超臨界流體技術製備軟組織去細胞基質的方法與流程

2023-12-03 05:51:11 1

本發明涉及臨床醫學、生物醫學與再生醫學技術領域，尤其是涉及一種超臨界流體技術製備軟組織去細胞基質的方法。

背景技術：

去細胞基質是用適當的方法將組織/器官進行去細胞處理，除去組織中可能引起排斥反應的細胞成分，保持組織/器官的三維結構。與金屬、塑料等非動物來源的材料相比，去細胞基質的成分和結構更接近人體組織，生物相容性更優異，這使之成為組織工程修復中應用最為廣泛的材料。去細胞的過程就是通過物理方法、化學方法和生物酶等方法除去組織/器官中的細胞，儘量降低其中的細胞成分等免疫原性物質的含量。去細胞方法的有效性取決於多種因素，如細胞類型、組織密度、厚度和脂質含量等。

軟組織去細胞基質中，含有豐富的膠原蛋白、氨基聚糖等，具有良好的生物相容性和生物力學性能。多種軟組織去細胞基質，如真皮去細胞基質、小腸黏膜下層去細胞基質、血管去細胞基質等，在組織工程研究中已經被廣泛用於皮膚、血管、腹壁等組織缺損的再生修復，並表現出良好的促進組織再生能力。因此，將軟組織中的細胞成分，使之成為不含細胞的軟組織去細胞基質，可以用作合適細胞遷移、生長和增殖的生物支架材料。

現有的軟組織去細胞基質製備工藝多採用蛋白酶和十二烷基硫酸鈉(sds)等溶液除去組織中的細胞，但這些試劑對組織的作用劇烈，對基質成分破壞嚴重，容易導致組織基質降解。另外，這些試劑不易除去，殘留在組織中可能會引起細胞毒性，生物相容性較差。

傳統的軟組織去細胞基質製備工藝容易導致基質成分容易被破壞，而且試劑殘留嚴重，植入組織中可能引起嚴重的免疫排斥反應。

傳統的軟組織去細胞基質製備工藝可能導致基質降解，力學性能下降。

傳統的軟組織去細胞基質製備工藝需要耗費大量的時間除去組織中的殘留細胞和殘留的試劑。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種軟組織去細胞基質的製備方法，該方法去細胞效率高，對軟組織的基質成分的破壞更小，同時使其免疫原性低，生物相容性好。

為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：

一種軟組織去細胞基質的製備方法，該方法包括：使用超臨界流體技術製備軟組織去細胞基質，所述軟組織為天然軟組織，所述天然軟組織包括小腸組織，血管組織，肌肉組織，心臟組織，瓣膜組織，肺組織，脾臟組織，腎臟組織，肝臟組織，胃組織，膽囊組織，脂肪組織，軟骨組織，氣管組織，食道組織，膀胱組織，輸尿管組織，輸卵管組織或子宮組織。

優選地，該方法具體包括預處理，消毒，去細胞，漂洗和滅菌步驟。

優選地，所述預處理為在4-10℃條件下，除去所述軟組織中的雜質組織，洗淨待用。

優選地，所述消毒為用過氧乙酸溶液、乙醇溶液和新潔爾滅中的一種振蕩浸泡或幾種混合後振蕩浸泡經過預處理的軟組織，再用生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液或去離子水漂洗至ph為中性。

優選地，所述過氧乙酸溶液的濃度為0.01-0.1wt％；所述乙醇溶液的濃度為1-10％；所述新潔爾滅的濃度為0.05-1wt％；所述浸泡時間為0.5-24h。優選地，所述去細胞和漂洗均採用超臨界co2流體處理。

優選地，所述去細胞步驟的流體處理的條件為：處理的時間為0.5-24h，處理的壓強為8-40mpa，處理的溫度為33-40℃，處理後的洩壓速度為0.1-1mpa/min。

優選地，所述去細胞步驟的流體處理過程中加入甲醇、無水乙醇、三氟乙醇和丙酮中的一種或多種極性溶劑作為夾帶劑，所述夾帶劑體積為所述軟組織總體積的1-100倍。

優選地，所述漂洗步驟的流體處理的條件為：處理的時間為6-48h，處理的壓強為8-40mpa，處理的溫度為33-40℃，處理後的洩壓速度為0.1-1mpa/min；所述漂洗步驟的流體處理過程中加入濃度為0.5-10wt％的三羥甲基氨基甲烷溶液或無水乙醇作為夾帶劑，夾帶劑的體積為組織體積的1-100倍。

