檢測性別分化阻斷劑的方法

2023-11-03 12:05:07

專利名稱：檢測性別分化阻斷劑的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速評估化學物質的內分泌阻斷活性的方法，以及醫學、藥理學、環境研究和營養學領域的一系列與之相關的技術。
在環境署的過度期報導(1997年7月)「Exogenous EndocrineDisrupting Chemical Task Force」中報導了能導致內分泌阻斷的物質(或各種類型的物質)。不過，相信所述物質的類型在將來的研究過程中會進一步增加。
測定內分泌阻斷活性的已知方法被分成兩類，即體外方法和體內方法。體外方法的例子包括測定結合雌激素受體、雄激素受體或甲狀腺激素受體的活性的方法，以及測定抑制激素合成酶活性的方法。體內方法的例子包括在產後的不同日期測定各種激素的產生和異常組織形成的方法，測定蛙的異常變態的方法，以及測定魚的異常成熟的方法(分析化學，70，15528A-532A，1998)。
優選體外方法，因為該方法是靈敏的，並且，該方法可用於在短時間內分析多個檢測樣品。不過，採用體外方法不能確定內分泌是否確實被阻斷，因為該方法只能確定結合受體或類似物的活性。另一方面，採用體內方法可以直接檢驗對內分泌的實際影響，在該方法中，使用諸如大鼠、蛙、或魚之類的動物。因此，為了測定對活體或環境的影響，這樣的方法是必需的。不過，體內方法也有缺陷，因為，例如其靈敏度低，需要複雜的操作，並且，如果要檢查多個樣品的話，需要很長時間。
例如，業已建立了一個系統，通過該系統可以監測雄性向雌性的轉化，以便評估內分泌阻斷活性。所述監測是利用抗卵黃原蛋白抗體測定雌性體內魚雌性專一性卵黃前體蛋白卵黃原蛋白的表達而實現的。不過，要用該系統一次處理大量樣品是困難的。估計用該系統評估成魚時的靈敏度，低於使用魚苗的評估系統，因為魚苗更容易受破壞活性的影響。該系統還具有其它問題，因為它需要大的飼養空間和長的飼養時間。另外，該系統需要針對要評估的相應魚的抗卵黃原蛋白抗體。
業已提出了利用成魚所產的卵的數量或卵的可孵化性作指數的評估方法，以及監測求偶行為等的評估方法(Lisa，D.等，環境毒理學和化學，1749-57，1998)。不過，用上述方法不能確定性別分化是否確實被阻斷。
性別分化的阻斷可以通過確定個體的基因型性別和表現型性別並對其進行相互比較而檢驗。例如，業已提出了一種用於分析阻斷活性的系統，其中，用性別顛倒作指數。在該系統中，在培育魚苗或卵時對其使用環境激素，然後測定與第二性別特徵相關的表現型性別。例如，對於青鱂來說，可以用PCR確定基因型性別(Shinoyama，A.等，魚類生物學雜誌青鱂，1031-31，1999)，或基因型性別與色素表達連鎖的青鱂系d-rR(Yamamoto，T.，實驗動物學雜誌，123571-594，1958)或Qurt(Wada，H.等，動物學科學，15123-126，1998)。為了對生殖腺進行顯微鏡檢查，需要製備組織切片，以便確定魚苗的表型型性別。因此，要處理大量的檢測樣品是困難的。為了根據與第二性別特徵相關的鰭的形狀確定表現型性別，需要飼養至少一個月。另外，測定也需要技巧。同樣，用該方法處理大量檢測樣品也是困難的。如上文所述，體內分析需要從評估開始算起的很長的時間，並且難於一次分析大量的檢測樣品。不過，這樣一種體內分析方法，是評估化學物質或水環境或監測水汙染所必需的。另外，還需要建立快速而又精確的分析系統。
檢查內分泌阻斷活性，可以提供一種用於評估化學物質對人體的影響，用於測定當其釋放到環境中時對活體的影響或對生態系統的影響，或用於監測水汙染的指數。不過，現有技術具有上述缺陷。因此，需要一種用於測定內分泌阻斷活性的靈敏而又快速的方法。
本發明大體上如下文所述。本發明的第一方面涉及根據其表現型性別以雌性專一性形式表達的基因，該基因具有選自由SEQ ID NO1-21的核苷酸序列所構成的一組的核苷酸序列。本發明還涉及能在嚴格條件下與所述序列雜交的基因，以及具有所述序列並具有被插入的一個內含子或幾個內含子的基因。
本發明的第二方面涉及一種評估樣品的性別分化阻斷活性的方法，該方法包括(1)給青鱂服用要評估其性別分化阻斷活性的樣品；(2)確定青鱂的基因型性別；(3)根據雌性專一性基因的表達確定青鱂的表現型性別；和(4)根據步驟(2)和(3)的結果確定性別分化是否被阻斷。
本發明的第三方面涉及一種檢測內分泌阻斷劑的方法，包括用所述第二方面的方法評估性別分化阻斷活性。
本發明的第四方面涉及用於檢測所述第一方面的基因的寡核苷酸。
本發明的第五方面涉及利用所述第二方面的方法評估性別分化阻斷活性的試劑盒。
本發明的第六方面涉及用於通過所述第三方面的方法檢測內分泌阻斷劑的試劑盒。發明詳述下面詳細說明本發明。
本發明可應用於不受限制的任何樣品，包括天然存在的或人工合成的化合物。所述物質能以分離形式或混合物形式用於本發明的方法。本發明的方法還可用於取自環境的樣品，如河水或土壤等。
將青鱂用作本發明方法的生物。這是一種被廣泛用作研究基因的材料，因為它較小並且容易操作，它在產卵時能釋放大量的卵子，其世代周期短(大約3個月)，並且，通過近交可以獲得遺傳學上純合的系。青鱂在孵化之後，可以在96孔微量平板上用蒸餾水飼養大約1周。由於不需要飼料，在評估時可以排除由餌料所產生的諸如阻斷活性的二級因素。
青鱂的飼養可以在包括淡水和海水在內的、含有各種濃度的鹽的水中進行，飼養溫度為大約0-大約30℃的很寬的溫度範圍。因此，可將其用於評估各種環境。
用於本發明的青鱂不受具體限制。可以使用野生型青鱂或其基因型性別與色素表達連鎖的青鱂系，如d-rR或Qurt。
Qurt是leucophore free(lf)基因座雜合的青鱂系，該基因座與性別緊密連鎖。Qurt的雌性(Xlt/Xlf)個體是無色的，而雄性(Xlf/Y+)個體由於色素表達的結果是黃色的。黃色可以出現在卵上。因此，本發明優選使用Qurt，因為不需要提取DNA，通過對卵進行顯微鏡檢查就可以方便地確定其基因型性別(動物學科學，15123-126，1998)。
根據本發明，用於確定基因型性別的方法不受特別限制。例如，通過對性別染色體進行遺傳學分析可以確定基因型性別。
青鱂的基因型性別是根據受精時性別染色體的以下組合決定的X/X為雌性；而X/Y為雄性。因此，基因型性別可以通過性別染色體的遺傳學分析確定。遺傳學分析的方法沒有特別限制。例如，該分析可以通過用能與性別染色體上的一個基因雜交的探針進行雜交而實現，或者通過使用能用於擴增性別染色體上的一個基因的引物進行PCR而實現。如果所述方法被用於確定基因型性別，還必須製備來自個體的DNA和RNA。這是因為必須利用RNA分析雌性專一性基因的表達，以便按下文所述方法確定表現型性別。在這種情況下，將魚苗的頭部切掉。將含有生殖腺等的剩餘的身體部分用於測定基因的表達，該基因是根據表現型性別進行專一性表達的，如下文所述。將從頭部提取的DNA用於確定基因型性別。或者，可以用QIAGEN RNA/DNA系統(QIAGEN)同時製備DNA和RNA。另外，可以用DNeasy96組織試劑盒(QIAGEN)同時製備來自96孔微量平板的多個檢測樣品的DNA。
如果使用青鱂系Qurt，可以在受精後次日識別基因型性別所特有的色素表達的差別。因此，不需要製備DNA，通過檢測色素就可以確定卵的基因型性別。
根據本發明的方法，將青鱂的以表現型性別專一性方式表達的基因用於確定表現型性別。使用以表現型雌性專一性方式表達的青鱂基因。在孵化之後5天內專一性表達的基因可優選用於早期的評估。
所述基因的例子包括以下基因(1)FIGα，含有一個鹼性螺旋-環-螺旋基序的轉錄因子；(2)eIF-4，延長起始因子的帽結合亞基；(3)編碼含有ZP結構域的蛋白的基因；(4)42Sp50和42Sp43，編碼卵細胞專一性RNA儲存蛋白的基因；(5)醌還原酶基因；和(6)編碼分泌蛋白的未知基因。
