一種黃芩提取物質量標準及其含量測定方法
2023-12-09 02:16:06 1
專利名稱：一種黃芩提取物質量標準及其含量測定方法
技術領域：
本發明涉及中藥技術領域。具體涉及黃芩提取物質量標準及其含量測定方法。
背景技術：
黃芩為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的根。味苦，性寒。入心、肺、膽、大腸經。功能清熱燥溼、瀉火解毒、止血、安胎。主治壯熱煩渴、肺熱咳嗽、溼熱瀉痢、黃疸、熱淋、吐衄、崩漏、目赤腫痛、胎動不安、癰腫疔瘡。現代藥理學研究證明，黃芩具有抗病原微生物作用，解熱作用，抗變態反應和抗炎作用，保肝、利膽、解痙作用以及降壓、利尿、鎮靜等作用。
黃芩主要成分為黃酮類、揮髮油和胺基酸等。黃酮類以黃芩素(Baicalein)、黃芩苷(Baicalin)為主要成分，並含少量漢黃芩素(Wogonin)、漢黃芩苷(Wogonoside)、和黃芩新素(Neobaicalein)等黃酮類化合物。揮髮油中含有多種萜類、酸、酮、酚、內酯、醛、醚等，其中以苯乙酮(Aceto-phenone)、1-苯基-1，3-丁二酮(1-Phenyl-1，3-butanedion)、棕櫚酸(Palmitic acid)、油酸(Oleicacid)等含量較高。尚含14種胺基酸，其中脯氨酸(Proline)含量最高，約佔80％。其它還含有苯甲酸、黃芩酶、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、葡萄糖(Glucose)、蔗糖(Sucrose)、澱粉等。
本發明人曾成功地向國家藥典委員會申報了黃芩提取物質量標準，該標準現已收載於2005年版中國藥典一部中新增的植物油脂和提取物目錄項下。現收載於2005版藥典的黃芩提取物的關鍵指標是黃芩苷含量不得低於85％，熾灼殘渣低於0.8％，重金屬低於20ppm。提取所用的藥材為正品黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的乾燥根，藥材中黃芩甙含量(HPLC法)要求不得少於9.0％。理化特徵與正品較相近的非正品黃芩主要有同屬的粘毛黃芩與甘肅黃芩，但無品種混淆現象，作為標準提取物原料，就必須用正品黃芩。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是在上述國家標準基礎上，對黃芩提取物中黃芩苷以外的成分進行含量限定，要求黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷三者含量之和達到要求。本發明提供了黃芩提取物的具體標準為黃芩苷含量85～92％，黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷三者含量之和為6～10％。重金屬低於20ppm外，鉛、汞、砷、鎘四個主要重金屬元素的含量分別低於或等於5、0.2、2和0.3ppm。農藥殘留物六六六(BHC)、DDT、五氯硝基苯(PCNB)和艾氏劑(Aldrin)分別小於或等於0.1、0.1、0.1和0.02ppm。
本發明提供了黃芩提取含量的檢測方法。
本發明人對黃芩提取物的含量測定進行了下列方法學研究(1)方法重現性試驗按樣品測定方法對同一樣品一式5份，在給定的色譜條件下進行測定。4種所測成分的RSD均小於2％。
(2)穩定性試驗對樣品溶液在0、4、8、24小時各分析一次，測得黃芩苷對照品保留時間以及峰面積的RSD均小於2％，試驗結果表明樣品在24小時內穩定。
(3)色譜分析時間的確定在確定色譜條件延長分析時間至120min，根據樣品圖譜可知90min以後沒有成分被洗脫出來，故設定梯度洗脫的時間為90min。
方法重現性試驗(4)按樣品測定方法對同一樣品一式5份，在給定的色譜條件下進行測定。所測黃芩苷含量的RSD均小於1.7％。
