一種調控fbxo31基因表達的小分子rna模擬物在製備治療胃癌藥物中的應用的製作方法

2023-12-09 09:32:46 4

一種調控fbxo31基因表達的小分子rna模擬物在製備治療胃癌藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種調控FBXO31基因表達的小分子RNA模擬物在製備治療胃癌藥物中的應用，所述調控FBXO31基因表達的小分子RNA模擬物，分別為miR-20a的模擬物和miR-17的模擬物；miR-20a的模擬物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，miR-17的模擬物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明提供了一種胃癌治療的新思路，為研發治療胃癌藥物提供了新途徑。
【專利說明】—種調控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在製備治療胃癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種調控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在製備治療胃癌藥物中的應用，屬於生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]胃癌是世界範圍內最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居腫瘤相關死亡的第二位。根據2008年的統計數據，胃癌發生率佔癌症總發生率的8 %，而胃癌死亡率佔癌症相關死亡的10%。東亞是胃癌發病率最高的區域，特別是中國。由於在胃癌的早期階段很難以被診斷，導致大多數患者在發現時就到了晚期或轉移性階段。利用傳統的手術治療，化療或放療在改善胃癌患者的生存率方面沒有太大的意義。因此，關鍵是尋找新的診斷或預後標誌物和治療祀標，以提聞胃癌患者的存活率。
[0003]FBX031屬於F_box家族，含有F_box結構域的蛋白質參與Skp1-CulIin-F-box(SCF)E3泛素連接酶複合體的組成,介導泛素-蛋白酶體依賴的降解途徑，進而調控細胞內的信號轉導，細胞周期進程，中心體的穩定性等。根據除F-box結構域之外的其他結構域的組成可將F-box蛋白被分為三大家族。FBXW含有WD40重複序列；FBXL含有富含亮氨酸重複序列和FBXO包含其他領域。FBX031屬於FBXO組。
[0004]FBX031位於染色體16q24.3，在神經元的發育，DNA損傷修復反應和腫瘤發生等過程中起到了至關重要的作用。FBX031最初被認為是一種候選抑癌基因，研究發現FBX031在乳腺癌中表達水平顯著降低，在乳腺癌細胞中過表達FBX031後可抑制細胞的克隆形成及細胞增殖，誘導細胞衰老和Gl期細胞周期阻滯。此外，與正常肝組織相比，FBX031在肝癌中的表達水平也顯著降低，但在食管鱗狀細胞癌(鱗癌)中FBX031卻得到相反的結果。KOGO等人表明，FBX031表達水平越高，腫瘤的侵襲能力越強、臨床分期級別越高，愈後越差。從這些結果來看，FBX031在腫瘤發生發展中的作用還存在爭議。目前還不清楚FBX031在胃癌中的表達水平和功能如何，以及它在胃癌中是如何被調控。