所述基因的例子是這樣的基因，該基因具有SEQ ID NO1-21的序列或能在嚴格條件下與所述序列雜交的序列。例如，嚴格雜交條件包括披露於以下文獻中的條件T.Maniatis等(著)，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室，1989。所述條件的例子如下在65℃下，在含有6×SSC(1×SSC0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.5％SDS、5×denhardt’s和100毫克/毫升鯡魚精DNA的溶液中與探針一起培養過夜。
所述基因可存在於插入了一個內含子或幾個內含子的染色體上。本發明還包括具有插入了一個或幾個內含子的所述基因。所述基因的例子包括具有SEQ ID NO22的核苷酸序列的基因(插入了內含子的SEQ IDNO1的序列)或具有SEQ ID NO23的核苷酸序列的基因(插入了內含子的SEQ ID NO8的序列)。
例如，上述基因可以按下文所述方法分離。
青鱂的性別分化最初表現為這樣一種現象，在孵化時(即受精後大約第10天)，雌性體內生殖細胞的數量大約為雄性的兩倍(Satoh，N.，Egami，N.，胚胎學實驗形態學雜誌，28385-395，1972)。這是因為雌性體內的一部分生殖細胞在孵化之後馬上開始有絲分裂，而雄性體內的生殖細胞直到孵化之後2個月才開始分裂。用生殖細胞系的性別分化差別作指標，可以在早期發育階段鑑定以雌性專一性形式表達的基因。通過扣除雜交可以檢查青鱂雄性和雌性之間的基因表達差別。在孵化之前，基因型雄性和雌性是彼此分離的。在孵化之後從基因型雄性和雌性中提取RNA。然後，可以通過扣除雜交分離以雌性專一性形式表達的基因。如果使用青鱂系Qurt，利用色素基因的表達作指標，在孵化之前或受精後次日可以方便地區分基因型雄性和雌性。
通過用由此獲得的基因作探針根據已知方法篩選基因組文庫，可以分離相應於每一個基因的基因組基因。
所述基因可以用根據該基因的核苷酸序列設計的寡核苷酸檢測。用於檢測本發明基因的寡核苷酸包括，但不限於可用於根據基因擴增方法擴增所述基因或該基因的一部分的引物，以及能夠在嚴格條件下與該基因雜交的探針。
可以使用的基因擴增方法的例子包括，但不限於PCR、SDA、NASBA和ICAN(WO 00/56877)。
引物或探針可以視需要根據該基因的核苷酸序列設計。當然，在設計時選擇一種序列，以便引物或探針不會在分子內部形成二級結構，並且要注意的是，使得引物或探針以及相應模板的解鏈溫度(Tm值)設定為合適的溫度。
例如，引物或探針的Tm值可以按以下公式確定Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)其中，N是引物或探針的鏈長；％G+C是引物或探針中鳥嘌呤或胞嘧啶殘基的含量。
如果引物或探針的鏈長短於18個鹼基，例如，Tm值可以計算為腺苷和胸苷(A+T)殘基的數量乘以2(℃)的乘積和G+C的殘基的數量乘以4(℃)的乘積的總和，即[(A+T)X2+(G+C)X4]。
儘管不是要限定本發明，但探針的鏈長優選為15個鹼基或更多，更優選18個鹼基或更多，以避免非專一性雜交。
儘管不是要限定本發明，例如，可以使用鏈長為15-40個鹼基的引物。特別是，可以優選使用鏈長為17-30個鹼基的引物。
另外，需要對引物進行設計，以使3』末端周圍的胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的比例變高。用於引物設計的商業化軟體，如OLIGOTM引物分析軟體(Takara Shuzo)可用於設計引物。
在所述引物或探針的一部分序列上可以具有突變，如一個核苷酸(或幾個核苷酸)的缺失、取代、插入或添加，只要它能用於檢測該基因即可。對於引物來說，最好沒有突變，或者如果有的話，要減少該引物3』末端周圍的突變，因為這種突變會大大影響引物延伸反應的效率。在引物的5』末端可以添加與該基因的核苷酸序列無關的合適序列(例如，可以由RNA聚合酶識別的啟動子序列)。
可以對所述引物或探針選擇性地進行合適的修飾。在引物或探針上添加諸如生物素或洋地黃毒苷或螢光物質的配體，有利於擴增反應產物的檢測。
用所述引物進行的基因擴增反應的產物，可以用以下方法檢測擴增反應之後，對一部分反應混合物進行電泳，然後用溴化乙錠對DNA進行染色。可以通過雜交不進行電泳來檢測擴增產物。如果使用修飾過的引物，可以使用適合修飾的檢測方法。
可以構建包括所述引物或探針的試劑盒，並用於檢測本發明的基因。所述試劑盒可以包括用於擴增反應或雜交的緩衝液或酶。該試劑盒還可以包括一種用於從細胞製備核酸樣品或用於檢測擴增產物的試劑，以便使得該檢測更方便。
檢測基因表達的方法沒有特殊限制。例如，可以通過Northern雜交、RT-PCR等檢測用孵化後第1-第5天青鱂製備的RNA中由所述基因轉錄的mRNA來檢測所述表達。
可以用青鱂製備RNA，例如，通過用TRIzol試劑(Gibco-BRL)等直接處理青鱂個體。或者，可以用QIAGEN RNA/DNA系統(QIAGEN)同時製備RNA和DNA。在這種情況下，DNA可直接用於確定基因型性別。另外，可以用RNeasy96試劑盒(QIAGEN)由96孔微量平板上的多個測試樣品同時製備DNA。
為了排除由於基因組DNA擴增產物所導致的假陽性結果，需要使用一對引物進行RT-PCR，該引物可用於擴增由感興趣的基因轉錄的mRNA的一部分，並將其設計成使得該基因的相應部分含有被插入的一個內含子或幾個內含子。例如，可以用引物F1(SEQ ID NO30)和引物R1(SEQ ID NO31)的組合、引物F2(SEQ ID NO32)和引物R2(SEQID NO33)的組合等檢測基因5。引物F1、R1、F2和R2分別具有外顯子2、8、2和7的序列。
如果使用引物F1和R1，由mRNA擴增的產物的大小大約為730bp，而由基因組DNA擴增的產物的大小大約為1.1kbp。如果使用引物F2和R2，由mRNA擴增的產物的大小大約為590bp，而由基因組DNA擴增的產物的大小大約為0.9kbp。因此，由mRNA擴增的產物與作為背景的由基因組DNA擴增的產物明顯不同。
利用上述引物對可以實現更靈敏的檢測，用引物對F1和R1進行第一輪PCR，然後用引物對F2和R2進行嵌套PCR。
可以用引物863.3(SEQ ID NO24)和引物863.1(SEQ ID NO25)的組合，引物863.3(SEQ ID NO24)和引物1/15(SEQ ID NO26)的組合等檢測基因1。引物863.3、863.1和1/15分別具有外顯子1、3和4的序列。如果使用引物863.1和863.3，由mRNA擴增的產物的大小大約為300bp，而由基因組DNA擴增的產物的大小大約為1kbp。如果使用引物863.3和1/15，由mRNA擴增的產物的大小大約為400bp，而由基因組DNA擴增的產物的大小大約為4kbp。因此，由mRNA擴增的產物與作為背景的由基因組DNA擴增的產物明顯不同。
可以用引物6a(SEQ ID NO27)和引物6b(SEQ ID NO28)的組合、引物6a(SEQ ID NO27)和引物8.3(SEQ ID NO29)的組合等檢測基因8。引物6a、6b和8.3分別具有外顯子3、7和8的序列。如果使用引物6a、6b，由mRNA擴增的產物的大小大約為530bp，而由基因組DNA擴增的產物的大小大約為1.3kbp，如果使用引物6a和8.3，由mRNA擴增的產物的大小大約為880bp，而由基因組DNA擴增的產物的大小大約為2.2kbp。因此，由mRNA擴增的產物與作為背景的由基因組DNA擴增的產物明顯不同。
