一種通過體胚發生大量繁殖忽地笑的方法與流程
2023-12-08 19:47:58
本發明涉及一種體胚發生大量繁殖忽地笑方法，屬於植物的人工繁殖和栽培方法技術領域。
背景技術：
忽地笑(Lycoris aurea Herb.)又稱黃花石蒜，主產我國，分布於我國西南、華東、華南、西北地區的16個省區，日本和緬甸也有少量分布。忽地笑的花葉均具有頗高的觀賞價值，其花為金黃色，華亭挺拔，花型奇特；花後冬春季又可觀葉，其葉形似蘭草，姿態優雅。在日本、荷蘭等一些國家，其道路、庭院都廣泛栽培忽地笑，是一種頗受人們喜愛的庭院觀賞植物。
另外，忽地笑亦具有很高的藥用價值，其鱗莖是提取加蘭他敏的良好原料，加蘭他敏在忽地笑中的含量很高，野生資源中發現的最高含量為0.2％。目前加蘭他敏的市場價格為40萬元每公斤，因此忽地笑的人工繁育栽培蘊藏著巨大的市場前景和社會效益。
雖然我國的忽地笑資源豐富，但由於目前忽地笑種球市場需求日益增大。而其栽培技術落後，種球繁殖率低，導致其野生資源遭到亂採濫挖。近幾年來，由於製藥工業的大量提取，原分布最廣、蘊藏量最多的紅花石蒜(L.radiata)和忽地笑(L.aurea)的野生資源也急劇減少。要解決這一問題，組織培養是一條有效途徑，但長期以來忽地笑的組織培養受其種球繁殖率低、褐化等問題較為嚴重的影響，效率一直較低。之前報導的忽地笑組織培養大多以誘導不定芽為主，少數誘導愈傷的報導主要以小鱗莖和種子為於是材料，而且誘導率和再分化率較低，繁殖係數不高。本發明通過先誘導出忽地笑的不定芽，在對其無菌苗進行誘導，從體細胞胚的發生途徑進行忽地笑愈傷組織誘導，首次將除草劑毒莠定用於忽地笑的組織培養，獲得了穩定的可繼代增殖的愈傷組織，誘導率可達到95％以上，經過合理的激素調配，誘導出的愈傷組織可再分化出大量的不定芽。此方法對比傳統的植物生長激素調節，將忽地笑的繁殖係數至少提高了8倍以上，大大提高了忽地笑組培的繁殖效率。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種體胚發生的忽地笑的繁殖方法，進行規模化生產以及以忽地笑組培為基礎的其他學科的研究工作的需要。
本發明的技術方案是這樣實現的，該種忽地笑繁殖方法的主要特點是：
A外殖體消毒：選取在-4℃，保存30天以上的忽地笑小鱗莖，剝去外層鱗片，切除根部，用0.1％的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15～20min，流水衝洗30～60min後，再在超淨工作檯上用75％的酒精漂洗30s，無菌水清洗4遍後，用含2～5％次氯酸鈉滅菌20～30min，無菌水衝洗4-5遍，最後用無菌濾紙吸乾表面水分；
B叢生芽誘導：將消毒好的忽地笑切去上部1/2，將帶有鱗莖盤的鱗莖均勻分為4-8塊，接種到以下培養基中：MS基本培養基，適當濃度的植物生長激素，蔗糖(食用糖)20～40g/L，適當pH值；培養溫度28±1℃，光照強度1000～3000lx，光照時間10～16h，進行光照培養；
C愈傷組織誘導：將不定芽萌發後培養20天左右的小鱗莖切開，去除原有鱗片和褐化部分，接種到以下培養基中：MS基本培養基，蔗糖(食用糖)20～40g/L，適當濃度植物生長激素，適當pH值；培養溫度28±1℃；
D愈傷組織增殖：將誘導出20天左右的愈傷組織切下，接種到以下培養基上：MS基本培養基，適當植物生長激素，培養溫度28±1℃，光照時間10～16h，進行光照培養30～40天；
E愈傷組織的分化：將進行增殖培養後的愈傷組織切成2cm左右的小塊，接種到以下培養基上：MS基本培養基，適當植物生長激素，培養溫度25±1℃，光照時間10～16h，進行光照培養30～40天；
F生根培養：選取生長健壯的試管苗，連同小鱗莖接種到如下培養基中：1/2MS或MS基本培養基，蔗糖60～90g/L，適當濃度的植物生長激素，適當PH值，進行光照培養50～60天。
H煉苗移栽：將組培瓶蓋打開，並添加少量的蒸餾水，進行有菌條件馴化；用鑷子將組培苗從瓶中取出，移栽到已經滅菌的栽培基質中，進行遮陰馴化3周，期間不定期的噴施1/2MS營養液。
所述的忽地笑速繁殖方法的延伸技術方案包括：步驟A中的消毒試劑和時間、步驟B中的pH值範圍以及步驟B、C、D、E、F中忽地笑繁殖所述的培養基中涉及的植物生長激素，包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、毒秀定(Picolarm)、萘乙酸(NAA)其中一種或幾種。
所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術方案包括：步驟A中的種子消毒用試劑0.1％的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15～20min和含2％次氯酸鈉滅菌20～30min。
所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術方案包括：步驟B中pH值範圍為5.8～7.0，植物生長激素包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)4.0～6.0mg/L，吲哚乙酸(IBA)0.1～0.5mg/L。