【發明內容】

[0005]本發明針對現有技術的不足，提供一種調控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物的應用。
[0006]本發明技術方案如下:
[0007]一種調控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在製備治療胃癌藥物中的應用，所述調控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物，分別為miR_20a的模擬物和miR-17的模擬物；miR-20a的模擬物核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，miR-17的模擬物核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0008]根據本發明優選的，上述miR_20a的模擬物和miR-17的模擬物作為治療胃癌藥物的有效成分。[0009]有益效果
[0010]本發明首次發現了 FBX031表達在胃癌組織中顯著降低，該現象與胃癌進展密切相關，並找到了調控FBX031基因的表達的小分子RNA miR-20a和miR-17，發現調控FBX031基因的表達的小分子miR-20a和miR-17的過表達引起FBX031在胃癌中的表達降低，從而提供了一種治療胃癌的新思路，為研發胃癌治療藥物提供了新途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1FBX031基因在胃癌組織中的表達水平的檢測結果；
[0012]圖1A為用RT-PCR方法檢測胃癌標本中FBX031的mRNA水平的結果圖；
[0013]圖中:N:癌旁正常組織，T:胃癌組織，β 2-M:內參。
[0014]圖1B為用qRT-PCR的方法檢測53對胃癌標本中FBX031的mRNA表達水平的統計圖；
[0015]圖1C為用Western blot方法檢測胃癌標本中FBX031的蛋白表達水平的結果圖；
[0016]圖中:N:癌旁正常組織，T:胃癌組織，β -actin:內參。
[0017]圖1D為用Western blot方法檢測52對胃癌標本中FBX031的蛋白表達水平的統計圖；
[0018]圖2為胃癌和癌 旁組織的組織晶片進行免疫組化檢測結果照片；
[0019]圖2A為癌旁組織的組織晶片進行免疫組化檢測結果照片；
[0020]圖2B為癌旁組織的組織晶片進行免疫組化檢測結果照片；
[0021]圖2C為胃癌組織的組織晶片進行免疫組化檢測結果照片；
[0022]圖2D為胃癌組織的組織晶片進行免疫組化檢測結果照片；
[0023]圖2E為胃癌組織的組織晶片進行免疫組化檢測結果照片；
[0024]圖2F為胃癌組織的組織晶片進行免疫組化檢測結果照片；
[0025]圖3為FBX031表達陽性的病人與FBX031表達陰性的病人的存活期限統計曲線圖；
[0026]圖4對照質粒(pCMV-myc)、表達野生型FBX031的質粒(pCMV-myc_FBX031)和F-box序列缺失的突變質粒(pCMV-myc-FBX031 AF)分別轉染胃癌細胞BGC-823和HGC-27後細胞克隆形成能力、細胞周期進程及細胞周期相關蛋白表達水平的檢測結果；
[0027]圖4A 為 pCMV-myc，pCMV-myc-FBX031，pCMV-myc-FBX031 Δ F 分別轉染胃癌細胞BGC-823和HGC-27後細胞克隆形成能力的檢測結果；
[0028]圖4Β 為 pCMV-myc，pCMV-myc_FBX031，pCMV-myc_FBX031 Δ F 分別轉染胃癌細胞BGC-823和HGC-27後細胞克隆形成數目的統計圖；
[0029]圖4C為不同轉染的細胞所處的細胞周期的峰值圖；
[0030]圖中:pCMV為轉染對照載體的胃癌細胞，FBX031為轉染FBX031表達載體的胃癌細胞，AFBX031為轉染FBX031中F_box區域缺失的突變載體的胃癌細胞；
[0031]圖4D為不同轉染細胞中細胞周期相關蛋白的表達水平的檢測結果；
[0032]圖5為FBX031對裸鼠體內的腫瘤形成能力的影響；
[0033]圖5A為注射轉染對照載體的胃癌細胞和轉染FBX031表達載體的胃癌細胞2周後，裸鼠腫瘤體積與時間關係的曲線圖；[0034]圖5B為注射轉染對照載體的胃癌細胞和轉染FBX031表達載體的胃癌細胞4周後的裸鼠照片；
[0035]圖5C為注射轉染對照載體的胃癌細胞和轉染FBX031表達載體的胃癌細胞4周後，移植瘤體積的照片；
[0036]圖為注射轉染對照載體的胃癌細胞和轉染FBX031表達載體的胃癌細胞4周後移植瘤重量比較柱狀圖；
[0037]圖6為FBX031受小分子miR-17和miR_20a調控的檢測結果；
[0038]圖6A為miR-20a和miR-17模擬物轉染細胞後，miR-17和miR_20a的表達水平柱狀圖；
[0039]圖6B為miR-20a和miR-17模擬物轉染細胞後，FBX031的mRNA表達水平柱狀圖；
[0040]圖6C為miR-20a和miR-17模擬物轉染細胞後，FBX031的蛋白表達檢測照片；
[0041]圖6D為miR-20a和miR-17抑制劑轉染細胞後，miR-17和miR_20a的表達水平柱狀圖；
[0042]圖6E為miR-20a和m1-17的抑制劑轉染細胞後，FBX031的mRNA表達水平柱狀圖；
[0043]圖6F為miR_20a和miR-17抑制劑轉染細胞後，FBX031的蛋白表達檢測結果照片；
[0044]圖6G為miR_20a 和miR-17模擬物分別與野生型、結合位點I突變型、結合位點2突變型及結合位點1，2均突變型共轉染胃癌細胞後，測得的螢光素酶活性柱狀圖；
[0045]圖7為胃癌組織和癌旁組織中miR-20a和miR-17的表達檢測結果；
[0046]圖7A為胃癌組織和癌旁組織中miR_20a的表達水平柱狀圖；
[0047]圖7B為胃癌組織和癌旁組織中miR-17的表達水平柱狀圖；
[0048]圖7C為胃癌組織和癌旁組織中miR_20a的表達水平的統計圖；
[0049]圖7D為胃癌組織和癌旁組織中miR-17的表達水平的統計圖；
[0050]圖7E為FBX031和miR_20a在胃癌中表達關係的統計圖；
[0051]圖7F為FBX031和miR-17在胃癌中表達關係的統計圖。
【具體實施方式】
[0052]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明，並非對本發明的限制，凡依照本發明公開的內容進行的任何本領域的等同的替代，均屬於本發明的保護範圍。
[0053]實施例1
[0054]RT-PCR、qRT-PCR和Western blot方法檢測表明FBX031的mRNA和蛋白水平在人胃癌組織中的表達水平均顯著下降；
[0055]1.材料與方法
[0056](I)病人
[0057]56例胃癌及其周圍組織是來自於2012-2013期間在山東省腫瘤醫院進行胃腫瘤切除術的病人，標本保存於_80°C。通過對手術時病人的年齡、性別、病理類型、分化程度、腫瘤大小(直徑)、侵襲情況、局部及遠端轉移的信息進行統計，具體情況如表1所示:
[0058]表1、病人和腫瘤特徵以及在FBX031蛋白在正常黏膜和胃癌組織中的表達水平
[0059]
【權利要求】
1.一種調控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在製備治療胃癌藥物中的應用，所述調控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物，分別為miR_20a的模擬物和miR-17的模擬物；miR-20a的模擬物核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，miR-17的模擬物核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
2.如權利要求1所述 的應用，其特徵在於，所述miR-20a的模擬物和miR-17的模擬物作為治療胃癌藥物的有效成分。
【文檔編號】A61K48/00GK104027822SQ201410268705
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月16日 優先權日:2014年6月16日
【發明者】劉志方, 張新潮, 徐霞, 孔葉, 鄒水燕 申請人:山東大學