為了排除由基因組DNA所產生的假陽性結果，需要使用這樣一種Northern雜交探針，該探針能與由感興趣的基因轉錄的mRNA的一部分雜交，並且，該探針被設計成使得該基因上的相應部分含有插入的一個或幾個內含子。
所述基因的表達可以用DNA微陣列檢測。DNA微陣列是在它上面固定了核酸的材料，其中，將多種不同的基因或DNA片段排列並固定在諸如載玻片的固相基質。通過讓DNA與由用於雜交的樣品製備的核酸樣品(優選標記過的核酸樣品)接觸，可以用該DNA微陣列檢查一種核酸樣品中具有互補於固定在微陣列上的DNA的序列的核酸的存在。使用該微陣列，可以同時監測取決於表現型性別的專一性表達的若干基因的表達。
另外，可以用由所述基因翻譯的蛋白的抗體檢測該基因的表達。對使用的抗體沒有特別限制，只要它能識別由所述基因表達的蛋白即可。用已知方法製備的多克隆抗體、或單克隆抗體等。
可以通過比較按上述方法確定的表現型性別和基因型性別評估一種樣品的性別分化阻斷活性。用該方法可以評估一種樣品的內分泌阻斷活性。儘管不是要限定本發明，性別分化的阻斷可以體現為在基因型雄性個體中表現型雌性專一性基因的表達，或在基因型雌性個體中表現型雌性專一性基因表達的喪失。
例如，可以按以下方法評估一種樣品的性別分化阻斷活性。在受精之後，馬上在試驗水樣品中培養青鱂卵。按上述方法確定每一個個體的基因型性別和表現型性別。如果一個個體的基因型性別不同於該個體的表現型性別，就認定該個體受性別分化阻斷活性的影響。通過統計所述個體的數量，可以評估該樣品的性別分化阻斷活性。如果使用基因型性別與色素表達連鎖的青鱂系Qurt的話，基因型性別與色素表達之間的關係，可能會因為染色體轉位而顛倒，發生轉位的可能性通常為百分之幾或更低。通過增加測試樣品的數量可以解決這一問題。對於基因型性別同樣與色素表達連鎖的青鱂系t-rR來說，很少出現染色體轉位。因此，如果使用該青鱂系的話，幾乎不會出現基因型性別和色素表達之間關係的顛倒。
用於評估性別分化阻斷活性的試劑盒是用本發明方法評估所述活性的試劑盒。儘管不是要限定本發明，可以用可用於檢測上述本發明基因的含有寡核苷酸的試劑盒作為例子。所述試劑盒可以含有用於擴增反應的緩衝液或酶。該試劑盒還可以包括一種由細胞核酸樣品或檢測擴增產物存在的試劑，以便用於檢測。
本發明的用於檢測內分泌阻斷劑的試劑盒是利用本發明方法檢測內分泌阻斷劑的試劑盒。儘管不是要限定本發明，可以用可用於檢測上述本發明基因的含有寡核苷酸的試劑盒作為例子。所述試劑盒可以含有用於擴增反應的緩衝液或酶。該試劑盒還可以包括一種由細胞核酸樣品或檢測擴增產物存在的試劑，以便用於檢測。
用本發明的方法可以在孵化後第5天的早期階段確定表現型性別。通常，只能在孵化後一個月或一個月以上，根據與第二性別特別相關的鰭的形狀的改變等來確定表現型性別。另外，對於本發明來說，不需要特殊技能。因此，利用本發明的方法還可以處理多個檢測樣品。該方法可有效地快速並方便地評估天然存在的或人工合成的化合物以及來自環境的樣品，如河水或土壤的內分泌阻斷活性。
例1通過扣除雜交鑑定雌性專一性基因在25℃下，在14小時的光照周期和10小時的黑暗周期的條件下，在3升綠色水(含有綠藻的小球藻的純化水)中，飼養由一個雄性和一個雌性組成的一對成熟Qurt青鱂(動物學科學，15123-126，1998)。每天用TetraMin餵食3-5次，設定TetraMin的量，使得在3-5分鐘內被吃光，然後排卵。在排卵之後第4天，在螢光顯微鏡下，通過根據自發螢光檢查黃色色素基因的表達，將胚胎從基因型上分類成雄性和雌性。用4個時期的樣品製備mRNA(37/39時期(孵化前2-3天)，或孵化後1、5或30天)，所述時期是按照Iwamatsu分類表分類的(Iwamatsu，T.動物學科學，11825-839，1994)。用寡聚(dT)引物和Copy試劑盒(Invitrogen)製備cDNA。用限制酶AluI裂解cDNA，與接頭連接(Wang，Z.和Brown，D.，美國科學院院報，8811505-11509，1991)，並通過PCR擴增。用來自每一時期的雄性和雌性的cDNA進行扣除雜交。其餘的cDNA通過PCR擴增。將所述扣除/PCR擴增過程重複3次。將相應時期的雄性和雌性的擴增的cDNA克隆到質粒中，以便獲得8個cDNA文庫。分離從相應文庫中隨機挑選的插入克隆中的片段，並進行Southern雜交，以便篩選在每一時期以性別專一性形式表達的基因。將原始cDNA和經過3輪扣除/PCR擴增之後所獲得的cDNA用作Southern雜交的探針。沒有出現雄性專一性陽性反應。因此，不能分離到以雄性專一性形式表達的基因。分別從第5天和第30天的雌性文庫中獲得了3個和47個以雌性專一性形式表現陽性反應的克隆。用插入這些克隆中的片段作探針，與來自第1天、第5天或第30天雄性或雌性的cDNA雜交(原始cDNA和在經過3輪扣除/PCR擴增之後獲得的cDNA)。根據上述雜交結果，將基因分成3類，即在第1天、第5天或第30天在雌性體內表達的基因類型。測定了屬於在第1天在雌性體內表達的類型的2個基因(基因1和2)以及屬於在第5天在雌性體內表達的類型的19個基因(基因3-21)的核苷酸序列。所測定的基因1-21的核苷酸序列如SEQID NO1-21所示。
對所測定的基因序列所作的資料庫同源性檢索發現，所述基因與已知基因具有如下同源性基因1(SEQ ID NO1)-編碼FIGα的基因，具有鹼性螺旋-環-螺旋基序的小鼠轉錄因子；基因2(SEQ ID NO2)-編碼eIF-4的基因，人的延伸起始因子的帽結合亞基；基因3(SEQ IDNO3)-編碼兔ZPA結構域的基因；基因4(SEQ ID NO4)-編碼金魚GPB結構域的基因；基因5(SEQ ID NO5)-編碼鯉魚ZPC結構域的基因；基因6(SEQ ID NO6)-編碼斑馬魚ZPC結構域的基因；基因7(SEQ ID NO7)-編碼鯉魚ZPC結構域的基因；基因8(SEQ ID NO8)-編碼斑馬魚ZPC結構域的基因；基因9(SEQ ID NO9)-編碼斑馬魚ZPC結構域的基因；基因10(SEQ ID NO10)-非洲爪蟾屬42Sp42基因，它編碼卵細胞專一性RNA儲存蛋白；基因11(SEQ ID NO11)-非洲爪蟾屬42Sp50基因；和基因12(SEQ ID NO12)-大鼠醌還原酶基因。基因13-21(SEQ ID NO13-21)與已知基因沒有同源性。據推測，這些未知基因根據其序列特徵編碼分泌蛋白。
然後，用按照已知方法由青鱂製備的染色體DNA構建基因組文庫。用基因1或8作探針進行篩選。分離相應的基因組基因，並測定其核苷酸序列。基因組基因22(相當於基因1)的核苷酸序列和基因組基因23(相當於基因8)的核苷酸序列如SEQ ID NO22和23所示。