上述方法製備的軟組織去細胞基質。

本發明的有益效果如下：

1.超臨界co2擴散係數大，傳質速度快，能在短時間內滲透到軟組織基質內部，在數分鐘或者數小時就能滲透到軟組織基質內部，而傳統的化學試劑通常需要1天甚至數天才能完全滲透至軟組織基質內部，作用於組織中的細胞；

2.co2具有良好的脂質溶解性能，可以溶解細胞中的脂質成分，破壞細胞膜的完整性；

3.洩壓過程中，壓力下降時細胞因胞內外壓差較大而急劇膨脹發生破裂，釋放細胞內容物，便於後續處理中將細胞內容物更徹底地除去，降低軟組織基質中的免疫原性；

4.洩壓過程中，co2由超臨界狀態恢復至氣態，快速從軟組織基質中逃逸出來，不易殘留在組織中，避免化學試劑在軟組織基質中殘留，減少用於除去基質中化學試劑的漂洗時間，縮短去細胞處理的時間周期；

5.超臨界co2流體技術製備的軟組織去細胞基質，去細胞效率高，對軟組織的基質成分的破壞更小，得到的軟組織去細胞基質免疫原性低、生物相容性好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1a為實施例1中製備得到的豬小腸黏膜下層去細胞後放大10倍的組織染色圖；

圖1b為實施例1中製備得到的豬小腸黏膜下層去細胞後放大20倍的組織染色圖。

具體實施方式

下面將結合附圖對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

生物衍生材料是指天然生物組織經過特殊處理後形成的一種生物材料。近年來去細胞組織基質(acellulartissuematrix)越來越多的被用於生物衍生材料。

傳統的軟組織去細胞基質製備工藝容易導致基質成分容易被破壞，而且試劑殘留嚴重，植入組織中可能引起嚴重的免疫排斥反應。

傳統的軟組織去細胞基質製備工藝可能導致基質降解，力學性能下降。

傳統的軟組織去細胞基質製備工藝需要耗費大量的時間除去組織中的殘留細胞和殘留的試劑。

而超臨界co2擴散係數大，傳質速度快，能在短時間內滲透到軟組織基質內部，在數分鐘或者數小時就能滲透到軟組織基質內部，而傳統的化學試劑通常需要1天甚至數天才能完全滲透至軟組織基質內部，作用於組織中的細胞；

co2具有良好的脂質溶解性能，可以溶解細胞中的脂質成分，破壞細胞膜的完整性；

洩壓過程中，壓力下降時細胞因胞內外壓差較大而急劇膨脹發生破裂，釋放細胞內容物，便於後續處理中將細胞內容物更徹底地除去，降低軟組織基質中的免疫原性；

洩壓過程中，co2由超臨界狀態恢復至氣態，快速從軟組織基質中逃逸出來，不會殘留在組織中，避免化學試劑在軟組織基質中殘留，減少用於除去基質中化學試劑的漂洗時間，縮短去細胞處理的時間周期。

所以，本發明的發明人將超臨界流體技術用於製備軟組織去細胞基質。

採用超臨界流體技術去軟組織細胞基質包括如下步驟：

預處理，消毒，去細胞，漂洗和滅菌步驟。

在一個優選的實施方式中，預處理為在低溫條件下，去除組織中的其他組織成分，洗淨待用。

在另一個優選的實施方式中，消毒為用過氧乙酸溶液、乙醇溶液、或新潔爾滅浸泡的一種振蕩浸泡或幾種混合後振蕩浸泡經過預處理的軟組織，再用水漂洗至ph為中性；

過氧乙酸溶液的濃度優選為0.01-0.1wt％；乙醇溶液的濃度優選為1-10％；新潔爾滅的濃度優選為0.05-1wt％；浸泡時間優選為0.5-24h。

在另一個優選的實施方式中，去細胞採用超臨界co2流體處理；

去細胞步驟的流體處理的條件為：處理的時間優選為0.5-24h，處理的壓強優選為8-40mpa，處理的溫度優選為33-40℃，處理後的洩壓速度優選為0.1-1mpa/min；