(5)重金屬與農藥殘留測定重金屬按《中國藥典》2000年版一部(附錄VD)測定；農藥殘留按《中國藥典》2000年版一部(附錄IXQ)進行測定。發明的方法所需的黃芩提取物和漢黃芩苷對照品是通過一列方法製備的(1)製備黃芩提取物取黃芩，加8～15倍水煎煮或用水加熱回流提取二次，合併煎液或提取液，部分濃縮至生藥量的5～12倍，用鹽酸調節pH值至1.0～2.0，80℃保溫30～90分鐘，靜置，濾過，沉澱物加4～8倍水攪勻，用40％氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，加等量乙醇，攪拌使溶解，濾過，濾液用鹽酸調節pH值至1.0～2.0，60℃保溫20～60分鐘，靜置，濾過，沉澱依次用適量水及不同濃度的乙醇洗至pH值7.0，揮盡乙醇，真空乾燥，即得黃芩提取物；(2)製備黃芩苷對照品在黃芩提取物質量標準研究中，需要用到的對照品主要為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素，其中漢黃芩苷對照品在國內外試劑市場無貨供應，對此需要自行研究製備。
I儀器與試劑微量熔點儀Yanaco MP-(溫度計未校正)；紫外分光光度儀Shimaza UV2100；質譜儀Einnigan LCQ-Deca；核磁共振儀BrukerDPX-300，Varian Inova 600；高效液相色譜儀HP-1100 AgilentTechnologies，柱Discovery SH5μ2.1*50mm；HPD-100大孔樹脂河北滄洲寶恩化工有限公司；凝膠Sephadex LH-20 Pharmacia；反相預製層析柱LiChroprep RP-18Merck；矽膠板煙臺市芝罘黃務矽膠開發試驗廠；甲醇、乙醇、乙腈等系光譜純或分析純；紫外分析儀北京市新技術應用研究所。
II提取分離取黃芩藥材，切成片段，用50％乙醇回流提取，真空濃縮，上大孔樹脂柱層析，先用水、20％乙醇洗滌，然後用乙醇梯度(30％～80％)洗脫，以TLC為檢出手段，收集富含苷類的流份，終點控制仍以TLC為手段。流份經濃縮、乾燥，得到粉末浸膏，備用；取上述浸膏粉末，用75％乙醇溶解，反覆上上凝膠柱層析數次，收集富含漢黃芩苷的流份，濃縮後再行反相製備層析柱，以甲醇-水系統梯度(30∶70～50∶50)洗脫，以TLC為檢出手段，收集富含漢黃芩苷的流份，濃縮至幹，以甲醇重結晶，得到漢黃芩苷純品。
III鑑定漢黃芩苷為已知化合物，其化學結構可通過綜合光譜測定並與文獻中關鍵的光譜數據對比而加以確認。
a.純度測定取少量漢黃芩苷純品，用甲醇溶解，製成樣品溶液，照高效液相色譜歸一法測定樣品純度，結果顯示，自製的對照品純度為96.42％，尚能滿足黃芩提取物質量標準中有關指紋圖譜探索研究的基本要求。
b.分子量測定在傳統的電子流轟擊(EI)質譜中，黃酮苷類化合物質譜特徵往往是以苷元信號最強，苷元裂分碎片次之，而分子離子峰信號往往最弱，因此通過EI獲取樣品的分子量信息不太可靠。電噴霧(ESI)質譜能克服EI局限性，經ESI測定，受試樣品的一價負電離分子離子峰為459.1，正電離分子離子峰為461.1，以二者離子峰為基準，本樣品的分子量均為460.1，而漢黃芩苷分子量理論值為460.4，二者數據比較接近。
c.氫核磁共振測定1H-NMR(CD3OD)δ(ppm)3.4-3.7(mH，brm，糖質子)、3.98(3H，s，C8-OCH3)、5.18(1H，d，C1」-H)、6.68(1H，s，C6-H)、6.84(1H，s，C3-H)、7.60(3H，d，C』3、4、5-H)、8.06(2H，dd，C』2、6-H)。鑑於樣品化合物A、B、C環上質子歸屬非常清晰，並且其數據與漢黃芩苷文獻值[1]對應一致，可以基本確認被測樣品為漢黃芩苷。漢黃芩苷的化學結構如下
經1H-NMR的質子歸屬分析，結合MS的分子量測定旁證，可以確認所分析的樣品是漢黃芩苷。
IV討論在黃芩藥材中黃芩苷含量在8～20％，而漢黃芩苷含量一般在1～3％；常規黃芩提取物中，漢黃芩苷所佔的比例一般不超過6％。黃芩苷與漢黃芩苷為同系物，後者比前者在8位上多了一個甲氧基，在正相的TLC檢測中發現，二者的Rf值比較接近，同時二者均為極性化合物，用正相柱層分離比較困難，同時每次上柱後樣品成分存在著無法抗拒的損耗，不利於漢黃芩苷對照品的製備。