例2檢測17β-雌二醇的性別分化阻斷活性在25℃下，在14小時的光照周期和10小時的黑暗周期的條件下，在3升綠色水(含有綠藻的小球藻的純化水)中，飼養由一個雄性和一個雌性組成的一對成熟Qurt青鱂(動物學科學，15123-126，1998)。每天用TetraMin餵食3-5次，設定TetraMin的量，使得在3-5分鐘內被吃光，然後排卵。在排卵之後，將來自5對的卵放在培養皿中，在除去了氯的自來水中用鑷子將每一個卵分離，並洗滌。用含有0.1％二甲基亞碸的1-ppb 17β-雌二醇(E2)水溶液取代上述水。將該混合物分配到用超純淨水徹底洗淨的96孔圓底微量平板(#3797，Corning)的孔中，使每一個孔含有一個卵。用蓋子覆蓋，然後將該微量平板放在培養箱中在25℃下培養。在開始培養之後的第3天，通過用螢光顯微鏡(尼康)檢查表現為自發螢光的以雄性專一性形式表達的黃色色素區分雄性和雌性。繼續進行上述培養，並在排卵之後第7天-第9天孵化魚苗。在排卵後第12天(孵化後第3-第5天)收集魚苗，然後浸泡在RNAlater(#7021，Ambion)中，並在-80℃下保存。用StrataPrep總RNA小量製備試劑盒(#400711，Stratagene)從魚苗體內提取RNA。將試驗樣品浸泡在所述試劑盒所帶的裂解溶液中，並在1.5毫升試管中用顆粒攪拌器(UrinSeisakusho)勻漿，然後，按照該試劑盒所帶的手冊的說明進行提取。所提取的RNA用TaKaRa一步RNA PCR試劑盒(AMV)(Takara Shuzo)進行處理。第1輪PCR是用引物對引物F1(SEQ ID NO30)和R1(SEQID NO31)進行的，該引物被用於擴增基因5上的一個729bp的片段(SEQID NO5)，該基因以雌性專一性形式表達。然後，用引物對F2(SEQID NO32)和R2(SEQ ID NO33)進行嵌套PCR。該引物被用於擴增所述729bp片段上的一個593bp的片段，用第1輪PCR的每一種產物的0.5微升作為模板。所得到的擴增產物在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果如表1所示。在表1中，基因型性別表示顯微鏡檢查的結果，而表現型性別表示用RT-PCR區分雌性和雄性的結果。
表1對照組(用溶劑(含有0.1％DMSO的水)處理)樣品編號 1 2 3 4 5 6 7 8基因型性別 ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀基因5的表達- - - - + + + +用1ppb17β-雌二醇處理樣品編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10基因型性別 ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀ ♀基因5的表達- - - + + - - + + +對於由對照組中用溶劑(含有0.1％DMSO的水)處理過的卵孵化的魚苗來說，僅在基因型雌性上觀察到雌性專一性基因基因5的表達，而在基因型雄性上沒有觀察到。因此，基因型性別與表現型性別一致。另一方面，對於用由1ppb17β-雌二醇處理過的卵孵化過的魚苗來說，在5個基因型雄性中的2個上觀察到了基因5的表達。另外，在5個基因型雌性中的2個上沒有觀察到基因6的表達。上述結果表明，性別分化被阻斷了。
工業應用性本發明首次提供了根據表現型性別以雌性專一性形式表達的青鱂基因。本發明提供了利用所述基因的表達作指標確定表現型性別的快速而又方便的方法。按照本發明的方法，在孵化5天之後可以確定其表現型性別。通常表現型性別只有到孵化之後一個月才能確定。另外，按照本發明的方法，可以在短時間內對多個測試樣品進行確定。
通過以下方法可以快速而又方便地確定一種樣品的性別分化阻斷活性給青鱂服用被懷疑具有性別分化阻斷活性的樣品，按照本發明的方法確定青鱂的表現型性別，並將所確定的結果與基因型性別加以比較。
序列表純文本SEQ ID NO1基因1的cDNASEQ ID NO2基因2的cDNASEQ ID NO3基因3的cDNASEQ ID NO4基因4的cDNASEQ ID NO5基因5的cDNASEQ ID NO6基因6的cDNASEQ ID NO7基因7的cDNASEQ ID NO8基因8的cDNASEQ ID NO9基因9的cDNASEQ ID NO10基因10的cDNASEQ ID NO11基因11的cDNASEQ ID NO12基因12的cDNASEQ ID NO13基因13的cDNASEQ ID NO14基因14的cDNASEQ ID NO15基因15的cDNASEQ ID NO16基因16的cDNA
SEQ ID NO17基因17的cDNASEQ ID NO18基因18的cDNASEQ ID NO19基因19的cDNASEQ ID NO20基因20的cDNASEQ ID NO21基因21的cDNASEQ ID NO22基因1的基因組DNASEQ ID NO23基因8的基因組DNASEQ ID NO24PCR引物863.3SEQ ID NO25PCR引物863.1SEQ ID NO26PCR引物1/15SEQ ID NO27PCR引物6aSEQ ID NO28PCR引物6bSEQ ID NO29PCR引物8.3SEQ ID NO30PCR引物F1SEQ ID NO31PCR引物R1SEQ ID NO32PCR引物F2SEQ ID NO33PCR引物R2
序列表110寶酒造株式會社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)120檢測性別分化阻斷劑的方法130662292150JP 11-3726021511999-12-281603321012111099212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因1 cDNA4001gtaaacggac agctagagtt cagctgaaaa gaagtgtaat tctattcgga cgtagtcttt 60aaaaaaaaaa tgaaggtgcc agaggcggaa ttaatgagcg acattctgaa gaggctgacg 120ggagagtctg ctctgccgct gtactgctgc atcgagaagt acaagcgcga gaggaacggc 180ctctactttg tcgccgagga tttcactgaa accgtcaaaa aaagagaaat ggtcaacgcc 240aaggaaagac tgagaataag gaacttgaac acaatgttct cccgactgaa gcgcatgctg 300cctctaatgc aaccagacaa aaagccgagt aaagttgata cactcaaagc agccactgaa 360tacattcgac ttcttcttgc tgttttgcgg gacactgaaa ataacaacac tgggacggat 420tttctaaaga atgcaatcac ttatggtcag caggatggct tcgccaatga cctctggaga 480atggacgatt tcttgaacct gtcagatgat cacatggagg atgggttcac catgccagca 540gaacctgcag cagaggatgg agacatgact agactggtgt tgcagcattg tgtgatgcct 600gcataccagt tcatcatcca agtagcgccc gatcaagctt cgagggatta attagccacc 660gcctcccgac tgcacatccc aaccactgac ccgatgtcct tgctatcttg gacattgatg 720acttgcactc tttttccttg acacttatta taaaatggct tgatttaaaa cctaaccctt 780aatttttttt tcattattta gttgtacata cattggaagt tgatgcatct agtaaacata 840cctaaaaaga actgctgctc taagagttct cattttgctt tcagctgtac tctatttgag 900gaaatgactt aatttatgta tttttcttgt aattgtaatc ataaagcccc aatgaaaaag 960atgcaaattt gtgacaattt gttgaggtca atgtgatcta agttgtcaat atgaattatc 1020tgtttgaaaa cttgaatcta atttaaattc