去細胞步驟的流體處理過程中加入甲醇、無水乙醇、三氟乙醇和丙酮的一種或多種作為夾帶劑，所述夾帶劑的體積為所述軟組織組織體積的1-100倍。

在另一個優選的實施方式中，漂洗採用超臨界co2流體處理；

漂洗步驟的流體處理的條件為：處理的時間優選為6-48h，處理的壓強優選為8-40mpa，處理的溫度優選為33-40℃，處理後的洩壓速度優選為0.1-1mpa/min；

漂洗步驟的流體處理過程中加入濃度優選為0.5-10wt％的三羥甲基氨基甲烷或無水乙醇溶液作為夾帶劑，夾帶劑的體積為組織體積的1-100倍。

在另一個優選的實施方式中，採用γ射線輻照滅菌。

實施例1

對軟組織採用超臨界流體技術進行去細胞，以豬小腸黏膜下層為例，包括如下步驟：

預處理：取豬小腸空腸段，在低溫環境下，將漿膜層、肌層和黏膜層刮除，用清水漂洗至澄清，得到豬小腸黏膜下層；

消毒：用濃度為0.02wt％的過氧乙酸溶液和濃度為4％的乙醇溶液振蕩浸泡2h，用清水漂洗至ph為中性；

去細胞：用超臨界co2流體處理2h，壓強為20mpa，溫度為37℃，加入無水乙醇的作為夾帶劑，無水乙醇的體積為豬小腸黏膜下層體積的20倍，洩壓速度為0.5mpa/min；

漂洗：用超臨界co2流體處理20h，壓強為20mpa，溫度為37℃，加入濃度為2wt％的三羥甲基氨基甲烷溶液作為夾帶劑，洩壓速度為0.5mpa/min；

滅菌：採用γ射線輻照滅菌，輻照劑量為25kgy。

實施例2

對軟組織採用超臨界流體技術進行去細胞，以豬小腸黏膜下層為例，包括如下步驟：

預處理：取豬小腸空腸段，在低溫環境下，將漿膜層、肌層和黏膜層刮除，用清水漂洗至澄清，得到小腸黏膜下層；

消毒：用濃度為0.08wt％的過氧乙酸溶液或濃度為0.1wt％的新潔爾滅溶液振蕩浸泡0.5h，用清水漂洗至ph為中性；

去細胞：用超臨界co2流體處理0.5h，壓強為30mpa，溫度為37℃，加入無水乙醇和丙酮的混合物作為夾帶劑，無水乙醇和丙酮的混合物的體積為豬小腸黏膜下層體積的30倍，洩壓速度為0.2mpa/min；

漂洗：用超臨界co2流體處理15h，壓強為30mpa，溫度為37℃，加入濃度為0.5wt％的三羥甲基氨基甲烷溶液作為夾帶劑，洩壓速度為1mpa/min；

滅菌：採用射線輻照滅菌，輻照劑量為25kgy。

實施例3

對豬小腸黏膜下層採用超臨界流體技術進行去細胞，包括如下步驟：

預處理：取豬小腸空腸段，在低溫環境下，將漿膜層、肌層和黏膜層刮除，用清水漂洗至澄清，得到豬小腸黏膜下層；

消毒：用濃度為0.04wt％的過氧乙酸溶液和濃度為5％的乙醇溶液振蕩浸泡1h，用清水漂洗至ph為中性；

去細胞：用超臨界co2流體處理3.5h，壓強為10mpa，溫度為37℃，加入無水乙醇和丙酮的混合物作為夾帶劑，無水乙醇和丙酮的混合物的體積為豬小腸黏膜下層體積的10倍，洩壓速度為1mpa/min；

漂洗：用超臨界co2流體處理12h，壓強為10mpa，溫度為37℃，加入濃度為4％的乙醇溶液作為夾帶劑，洩壓速度為0.2mpa/min；

滅菌：採用伽馬射線輻照滅菌，輻照劑量為25kgy。

實施例4

對實施例1中去細胞處理前後的豬小腸黏膜基質進行he染色，如圖1a和1b所示，圖1a為放大10倍圖，圖1b為放大20倍圖，染色結果表明，實施例1中處理後的豬小腸黏膜下層中基本看不到細胞了，說明該工藝可以有效除去豬小腸黏膜下層基質中的細胞，降低基質的免疫原性。

實施例5

參考國家標準yy/t0606.25-2014對實施例1至實施例3去細胞處理前後的豬小腸黏膜基質進行了dna殘留量檢測，經上述去細胞工藝處理後，豬小腸黏膜下層基質中的dna殘留量為41.89ng/mg，去細胞基質材料中dna殘留低於50ng/mg。

最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。