一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒及其使用方法

2023-12-08 20:47:31

專利名稱：：一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒及其使用方法
技術領域：
：本發明屬於免疫化學分析領域，具體涉及一種分析檢測硝呋索爾代謝物的酶聯免疫試劑盒及其使用方法。
背景技術：
：硝呋索爾是一種硝基呋喃類藥物，它有非常好的抗菌作用，除了作為一種抗生素被應用於獸醫醫療中外，它還曾作為豬，禽與水產品生長促進劑被廣泛使用。但因為其可能的不安全因素，歐盟於2002年立法禁止其在動物源性食品中的使用。研究證明硝呋索爾對光敏感，代謝快速，在動物體內若干小時就能迅速代謝，代謝物為3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)，該化合物能在體內停留較長時間。所以分析硝呋索爾主要目標物為其代謝物。測定動物源性食品中的DNSH殘留量，目前國內報導的檢測方法主要有液-質聯用(LC-MS);高效液相-質譜聯用法(HPLC-MS)。儀器法是一種精確，穩定的確證方法，但具有成本高，低通量，前處理煩瑣，操作複雜等缺點，不易廣泛普及。隨著我國與歐盟農產品貿易的不斷增長，對硝呋索爾的檢測要求也不斷增加。儀器法顯然無法應對大批量樣品短時間的快速檢測。酶聯免疫方法能彌補儀器法的上述缺點，做為儀器法的補充，被廣泛運用於小分子農獸藥殘留的檢測。作為商品化的硝呋索爾酶聯免疫檢測試劑盒，因其具有較高的穩定性和靈敏度以及方便的操控性，如果能夠研究開發出來，將在硝呋索爾檢測中發揮重要作用。
發明內容本發明的一個目的是克服現有技術的不足，提供一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，可實現大批量樣品短時間的快速檢測，具有較高的穩定性和靈敏度。本發明的另一個目的是提供所述試劑盒的使用方法，使用簡單，操作方便。本發明的目的通過以下具體技術方案來予以實現提供一種適用於檢測硝呋索爾代謝物的酶聯免疫試劑盒，包括盒體、特異性抗體溶液、3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)標準溶液，酶標板、樣品稀釋液、洗滌液、二抗溶液、顯色液A液、顯色液B液和終止液，所述特異性抗體溶液為經過稀釋的兔抗3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)抗體溶液，所述酶標板為孔內包被有3,5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶連物的ELISA板條，所述二抗溶液為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體稀釋液。所述酶標板孔內包被的3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶聯物是由3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白通過活潑酯法交聯後，透析純化的產物，具有式(I)所示的結構所述特異性抗體溶液是由3,5-二硝基水楊酸肼和乙醛酸反應，所得產物偶連牛血清蛋白得到偶連物，其結構如式(II)所示，偶連物經透析純化，免疫實驗用兔，純化兔血清，調配成抗體溶液，本發明實施例中抗體溶液以lg/L濃度分裝。所述偶連物結構如式(II)所示-formulaseeoriginaldocumentpage6(II)本發明同時提供了所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)溶解有步驟(1)處理的樣品的抗體稀釋液50uL，加入50uL特異性抗體溶液，室溫反應30min，洗滌液洗滌，拍幹；(3)加入二抗稀釋液100uL，室溫反應20min，洗滌液洗滌，拍幹；(4)加入將顯色A液和顯色B液現配的顯色液100yL，室溫蔽光顯色10min;(5)加入終止液體50nL，測定OD必o值；利用標準品做出標準曲線，通過標準曲線算出樣品中硝呋索爾代謝物的含量。步驟(1)所述樣品為動物肌肉、肝臟等，樣品前處理包括鹽酸水解、乙醚脫脂、甲醇去蛋白、樣品稀釋液復溶等步驟。具體操作是在玻璃試管中加入lg樣品，0.9mL蒸餾水，0.lmL1M的鹽酸，振蕩10min，10000rpm離心2min，吸取上清液混合lmL的乙醚，振蕩60s，10000rpm離心2min。去除有機層；水層用氮氣吹乾，加入2mL甲醇，振蕩10min後10000rpm離心2min，用氮氣吹乾甲醇，加入0.5mL樣品稀釋液。該稀釋液用於酶聯免疫(ELISA)分析。步驟(4)所述顯色液中顯色A液體顯色B液的體積比為1:1。本發明的有益效果是本發明設計半抗原製備的免疫原免疫產生的抗體具有靈敏度高，特異性好等優點，採用間接競爭ELISA法，實現了動物肌肉、肝臟中硝呋索爾代謝物的快速批量檢測。