agaaatgtct aaatgtgttt agttaatgat 1080caaataaaca agctttaag 10992102211938212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因2 cDNA4002gaccgccgta gtggtgtcca cttcgattcc tggaaacctc gaggaaaaaa gtgaaataag 60caacggaaag atcgggaatc ctgaggcttg catcaaacat cccttacaga acaggtggac 120tctttggttt ttcaagaatg acaaaagcaa aacctggcag gccaaccttc gtctcatctc 180tacgtttgac acagttgagg atttctgggc gttatacaat catattcaac tgtcaagtaa 240cttgatgtct ggctgtgact actctctgtt taaggatggg attgaaccca tgtgggagga 300tgaaaggaat cggcgtgggg gccgctggct catcaccctg tccaaacatc aacggaaaat 360ggatctggac cggttctggt tggagacgct tttgtgtctc gtgggcgaag cctttgatga 420tcacagcgat gatgtttgtg gagccgtcat caacatccga gccaaaggag ataaaatagc 480aatatggacc acaaactgtg aaaacaaaga ggccatcaca cagattggtc gagtttataa 540ggagaggtta ggcgttccac ccaaagtgat catcgggtac cagtcccacg cagacacggc 600tacaaagagc agctccacaa ccaagaacaa gtttgttgct taaaggtttt gggtttgtct 660tctttccttg ttttgttttt ttcaaagtaa ctgaaagttt attcaccaaa agccttttct 720aaaatggaac aagtcttgcc tttactttgt cagaacattt gtttgtggtg agaatacaat 780aaaaaaatag taggtgtaaa atcctaatga ttgacttcat catgggatag aaatgtaagc 840agtttattgg aggtgattca tttgtgttcc aacaattctc tcagttttta cctttttaag 900ttgtttatgg agaattgctt aataaaggta catgaatt 93821032112862212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因3 cDNA4003gctgcttcat cttcttggcc ttggtgtaaa agtcaaagcc aagttctggt ggttgagttc 60tttccagttc ctttttccaa tgccttcaca ctgcaacatg cggaagcctg agaaaatgtt 120tttgttattg aacctgatgg ctgcagtttc tgtcttgagt caagcatggc caaatgtgaa 180gcatggtctg cagtcaacca atggagttag atcggactgt gcaggtaatc tgatgaggct 240ttcattggat gaggctcttg cagttgggaa tcaacttcaa gtggaagcaa tcaatggcac 300acaacgtatt ttggtgacac ccagtctggc tgcccagtgt ggatacagca tggagtctga 360cccatgggga aacaccagga tctacatgtc tctgttgggt tgctttatgg ttagcaagga 420tgagtccacc ttcagcacca gcttgaaact gcacatgtac aagcacagtc cctctgatgt 480ggtcagccat gatgtgactc agacctgcag ctattctcgc tgggccttca gagatgtcct 540ctgtgacagg aactacatgg aagtgtcagc tcacatcgct cccagtcaac aaacaaaagg 600acaagttcag aacaaggaca actctcaaac aaataagctt cctggtgact ccaatgacgc 660ccctggaatc tggaagatga ccttttacac tcctgaacct gttgcgatgg tcctgaaaga 720agccgaacaa gctggttatg gtgcaacaat gagacaaact cgcctggcaa tcagaagccc 780ctatcatact tcagagactt attctgaaga tgttgctgga gtccccatgg aaatcctcaa 840agtgagcgtt taccacaaaa ctcaagaggg actgaatgtt gtcaacttgg cagctgcttg 900ccccacaggt ggcattctct tcactgacga gttcatctcc tggcacatcc ctcgccgcgt 960aactcctcta actgagggca aggtcaagat tgtagagctg tacatgggaa tcaatggaca 1020gaggctggaa aaggctcaaa tagctgcaag aggttactcc ctctcaacca cagagttcca 1080cattgttgtt gacatcccag tgggatcacc tgacggctac tacaagagcc atgctccaga 1140cttcctgtac cacatcacct acaccattga gccaatgctt gaagttctat ggaggccaga 1200gaatccccaa gaagaaacaa aatacaaaat tctgtttccc atcacaactc caccaatcct 1260tcatccaatc aacacctttg accgcacaat cccagaagag agggtgttta atgtccatgt 1320gggggctttc cttcatgatg tggtgctgaa gaacatcaca ttttctactg gagtccttac 1380tgttgaagag tgcaatgcca aagggtttgc agtccaggaa catcttctct ccaacggcac 1440aaaagtgttc tctattcaag tggcctttga caccgatccc atcctgaagc ataatcctga 1500gcccttggtt acaacctact tcctccctct gatctttggt tttgctgttc tgcctgagga 1560tctccctttt gcccacaaag tagagttgca ggcatctctg caggatgttg ttctgccaac 1620actcactgga acctgtgacc aggagcactt cttcgtttcc gtcaagtacg gcagtcaagg 1680gcatcacttc aagaccatgg tcggccatca ggacctgaca cctgaactgg