檢測呋喃它酮代謝物的試劑盒的製作方法

2023-12-08 20:51:01 1

專利名稱：檢測呋喃它酮代謝物的試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測呋喃它酮代謝物的試劑盒，特別是檢測動物組織中呋喃它酮代謝物的試劑盒。
技術背景 硝基呋喃類藥物常作為廣譜類抗生素用於預防和治療由沙門氏菌和埃希氏菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病。但在長時間的實驗研究過程中發現，硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發生癌變和基因突變，正因為如此才導致此類藥物禁止在治療和飼料中使用。由於硝基呋喃類原型藥在生物體內代謝迅速，無法檢測，但其代謝產物因和蛋白質結合而相當穩定，所以在分析此類藥物的殘留時經常要分析其代謝後的產物，管理部門就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。目前用來檢測硝基呋喃類代謝物的最常用方法是高效液相色譜法(HPLC)、液質聯用法(LC-MS/MS )等，這些方法靈敏度高、結果準確、重複性好、假陽性少，但樣品前處理過程複雜，儀器化程度高價格昂貴，與之相比，免疫方法具有靈敏度高、樣品預處理簡單、短暫的檢測時間、較大的檢測樣本量等特點，適合現場監控和大量樣品的篩查。

實用新型內容本實用新型的目的是提供一種靈敏度高、成本低、操作簡單、檢測時間短的檢測呋喃它酮代謝物的試劑盒。本實用新型的試劑盒，其包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，微孔試劑條有8個反應孔，反應孔上具有微孔塞，其中凍幹有呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物。試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成，所述反應膜上具有包被有呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物構成的檢測線印跡「 I 」和包被羊抗鼠抗抗體構成的質控線印跡「 I 」。樣品吸收墊位於底板始端，吸水墊位於底板末端，檢測線和質控線平行，均呈與試紙條的長相垂直的條帶狀，質控線位於距離吸水墊始端與反應膜相連處5-8mm，檢測線位於距離質控線5_6mm。試紙條樣品吸收墊上檢測端粘貼有保護膜，保護膜上有MAX標記線。本實用新型試劑盒中試紙條底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；保護膜為PE材質保護膜；試劑盒盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質支撐材料。本實用新型試劑盒具有如下有益效果I.靈敏度高。呋喃它酮代謝物檢測試劑盒以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎製備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的範德華力相結合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。其中的呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物凍幹在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，增加整個體系的反應靈敏度。因此，本實用新型試劑盒具有較高的特異性和靈敏度。本試劑盒對呋喃它酮代謝物的檢測靈敏度為I U g/L。2.顯示檢測結果形象、直觀準確。檢測時試紙條以顯示紅色線「 I 」及「 Il 」印跡作為陽性和陰性標記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線「 I 」印跡表示在被檢測樣本液中呋喃它酮代謝物含量高於等於試劑盒對呋喃它酮代謝物的最低檢測限，兩條紅線「 Il 」印跡表示在被檢測樣本中呋喃它酮代謝物含量低於試劑盒對呋喃它酮代謝物的最低檢測限，結果判定形象、直觀、準確、簡單明了，不容易出現結果誤判。3.成本低，投資少。使用本實用新型試劑盒，不需另配儀器設備及其他試劑，使現場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。4.易於大範圍推廣應用。試劑盒操作簡單，能較好滿足動物組織檢測的需求，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。

圖I為本實用新型試紙條結構示意圖；圖2為本實用新型試紙條俯視圖；圖3為本實用新型微孔試劑圖；圖4為本實用新型試紙條檢測結果判定圖；圖5為本實用新型試劑桶結構示意圖；圖6為本實用新型固定用具俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定用具側視圖。
具體實施方式
一、呋喃它酮代謝物檢測試劑盒的組裝製備I)試紙條樣品吸收墊I、反應膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊位於底板始端，吸水墊位於底板末端，樣品吸收墊的末端與反應膜始端相連，反應膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙樣品吸收墊上檢測端粘貼有保護膜，保護膜上印有MAX標記線，檢測線4包被有呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物，質控線5包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護膜為PE材質保護膜。2)微孔試劑條微孔試劑條8具有微孔塞9，孔中凍幹有呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物。3)將I)試紙條和2)微孔試劑條裝入具有密封蓋的塑料試劑桶10，將塑料試劑桶放置於試劑盒盒體12內的固定用具11中。[0026]二、試劑盒的使用I、樣品前處理稱取5. 0g±0. 05g均質的樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml 10%三氯乙酸，再加入IOOiU衍生化試劑(向裝有151mg 2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加入IOml甲醇溶解混勻)，充分振蕩3min ;在60°C溫箱中孵育I. 