本發明樣品前處理簡單，操作快速，高通量；本發明試劑盒具有較高的穩定性和靈敏度，最低檢測限為0.lng/mL，並且成本較低，完全可作為商品化的硝呋索爾酶聯免疫檢測試劑盒，將在硝呋索爾檢測中發揮重要作用。圖1DNSH的間接競爭ELISA標準曲線具體實施例方式下面結合具體實施例來進一歩詳細說明本發明。實施例1半抗原的合成將0.llg乙醛酸溶解於10mL甲醇中，加入3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)0.24g，攪拌3h，過濾並甲醇洗滌沉澱，得到半抗原DNSHAO.21g，產率72%。APCI-MSm/z:297[M-H]—.APCI-MS/MSm々281[M-OH]-;281(M-OH);226(M-NCHCOOH);210(M-H十-NHNCHCOOH):183(M-H^2CONHNCHCOOH)。^醒R(600MHz，^rDMSO，TMS):314.13(s,1H);8.78(d，J=3.0Hz，1H);8.580(d,/=3.0Hz,1H);7.95(s，1H);7.70(s，lH)。實施例2抗原的合成取半抗原DNSHA0.lmmol溶於2mLDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg，4。C下磁力攪拌反應過夜，離心後上清夜為A液；稱取BSA140mg溶於10mL濃度為0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMF1mL，攪拌溶解製備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4。C下反應12h。離心後，取上清夜，4t下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液，得到的全抗原DNSHA-BSA以lg/L濃度分裝，凍存於-20。C冰箱中，供免疫用。製備的全抗原DNSHA-BSA結構式為formulaseeoriginaldocumentpage8(II)實施例3包被原的合成取3，5-二硝基水楊酸(DNSA)0.lmmol溶於2mLDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg，4。C下磁力攪拌反應過夜，離心後上清夜為A液；稱取BSA140mg溶於10mL濃度為0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMF1mL，攪拌溶解製備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4。C下反應12h。離心後，取上清夜，4。C下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液，得到的包被原DNSA-0VA以1g/L濃度分裝，凍存於-20"C冰箱中，供包被用。製備的包被原DNSA-0VA結構式為實施例4抗體的製備多克隆抗體的製備人工免疫抗原免疫紐西蘭大白兔，採用背部多點免疫法，首次用弗氏完全佐劑乳化，間隔4周，以後免疫每隔兩周免疫，用弗氏不完全佐劑乳化，免疫三次。最後一次免疫後7天心臟採血，離心保留血清。用辛酸-硫酸銨法純化。抗體經冷凍乾燥，存放於-20"C冰箱中。間接競爭ELISA測定抗體陽性滴度以2.1倍於陰性血清的測定值為準，測得抗體的陽性滴度為1:320000。實施例5本發明方法靈敏度的測定採用方陣滴定法確定抗體及各包被原工作濃度。使用最佳濃度包被的酶標板，加入50uL0.2ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，2ng/mL，5ng/mL的代謝物，50uL最佳工作濃度的抗體。37。C水浴溫育lh。洗滌三次後拍幹，加入一定濃度羊抗兔IgG-服P，每孔100uL，37i:水浴中溫育1h。洗滌三次拍幹，加入四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液，每孔100uL，室溫避光顯色15min，向每孔中加入50yL止液，測讀各孔450nm處吸光值。DNSH的間接競爭ELISA標準曲線見附圖1，其IC5Q為5.6ng/mL，最低檢測限為0.lng/mL。實施例6方法特異性測定將呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因配成不同濃度溶液，測定其交叉反應率，結果見表l，發現與同類藥物無交叉反應。表1.交叉反應試驗結果競爭藥物交叉反應率(％)DNSH100%呋喃唑酮<0.01呋喃它酮<0-01呋喃西林<0.01呋喃妥因<0.01以上實驗結果說明由所設計半抗原製備的免疫原免疫產生的抗體具有靈敏度高，特異性好等優點。實施例7樣品前處理在玻璃試管中加入lg樣品，0.9mL蒸餾水，0.lmL1M的鹽酸。