gagagacact 1740agcctatcag gacaatggca cacacttcag cattgtggtg ccttatgctg cccccgtcac 1800tgcatttgag ctgatcacaa caaactcagt cagaaccagg ctgaatatgc tgctgtggga 1860ctcaatcaat caatgggttc ttggagacct ttacttgtct tgcagtttcc ctctggcaac 1920aacaaggtgc tactcaaatg gaacaatcag tgccatcgct gtcaaagtag agtctgtgcc 1980aaacctcagc ccaagctggc tgaccttgaa ggaccagtca tgcacaccag cattcattga 2040tgaccgcttt gctcactttg tcttccatgc tgactcgtgt ggaaccacta gactgttctt 2100cgacaactac atgatgtacg aaaatgaaat caggctgaac ttcaacagga aaggagttgc 2160ttacacatca ccagttgatc ctgattacaa gcaaaccatc tcctgctact atgtggtcaa 2220tgatacccag agaatctcct ttgcttctca accaagactc catgaaccca aagcagagat 2280tggattcgga cacctggtgg ttcaaatgag actagctcag gatgcttcat atcaaatctt 2340ctaccaaact gaagactatc cagttcagaa gttcctgagg gagcctctct actttgaagt 2400ggagctgatg cagtcaagag accctaaact ggaactggtg ctggaaaact gttgggcaac 2460aagcaaagaa gagaggaact ctctcccaag ctgggacatc attatcaatg gctgtgaaaa 2520cccagatgac agttatgctg cagtatttca ccctgtaatg aaggacagca gagtttcaat 2580cccatctcat gtcaagcgct tctccatcat gatgttcgcc ttcatccaga atgaccaagt 2640tctgaaggat gagattcatg tccactgcaa tgtagtgatc tgtgatgcca acacacctgc 2700agaaggcatc tgcaaaggcc aatgtggtta ctcatctggc attaaggcac accaaagcac 2760aaaaaaggga caaagaccac aaagctcaac caaccacaag cagatctcct ctgggcgtat 2820tctgttgaat aactgaatgt ccaaataaaa atttcttaaa tg 286221042111278212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因4 cDNA4004agtttgtagt cactaacacc ataatggggt ttggcaagtg gttgtttggt gttgtgattt 60tggcttgtgg tgcgtcagca caaaaccact ggacaccaca gaaacaccag cccctgtttc 120ctcatcaagc gcagccactg gtcactactt ttgataagtg caatgtggag gagggtgaca 180agattgaatg tgggacttcg gatatcactg tggagcagtg tgaaaaaatc aactgctgct 240ttgatgggtg gaagtgtcac tatggaaaag gagtgactgt gcagtgtacc agggatggtc 300agtttgtggt ggttgttgcc aaagacacca ctgtgcctcc cattgatgtg aactcgatca 360gtctgctgga gtccaatggt gacttctgtg gtccagttga cagcacctca gcctttgcca 420tttttcagtt tcctgtgact gcatgtggta ctacactcaa ggacgatgaa aactacattg 480tctatgaaaa ccacatgtct tcatcatatg aagtaggagt tggacccaga ggatcaatca 540caagagacag tcattttgag ttgttgttca tgtgcaagta ctctggctca gctgtggaag 600ctcttatctt ggaggtcaac cctgttcctg ctcctcaacc agttgcagct ctgggacccc 660tgagagtgga gctcagactg gcaaatggac aatgtctcgc aaagggttgc gtagaagaag 720aggaagcata caactcattc tacaacccag ctgaatatcc ggtaaccaaa gtgttgaggc 780aaccagttta tgttgaggtc agggtgcttg gaaggtctga cccaaacatt gtcctaaacc 840ttgatcactg ttgggccact gcaaccccaa atccccaaag tgttccccag tgggacctcc 900ttgttgatgg gtgcccttac caggatgaca gatactcaac gatattggtt ccagtggata 960gctcttctgg ccttgagtac ccaactcatt acaaacggtt catcagcaag atgtttgcat 1020ttgtggttcc agaaatatat actccccagg agacggtgta catccactgt gccacagttg 1080tgtgctaccc aagtagcaca aactcctgtg aacaacgctg tcatcgtcag cgaagagctg 1140cggtaaagat tccttcaagt cagaaggctc tggtctccag tggtaaagtg atcctgatca 1200agagtcctgc atctcacttg aaaagttaaa attgctcttg gccatctgtt ttaataaagc 1260ttgtcaaagc tcatgctc 127821052111003212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因5 cDNA4005ctgggatttg gcaatgtggt tctgtttggg ggctgttatg gcagtgaatg cagagctgag 60gacggactgc aggcctgact acatgtcact agtttggact gacagccggt tgcaggctga 120tccttccctg tttcgtcttg gtagctgctt tcctgcgact atcagccccc gggaggtggc 180ttttagcgtg acatatgatg actgtaactt caggagactt gtaactggaa atgagcttaa 240ctacaccaat gacctcatct acacatcttc tcctgactcg tatgtcaacc cttttagtct 300cccggttgtc