所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術方案包括：其特徵在於步驟C所涉及裡面到的植物生長激素包括毒莠定(Picolarm)1.0～3.0mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)0.1～0.5mg/L。
所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術方案包括：步驟D中所涉及到的植物生長激素包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)4.0～6.0mg/L，萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg/L。
所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術方案包括：步驟E中所涉及到的植物生長激素萘乙酸(NAA)400～500mg/L，浸泡時間為10-15min。
所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術方案包括：步驟H中添加蒸餾水5～10ml，進行有菌馴化2-3天。
採用體胚發生培養的方法繁殖忽地笑，不僅可以擺脫外界條件的影響，四季都能進行生產，而且可以節約育苗佔地，降低生產成本。本技術是利用細胞的全能性，採取植物體上的細胞團夥一塊組織，通過人為條件的控制，使這些組織形成千百萬植株，並且保存了母體的全部優良性狀，且遺傳性狀穩定。組織培養快速繁殖是目前儘快滿足市場需求的有效途徑，同時也是種質保存(超低溫保存)、誘變育種及遺傳轉化的基礎。這種方法保留了忽地笑的植株活性，可在短期內形成大量優良試管苗，進行規模化、工廠化生產。
附圖說明
圖1是開始萌發不定芽的忽地笑鱗莖圖，圖2是體細胞胚誘導出的愈傷組織，圖3是愈傷組織再分化，圖4是煉苗移栽前的忽地笑小鱗莖和植株。
具體實施方式
下面結合忽地笑體外繁殖的實例說明本發明的具體實施方式。
實例1愈傷組織的誘導和培養
1.取忽地笑的地下鱗莖，剝去外層鱗片，切除根部，切去鱗莖上半部分約1/2～2/3。將留有鱗莖盤的鱗莖均分為4～8塊，用0.1％的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15～20min，流水衝洗60min後，再在超淨工作檯上用75％的酒精漂洗30s，無菌水清洗4遍後，用含1％次氯酸鈉溶液消毒20～30min(在次氯酸鈉溶液中加入幾滴吐溫80)，無菌水衝洗4-5次，最後用無菌濾紙吸乾小鱗莖表面水分。
2.將消毒好的忽地笑鱗莖小塊直接接種到不定芽誘導培養基中：MS基本培養基中添加，6-卞基腺嘌呤(6-BA)3.0mg/L，吲哚乙酸(IBA)0.2mg/L，蔗糖30g/L，適當pH值；培養溫度28±1℃，光照強度1000～3000lx，光照時間10～16h，進行光照培養。
3.培養30天後，待叢生芽生長至2-3cm，將叢生芽切開接種到本發明的愈傷組織誘導培養基中，進行誘導培養。愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基本培養基，並添加植物生長激素毒莠定(Picolarm)3.0mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L，培養30天以上，誘導率達到90％。
4.待忽地笑愈傷組織誘導培養30天以上，將愈傷組織轉接到本發明的愈傷組織增殖培養基上，進行增殖培養。愈傷組織增殖培養基是以MS培養基為基本培養基，並添加植物生長激素毒莠定(Picolarm)1.5mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)1.5mg/L，培養30天以上，愈傷組織可增殖2～3倍。
實例2愈傷組織的分化和試管苗的生根、移栽
1.培養30-60天後，待愈傷組織生長至2-3cm，將其切開重新接種到本發明的愈傷組織分化培養基中，進行分化培養。愈傷組織分化培養基是以MS培養基為基本培養基，並添加植物生長激素6-卞基腺嘌呤(6-BA)6.0mg/L，萘乙酸(NAA)0.2mg/L，蔗糖30g/L，進行增殖培養。培養30天以上，誘導率達到98％，大部分愈傷可誘導出叢生芽數達到5-6個
2.選取生長健壯的試管苗，然後接種到1/2MS基本培養基上，吲哚丁酸(IBA)1.0mg/L，蔗糖60g/L，進行生根誘導。培養40天後，生根率達86％，平均根數目達8.5根。
3.將忽地笑組培苗生根培養1.5-2個月後開始進行煉苗移栽，首先將組培瓶移入光照培養箱，進行變溫變光馴化5-7天，再將組培瓶蓋打開，並添加10ml蒸餾水，進行有菌條件馴化2-3天。然後將組培苗移栽到已經滅菌的栽培基質(泥潭∶珍珠巖∶園土＝1∶1∶5)中，放置無加溫加光的溫室中，進行遮陰馴化3周，期間不定期的噴施1/2MS營養液，移栽後成活率達78％。以上實例的忽地笑組織培養狀況見附圖。