振蕩10min，10000rpm離心2min，吸取上清液混合lmL的乙醚，振蕩60s,10000rpm離心2min，去除有機層，水層用氮氣吹乾，加入2mL甲醇，振蕩10min後10000rpm離心2min，用氮氣吹乾甲醇，加入0.5mL樣品稀釋液。該稀釋液用於酶聯免疫(ELISA)分析。實施例8試劑盒精密度的檢測按照本試劑盒的使用方法測定標準溶液，做6個重複，以吸光值計算變異係數，結果見表2:表2icELISA方法的批內和批間誤差(n=6)tableseeoriginaldocumentpage11實施例9試劑盒對實際樣品的檢測結果表3icELISA方法檢測加標魚肉，蝦肉樣品的檢測結果和回收率(11=6)tableseeoriginaldocumentpage11本試劑盒選用不含DNSH的魚，蝦肉，添加DNSH標樣，評價試劑盒對實際樣品檢測能力。表3顯示其平均添加回收率為60.079.0%之間。本發明方法在對所有低藥物濃度樣品均能檢出陽性，陰性樣品無假陽性，說明本方法具有初步篩選所要求的穩定性，能夠準確篩選出陽性樣品。權利要求1、一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，包括盒體、特異性抗體溶液、3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)標準溶液，酶標板、樣品稀釋液、洗滌液、二抗溶液、顯色液A液、顯色液B液和終止液，其特徵在於所述特異性抗體溶液為經過稀釋的兔抗3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)抗體溶液，所述酶標板為孔內包被有3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶連物的ELISA板條，所述二抗溶液為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體稀釋液。2、根據權利要求1所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，其特徵在於所述酶標板孔內包被的3,5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶聯物是由3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白通過活潑酯法交聯後，透析純化的產物，具有式(I)所示的結構3、根據權利要求1所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，其特徵在於所述特異性抗體溶液是由3，5-二硝基水楊酸肼和乙醛酸反應.，所得產物偶連牛血清蛋白得到偶連物，偶連物經透析純化，免疫實驗用兔，純化兔血清，調配成抗體溶液；所述偶連物結構如式(II)所formulaseeoriginaldocumentpage3(II)4、一種權利要求1所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒的使用方法，其特徵在於包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)溶解有步驟(1)處理的樣品的抗體稀釋液50iiL，加入50uL特異性抗體溶液，室溫反應30min，洗滌液洗滌，拍幹；(3)加入二抗稀釋液100uL，室溫反應20min，洗滌液洗滌，拍幹；(4)加入將顯色A液和顯色B液現配的顯色液100uL，室溫蔽光顯色10min;(5)加入終止液體50PL，測定0D45Q值；利用標準品做出標準曲線，通過標準曲線算出樣品中硝呋索爾代謝物的含量。5、根據權利要求4所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒的使用方法，其特徵在於步驟(1)所述樣品前處理包括鹽酸水解、乙醚脫脂、甲醇去蛋白和樣品稀釋液復溶步驟。6、根據權利要求4所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒的使用方法，其特徵在於步驟(4)所述顯色液中顯色A液體顯色B液的體積比為l:1。全文摘要本發明公開了一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，包括盒體、特異性抗體溶液、3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)標準溶液，酶標板、樣品稀釋液、洗滌液、二抗溶液、顯色液A液、顯色液B液和終止液。待測樣品經過鹽酸水解，乙醚脫脂，甲醇去蛋白，樣品稀釋液復溶等樣品前處理步驟後，使用本試劑盒進行分析。本發明所述試劑盒適用於檢測硝呋索爾代謝物具有前處理簡單，快速，高通量，廉價等優點，最低檢測限為0.1ng/mL。文檔編號G01N33/543GK101419233SQ200810219300公開日2009年4月29日申請日期2008年11月21日優先權日2008年11月21日發明者孫遠明,張世偉,楊金易,沈玉棟,弘王,肖治理,雷紅濤申請人:華南農業大學