tgctcatttg agaggcccaa ggactggtat cctatgactt atgacccaga 360gttttccaca tatggtgtag aagacttggt gtttcaagtt ggactaatga atgctgactt 420cacaggaccc tctgagtcaa atgtgtaccc cctgggctct atgatttctg tcatggctgc 480tgtggaccag caagaccatc agcctctatt gctgtttctt gaagagtgta tagcctccac 540cacacctgac cttcaccctg gagccgactt gtatccaata atcacaaata aaggatgcct 600ggtggatagt aaagtttcgc gttcaaagtt tgaaccaagg gagaaactgt ctgagattca 660cttgtctgtg caagccttta aatttgcttt gggacatgag gtgttcatcc actgcaccct 720ggttgcatgg gatccaaatg gactagatga caccaagaag gcctgccact acaacaaaga 780tcatggctgg gagttgctgg acaaccctgc atataatggc ctttgtgact gctgtgaatc 840cacctgcaag tcaagaaaaa gaaggaatct gtctgaaaag catggcttgg agaaaaaggc 900agttgttgga ccactcacaa taacggccta aagtcctgaa ccagcttgtg atttatttta 960agctgtaaat ccttgaaatg acattaaata aaatttgaaa atg 100321062111110212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因6 cDNA4006tggggacttg catttacctt ggagctgtga tccttgctgt ttttattgca gctggtgctg 60agccagatat taaagttgtc tgtgcaagag actctgtgaa agttaaatgg agggtttctt 120ctccctttgt gccgtatgct gctcgtcttt tccttggaag ttgcatgcca tccaagtggc 180aacttctacc ctctggtgat ggggaggcat tttttgatta caagttctct gaatgcaaat 240ttactaaaca gataaaagga aaaaatgtag tttataggaa tgaactcagc ttcaggccac 300aagcaaaggg aaggcccgtt gtttttaagc agccaattga atgtgtctat aagaggcctg 360agggttggat tcctccattc ttgaatcctg gatctggtgt gtctgagggt cacagtaatc 420tggtttttca catggcgctg ctcaatgaac aactaaccgg tgtggcaaag acaaatgtga 480tccccttggg ttcattcatg cctatatggg cagcagtgga gcagaagtcc catcagccac 540ttctgctgct catggatgaa tgtgttgcag ccaccacacc aaaactggat cctggcagcc 600aggttcacca aattgttgga aatcacggtt gtctccttga aagcaaacga gggagtgcag 660tgttccttcc acggtaccac tcatctgcca ttatccttta cattcaggcc ttcaactttg 720gacttggtga tgaggtctac atccactgta atctggttgt atgggatgag ggtgctcttg 780gccagagtag aaaagcttgc catgtaaaag accatggaag ttgggaactg cttgatgatc 840catcacgaag ctctgtctgt agctgctgtg actcagtctg cagttcaaag gccaaaagat 900cagtcggcga gtctggtaca tcaggctaca acacagtgtt gggaccattg gtgataaaag 960acctgtctgc tgcatctaat gctacactag ttggatctct ccctggaaga agtctgtagc 1020ggctgaacac gtgaaggaaa agtctctgtc ggagtgaaat ttcagctgta 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ttttgtcgaa 780agctgcgttg ccactctgac acctgacgca acgtctgtac ccagatacta cttcattgaa 840aaccacgggt gcttcactga ttcaaaagcg gggtcagttg cctcattcct acccagatcg 900agagccaatt tgcttcagtt ccagattgat gcctttctgt ttcgtaatga tttgagaaac 960actatctaca tcacttgtaa cctgaaggct accctccaaa tgaggaccac cttgactgac 1020aaggcctgca attatgtgca ttcaagctgg aaaagtgtgg atgagaacga tagtgtttgt 1080tggtgttgtg acagtatttg ctaccaaagt cttcccagag atgatgatct ttgtgacatt 1140gtcactcttg gtccactgag gattatctct aacaagtaaa gagcaagtga caaactgtct 1200gccagaggct cttggattaa acctgcgcaa cggtcttgta tgtccaaaaa taaagttt 125821082111509212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因8 cDNA4008gcctcgtcgc tccttccaaa ctctgaggat ggactgcaac ctgcggctgg ccgtttcttg 60ctggatcatg gtcttttctt gggtttcccc tcttacagag agtcgccaga cgaacagccg 120aggttctaca gaaaggcact tccaacctcc agtcgggacg cacggcggtc tgcagcctcg 180gctctactcg gtgaagcagc agccggcccc ggaggtaccc gaacagcacc gccccgtcac 240ggtcatatgc cacccggatt ccatggaggt tgtggtgaag gccgacatgt ttgaaacggg 300cctgaatgtg gacggtggac atctgcgact gggttccaac actctgggcg cgggcggtga 360gtgcggggcg gtccagaaag gagaggacga attcaccatc tgggccctgt tgtccgactg 420cggaaccaaa