5h ;取出依次加入Iml 0. 5mol/L磷酸氫二鉀溶液、I. 5ml 2mol/L氫氧化鈉溶液和IOml乙酸乙酯，振蕩10s，脂肪含量高的樣本輕微振蕩8-10下，以防樣本乳化；3000g以上，室溫(20-25°C)離心5min ;取8ml乙酸乙酯相至IOml乾燥的玻璃試管中，於5(T60°C水浴氮氣流下吹乾；加入Iml正己烷，渦動30s，再加0. 8ml樣品復溶液(0. 2mol/L磷酸鹽緩衝液)，渦動IOs充分混勻；3000g以上，室溫(20-25°C)離心5min ;除去上層有機相，取下層IOOiU用於分析。2、用試劑盒檢測用微量移液器吸取IOOiU復溶的樣本液，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，將標記好的試紙條插入微孔中——印有「MAX」線端朝下，使之充分浸入溶液中；室溫(200C -25°C)孵育5min後，取出試紙條，判定結果。三、檢測結果分析呋喃它酮代謝物在樣品中的含量高於等於試劑盒對其的最低檢測限時，呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物與藥物結合，金標抗體上的抗原結合位點被封閉，從而在檢測區內因為競爭反應，不會與呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物結合而不出現紅色條帶。陰性樣本在檢測過程中由於缺少抗原抗體競爭反應，將會在檢測線和質控線上出現紅色條帶。如圖4所示。陽性當質控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)不顯色，試紙條以顯示紅色線「 I 」，判為陽性，如圖4. a圖所示。陰性當質控線(C)顯示一條紅色條帶，檢測線(T)同時也顯示出一條紅色條帶，試紙條以顯示紅色線為「 Il 」，判為陰性，如圖4.b所示。無效當質控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙條判為無效，如圖4. c、4. d所示。四、檢測試劑盒中用到的材料製備方法I、呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的合成與鑑定( I)呋喃它酮代謝物半抗原的製備a.取l.Og對羥基苯甲醛溶於乙腈中，加入0.32g碳酸鉀，0. Ig碘化鈉，攪拌。加入溴乙酸乙酯0. 44g，裝上回流冷凝管，80°C攪拌過夜。反應停止後，蒸乾乙腈，加水溶解，乙酸乙酯萃取，蒸乾上矽膠柱，石油醚乙酸乙酯=5:1過柱純化得產物I. OSg ；b.取步驟a得到的I. 08g產物溶於乙醇中，加氫氧化鉀0. 5g，70°C攪拌4h。反應停止後，蒸乾乙醇，加水溶解，調節PH值到6，加60ml X3乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，蒸乾，上矽膠柱，石油醚乙酸乙酯=3:1洗脫得產物0.738; c.取步驟b得到的0. Ig產物加N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)溶解，在攪拌下加0. 41g呋喃它酮代謝物的甲醇溶液5ml，60°C攪拌4h。反應停止後，蒸乾溶劑，加乙醇重結晶得半抗原產物0. 53g。(2)免疫原的製備[0043]取12mg呋喃它酮代謝物半抗原，溶解於Iml DMF中，得到溶液I ;取15mg 二環己基碳二亞胺(DCC)和IOmg N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)用0. 2ml DMF充分溶解後加入溶液I中，室溫下攪拌24 h，即可得到溶液II ;稱取牛血清白蛋白(BSA)30mg，使之充分溶解在3ml水中，將溶液II逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，並於室溫下攪拌24 h，用O.Olmol/L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，於_20°C保存備用。(3)包被原的製備取12mg呋喃它酮代謝物半抗原用I. 5ml DMF溶解，冷卻至10°C，得到溶液I ;取氯甲酸異丁酯10 Ul加入溶液I中，10°C攪拌反應30min得到溶液II ;取30mg卵清白蛋白(OVA)用 2. 2ml 50mmol/L Na2C03 溶解與溶液II 10°C反應 4h，然後 4°C過夜；用 0. Olmol/ L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，於-20°C保存備用。(4)呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的鑑定將載體蛋白、呋喃它酮代謝物半抗原、呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物用pH7. 4的PBS配成0. 5mg/mL的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4 PBS調零，用紫外分光光度計在波長200-800 nm範圍內掃描，得到載體蛋白、呋喃它酮代謝物半抗原、呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物的吸收曲線。三者出現不同的吸收曲線，表明呋喃它酮代謝物半抗原與載體蛋白偶聯成功。2、呋喃它酮代謝物單克隆抗體的製備a.動物免疫將步驟I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為1501^/只，使其產生