根據漢黃芩苷上述特點，本次分離使用了成分損耗比較小的大孔樹脂和凝膠柱層析，其中凝膠對漢黃芩苷富集有較大作用，最後純品的獲取需要使用反相柱層析。
本發明提供的黃芩提取物測定方法為(1)儀器Agilent G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD G1315A檢測器，G1313A自動進樣器，色譜工作站Agilent 1100 series。
(2)色譜條件色譜柱Inertsil ODS-3(4.6×250mm 5μm)保護柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID檢測波長280nm柱溫40℃流動相A乙腈∶水∶甲酸＝17∶83∶1，B乙腈∶水∶甲酸＝80∶20∶1流速1.0ml*min-1洗脫時間90min進樣量10μl梯度條件0-30 min A(100-70％)，B(0-30％)
30-70minA(70-0％)，B(30-100％)70-90minA(0-0％)， B(100-100％)(3)對照品溶液的配製用甲醇配置單標溶液，混合製得混標溶液，其中含黃芩苷(0.16mg/ml)、漢黃芩苷(0.04mg/ml)、黃芩素(0.08mg/ml)、漢黃芩素(0.01mg/ml)。
樣品溶液的製備方法取黃芩提取物粉末0.04g，加70％乙醇90mL，超聲30min，放冷，定容至100mL。
(4)測定取各樣品在確定條件下進樣10μL進行梯度洗脫，測得樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量，結果見下表。
具體實施例方式實例1.黃芩提取物製備取黃芩5kg，加10倍水，加熱回流提取二次，合併提取液，部分濃縮至生藥量的8倍，用鹽酸調節pH值至1.0～2.0，80℃保溫60分鐘，靜置，濾過，沉澱物加6倍水攪勻，用40％氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，加等量乙醇，攪拌使溶解，濾過，濾液用鹽酸調節pH值至1.0～2.0，60℃保溫30分鐘，靜置，濾過，沉澱依次用適量水及不同濃度的乙醇洗至pH值7.0，揮盡乙醇，真空乾燥，即得黃芩提取物2kg。
實例2.製備黃芩苷對照品取黃芩藥材500g，切成片段，用50％乙醇回流提取，真空濃縮，上大孔樹脂柱層析，先用水、20％乙醇洗滌，然後用乙醇梯度(30％～80％)洗脫，以TLC為檢出手段，收集富含苷類的流份，終點控制仍以TLC為手段。流份經濃縮、乾燥，得到粉末浸膏，備用。取上述浸膏粉末5g，用75％乙醇溶解，反覆上凝膠柱層析數次，收集富含漢黃芩苷的流份，濃縮後再行反相製備層析柱，以甲醇-水系統梯度(30∶70～50∶50)洗脫，以TLC為檢出手段，收集富含漢黃芩苷的流份，濃縮至幹，以甲醇重結晶，得到漢黃芩苷純品。
實例3.黃芩提取物測定方法(1)儀器Agilent G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD G1315A檢測器，G1313A自動進樣器，色譜工作站Agilent 1100 series。
(2)色譜條件色譜柱Inertsil ODS-3(4.6×250mm 5μm)保護柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID檢測波長280nm柱溫40℃流動相A乙腈∶水∶甲酸＝17∶83∶1，B乙腈∶水∶甲酸＝80∶20∶1流速1.0ml*min-1洗脫時間90min進樣量10μl梯度條件0-30min A(100-70％)，B(0-30％)30-70min A(70-0％)，B(30-100％)70-90min A(0-0％)，B(100-100％)(3)對照品溶液的配製