ctctcatcaa cagaagagaa gatcatttat tccaacgttc tgatctactc 480acccgaacct tctgctgatg ggttgttaag attggaagct gcaactattc cagttgaatg 540tcattatgac aggagatact ctgttgatgg catttccctt gaatcaactt gggttccctc 600tgtctccaca acttctgtga acgaccagat agatttcaat ctgaaactca tgactggtga 660ctggcagtct gagagggagt cttacacata tttcctggct gatcccatta attttgaagt 720ctctgccata gtggaaaatc acgtccctct gcgggtgtat gtggaccact gtgttgctac 780ggcaactcct gatgcagagg ctaatttaag atatgaattt attgaacata agggctgcct 840cgttgatgct taccttacaa actccggcgc acgtttccta ccaagaactg aggaacataa 900actgaggttt cagctggaag ccttcaggtt ctatcaagaa cccagcaacc agatctacat 960tacttgtgct gtgaaggctg ttcctgctgt acaggccgtc agttctcaga accgagcctg 1020ctcctttatt gagaacagat ggcaatccat agacggtggt gatcaggtgt gcagaagctg 1080tgacgtgttc aggcggggtc aggaaccgca agctgtgcca tctcctaaaa tgccagtgaa 1140cgccaaagac caaatcggtc tttcacagaa aaatatagtc cacaataaag ccgagcatca 1200accggcttct tacgtccatt tttggccggg agcttatcag agccatcact ccaaacctca 1260gcagtccaac agatttatga agagggatgc tgacaacaaa tttcatcaag ctgtccaact 1320ggggcccctc gttgtgctac cgtcaagaaa agtagtttca gtggcaacaa atttttctac 1380atggtcagaa aagaacaaca cctcctgaga cctggaacac ctgatggagg agtctgagtt 1440cgtttgagag atttggtctt gttgggctaa agaattttgc tgcaatccaa taaattaagt 1500ttctaatgt 150921092111570212DNA213青鱂(Oryzias latipes)220223基因9 cDNA4009cgcggccgct gggtcagcga ggagcacttg cagtctgatt tttgggtgct gctgcttcag 60tcattttgat ggctccctca cggttaaaga ttagctgcct ttttgggcat ttgactgcct 120tctgtcttca gttgacactt gcgtttccac cattgcttta cgtgccgcct gtttctctca 180aaagccaaag ctccttgccg agtgtggtcc agcagccaga ggagccggtg cccgttaaca 240cagttggtgt gctctgccac cctgattcca tggagctcag catcaatgct gacctgtttg 300aagtgggagc gcctgttgac gtccgtgagc tgcgtctcgg agtcgagcac agcgactact 360gcagtgcaac agcatcatca gactctgagt acagaatcct cgtgggcctg gaggactgtg 420gcaccaaaca ctggatgaca gaagactctc tggtctacac aaacctcctg atttatactc 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202102921118212DNA213人工序列220223PCR引物8.340029agactcctcc atcaggtg 182103021121212DNA213人工序列220223PCR引物F140030tccttccctg tttcgtcttg g212103121121212DNA213人工序列220223PCR引物R140031ttgcaggtgg attcacagca g212103221121212DNA213人工序列220223PCR引物F240032gctttcctgc gactatcagc c212103321121212DNA213人工序列220223PCR引物R240033atttggatcc catgcaacca g2權利要求
1.一種根據其表現型性別以雌性專一性形式表達的青鱂基因，該基因具有選自由SEQ ID NO1-21的核苷酸序列所構成的一組的核苷酸序列。
2.一種根據其表現型性別以雌性專一性形式表達的基因，該基因能在嚴格條件下與權利要求所限定的基因雜交。
3.一種根據其表現型性別以雌性專一性形式表達的基因，該基因具有選自由SEQ ID NO1-21的核苷酸序列所構成的一組的核苷酸序列，以及被插入的一個內含子或幾個內含子。
4.如權利要求3的基因，該基因具有SEQ ID NO22或23的核苷酸序列。
5.一種用於評估樣品的性別分化阻斷活性的方法，該方法包括(1)給青鱂服用要評估其性別分化阻斷活性的樣品；(2)確定青鱂的基因型性別；(3)根據雌性專一性基因的表達確定青鱂的表現型性別；和(4)根據步驟(2)和(3)的結果確定性別分化是否被阻斷。
6.如權利要求5的方法，其中，所述基因型性別是用孵化之前的青鱂卵或孵化之後5天之內的青鱂魚苗確定的。
7.如權利要求5或6的方法，其中，所述表現型性別是用孵化之後5天之內的青鱂魚苗確定的。
8.如權利要求5-7中任一項的方法，其中，將所述樣品用於孵化之前的青鱂卵或孵化之後5天之內的青鱂魚苗。
9.如權利要求5-8中任一項的方法，其中，使用其基因型性別與色素表達連鎖的青鱂系。
10.如權利要求5-9中任一項的方法，其中，通過檢查權利要求1-4中任一項所限定的基因的表達確定青鱂表現型性別。
11.如權利要求10的方法，其中，所述基因的表達是用該基因的mRNA的產生作指標檢查的。
12.一種檢測內分泌阻斷劑的方法，包括通過權利要求5-11中任一項所限定的方法評估性別分化阻斷活性。
13.一種用於檢測權利要求1-4中任一項所限定的基因的寡核苷酸。
14.一種用權利要求5-11中任一項所限定的方法評估性別分化阻斷活性的試劑盒，該試劑盒包括權利要求13所限定的寡核苷酸。
15.一種用權利要求12所限定的方法檢測內分泌阻斷劑的試劑盒，該試劑盒包括權利要求13所限定的寡核苷酸。
全文摘要
根據表現型性別由雌性專一性表達的淡水魚基因，其特徵是它具有選自序列表中SEQ ID NO1－21所示鹼基序列的鹼基序列。
文檔編號C07K14/46GK1411507SQ00817434
公開日2003年4月16日 申請日期2000年12月25日 優先權日1999年12月28日
發明者金森章, 木下政人, 高嶋良吉, 蝶野英人, 水谷滋利, 近藤昭宏, 加藤鬱之進 申請人:寶生物工程株式會社