完全培養液，制 成組織細胞懸液，按5塊/cm2的濃度接種於24孔板中，37°C、5%C02培養，24h後補足培養 液，此後每3d換液一次，每天鏡下顯微觀察。
[0042] 2. 2資衝顆粒含藥血清的製備
[0043] 資衝顆粒湯劑，取實施例1的資衝顆粒原料藥，按標準方法加水煎煮，於4°C貯存。
[0044] 將10隻體重均一、雌雄各半的大鼠給予資衝顆粒湯劑灌服，給藥劑量均為5. 0g/ kg，給藥容量均為20ml/kg。於給藥後30min、60min、90min眼底靜脈叢取血，血液靜置2h， 3000rpm離心10min，分離不同時間段血清，將3個時間段的血清混勻，高效液相色譜（High PerformanceLiquidChromatography，HPLC)分析血清，過濾除菌備用。
[0045]2. 3資衝顆粒含藥血清處理絨毛組織①組織培養5天後進行分組實驗，即濃度為 2%、5%、10%的資衝顆粒含藥血清組，陽性對照組（〇〇]11：1'〇1組，即孕酮：1000叩/1111)和空 白組（blank組，即無FBS的RPMI1640培養基），連續處理72h;②對檢測獲得高表達的含藥 血清組，進行時間梯度（24h、48h、72h)的篩選，檢測方法同前。以上實驗分組均設3個復孔 並重複實驗2次。
[0046] 2. 4絨毛組織中相關基因表達的檢測棄各組上清液，提取相關孔組織的總RNA，經 紫外分光光度儀定量並檢測其純度（A260/A280均在1. 8?2. 0之間），立即合成cDNA，最 後以cDNA為模板，採用SybrGreenQpcr試劑進行實時螢光定量PCR分析。檢測基因為 HLA_G、av03、Fas/FasL、IDO,內參基因為人P-Actin。針對上述基因的檢測引物採用軟 件PrimerExpress5. 0設計，引物信息見表1。
[0047] 2.5絨毛組織中av03和HLA-G基因蛋白表達的檢測用PBS收集各組絨毛組織， 加入1%蛋白酶抑制劑，用組織勻漿器進行勻漿（l〇〇〇rpm/min)，離心lOmin，吸取上清液， 採用雙縮脲法，按照總蛋白測定試劑盒說明書操作，酶標儀於562nm處檢測上清液總蛋白 濃度。再採用ELISA法檢測各組上清中avP3、HLA_G蛋白表達，嚴格按照avP3、HLA_G 試劑盒說明書的實驗步驟進行，用全自動酶標儀在450nm處讀取0D值，獲得av03、HLA-G 的濃度；最後計算av運3、HLA-G蛋白與組織總蛋白的比值，如此獲得av運3、HLA-G的 相對蛋白含量。
[0048] 2. 6數據分析實驗數據均採用SPSS17. 0統計軟體進行分析，結果以x±s表示，各 組間兩樣本均數比較採用獨立樣本t檢驗，P< 0. 05則為具有統計學意義。
[0049] 表1針對不同子宮內膜容受性及母胎免疫耐受相關基因的Qpcr引物
[0050]

【權利要求】
1. 含有下述重量配比的原料藥在製備提高母胎免疫耐受的藥物中的用途：熟地18-30 份、山茱萸9-12份、山藥8-16份、枸杞子9-12份、菟絲子8-16份、鹿角膠8-16份。
2. 根據權利要求1所述的用途，其特徵在於：所述原料藥的重量配比如下：熟地24份、 山茱萸9-12份、山藥12份、枸杞子9-12份、菟絲子12份、鹿角膠12份。
3. 根據權利要求2所述的用途，其特徵在於：所述原料藥的重量配比如下：熟地24份、 山茱萸12份、山藥12份、枸杞子12份、菟絲子12份、鹿角膠12份。
4. 根據權利要求1?3任意一項所述的用途，其特徵在於：所述藥物是以權利要求1? 3任意一項所述組合物為活性成分，加上藥物上可接受的輔料或者輔助性成分製備而成的 製劑。
5. 根據權利要求4所述的用途，其特徵在於：所述的製劑是口服製劑。
6. 根據權利要求5所述的用途，其特徵在於：所述的口服製劑是丸劑、顆粒劑、散劑、膠 囊劑、片劑或口服液。
【文檔編號】A61P37/06GK104257987SQ201410554112
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】陸華, 梁麗梅, 劉芊辰, 劉志斌 申請人:成都中醫藥大學