抗血清。b.細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞,按8:1 (數量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合,篩選得到穩定分泌呋喃它酮代謝物單克隆抗體的雜交瘤細胞株。c.細胞凍存和復甦將雜交瘤細胞用凍存液製成5X IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。d.單克隆抗體的製備與純化增量培養法將雜交瘤細胞置於細胞培養基中，在37°C條件下進行培養，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。所述細胞培養基為向RPMI1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養基中的終濃度為20% (質量百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞培養基中的終濃度為0. 2% (質量百分含量)；所述細胞培養基的pH為7. 4。3、羊抗鼠抗抗體的製備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物的製備(I)膠體金的製備用雙蒸去離子水將1%氯金酸(購於sigma公司)稀釋成0. 01% (質量百分含量)，取IOOml置於錐形瓶中，用恆溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續高溫、持續攪拌下加入2. 5ml1%檸檬酸三鈉(購於廣州化學試劑廠)，繼續勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫後用去離子水恢復到原體積，4°C保存。製備好的膠體金外觀純淨、透亮、無沉澱和漂浮物。(2)呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物的製備在磁力攪拌下，用0. 2mol/L碳酸鉀調膠體金的pH值至7. 2，按每毫升膠體金溶液中加入5(Tl00i! g抗體的標準向膠體金溶液中加入上述呋喃它酮代謝物單克隆抗體，繼續攪拌混勻IOminJpA 10%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000rpm，4°C離心40min，棄上清液，沉澱用復溶緩衝液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復溶緩衝液將沉澱重懸，置4°C備用。復溶緩衝液含牛血清白蛋白(BSA) 0. 19T0. 3% (體積百分含量)、吐溫_800. 059T0. 2% (質量百分含量)、pH7. 2的0. 02mol/L磷酸鹽緩衝液。5、將呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物凍幹到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 U I呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍乾燥機中，在冷阱溫度為-50°C條件下，預凍3h後，再真空乾燥15h，即可取出，得到凍幹有呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞，密封保存。6、樣品吸收墊的準備將樣品吸收墊置於含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩衝液中的終濃度為0. 5%(體積百分含量))、pH為7. 2,0. lmol/L磷酸鹽緩衝液浸泡2h，37°C烘2h備用。7、反應膜的製備包被過程用磷酸緩衝液將呋喃它酮代謝物半抗原-卵清白蛋白偶聯物稀釋到10mg/mL,用Isoflow點膜儀將其包被於硝酸纖維素膜上的檢測線(T)，包被量為I. 0 y g/cm2 ;用0. 01mol/L、pH 7. 4 PBS緩衝液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200ii g/mL，用Isoflow點膜儀將其包被於硝酸纖維素膜上的質控線(C)，包被量為I. Oy g/cm2。將包被好的反應膜置於37°C條件下乾燥2h，備用。
權利要求1.一種檢測呋喃它酮代謝物的試劑盒，其特徵在於試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述反應膜上具有包被有呋喃它酮代謝物半抗原-載體蛋白偶聯物構成的檢測線印跡「 1 」和包被羊抗鼠抗抗體構成的質控線印跡「 1 」。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述檢測線和質控線平行，均呈與試紙條的長相垂直的條帶狀。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述樣品吸收墊位於底板始端，所述吸水墊位於底板末端，所述質控線位於距離吸水墊始端與反應膜相連處5-8mm，所述檢測線位於距離質控線5_6mm。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述試紙條樣品吸收墊上的檢測端粘貼有保護膜，保護膜上有MAX標記線。
6.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料，樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙，吸水墊為吸水紙，反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，保護膜為PE材質保護膜。
7.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述微孔試劑條有8個反應孔，反應孔上具有微孔塞。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於所述微孔試劑中凍幹有呋喃它酮代謝物單克隆抗體-膠體金標記物。
9.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒盒體為硬紙盒，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具是硬質支撐材料。
專利摘要一種檢測呋喃它酮代謝物的試劑盒，其特徵在於試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜組成。本實用新型靈敏度高，顯示檢測結果形象、直觀準確，成本低，投資少。
文檔編號G01N33/577GK202649213SQ20122014394
公開日2013年1月2日 申請日期2012年4月7日 優先權日2012年4月7日
發明者何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 趙正苗, 馮靜, 陳煒玲, 劉琳, 楊秀賢, 崔海峰 申請人:北京勤邦生物技術有限公司