用甲醇配置單標溶液，混合製得混標溶液，其中含黃芩苷(0.16mg/ml)、漢黃芩苷(0.04mg/ml)、黃芩素(0.08mg/ml)、漢黃芩素(0.01mg/ml)。
樣品溶液的製備方法取黃芩提取物粉末0.04g，加70％乙醇90mL，超聲30min，放冷，定容至100mL。
(4)測定取各樣品在確定條件下進樣10μL進行梯度洗脫，測得樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量。
權利要求
1.一種黃芩提取物質量標準的含量測定方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)儀器Agilent G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD G1315A檢測器，G1313A自動進樣器，色譜工作站Agilent 1100 series；(2)色譜條件色譜柱Inertsil ODS-3(4.6×250mm 5μm)保護柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID檢測波長280nm柱溫40℃流動相A∶乙腈∶水∶甲酸＝17∶83∶1，B∶乙腈∶水∶甲酸＝80∶20∶1流速1.0ml*min-1洗脫時間90min進樣量10μl梯度條件0-30min A(100-70％)，B(0-30％)30-70min A(70-0％)，B(30-100％)70-90min A(0-0％)，B(100-100％)；(3)對照品溶液的配製用甲醇配置單標溶液，混合製得混標溶液，其中含黃芩苷(0.16mg/ml)、漢黃芩苷(0.04mg/ml)、黃芩素(0.08mg/ml)、漢黃芩素(0.01mg/ml)；樣品溶液的製備方法取黃芩提取物粉末0.04g，加70％乙醇90mL，超聲30min，放冷，定容至100mL；(4)測定取各樣品在確定條件下進樣10μL進行梯度洗脫，測得樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量。
2.根據權利要求1所述的一種黃芩提取物質量標準及其含量測定方法，其特徵在於其中所述的黃芩提取物苷、漢黃芩苷和黃芩素的測定標準為黃芩苷含量85～91％，黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷三者含量之和為6～12％，重金屬低於20ppm外，鉛、汞、砷、鎘四個主要重金屬元素的含量分別低於或等於5、0.2、2和0.3ppm，農藥殘留物六六六、DDT、五氯硝基苯和艾氏劑分別小於或等於0.1、0.1、0.1和0.02ppm。
3.根據權利要求1所述的一種黃芩提取物的含量測定方法，其特徵在於其中所述的對照品漢黃芩苷是通過下列方法製備的取黃芩藥材，切成片段，用50％乙醇回流提取，真空濃縮，上大孔樹脂柱層析，先用水、20％乙醇洗滌，然後用乙醇梯度洗脫，以TLC為檢出手段，收集富含苷類的流份，濃縮、乾燥，得到粉末浸膏，備用；取上述浸膏粉末，用75％乙醇溶解，反覆上凝膠柱層析數次，收集富含漢黃芩苷的流份，濃縮後再行反相製備層析柱，以甲醇-水系統梯度洗脫，以TLC為檢出手段，收集富含漢黃芩苷的流份，濃縮至幹，以甲醇重結晶，得到漢黃芩苷純品。
全文摘要
本發明提供了一種黃芩提取物質量標準及其含量測定方法。本發明的質量標準及其測定方法是在2005年版中國藥典基礎上的改進，提出的新標準為黃芩苷含量85－91％，黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷三者含量之和為6－12％。本發明還提供了對照品漢黃芩苷的製備方法。
文檔編號A61K125/00GK1919256SQ20051002901
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月23日 優先權日2005年8月23日
發明者張國明, 王新宏, 謝德隆, 安睿, 華菊根, 徐曉英, 袁華梁 申請人:上海市中藥研究所