用於鑑別水稻品種的方法

2023-11-11 21:26:17

專利名稱：用於鑑別水稻品種的方法
技術領域：
本發明涉及用於鑑別水稻品種的方法。
背景技術：
傳統地，水稻植物或水稻的品種已經通過栽培性狀(例如，高度、分櫱數、抽穗天數)，精製加工(polishing)前/後的穀粒特性(例如，顆粒形狀、重量和白度)以及蒸煮品質(例如，口味)來鑑別。此外，利用例如RFLP(限制性內切酶酶切片段長度多態性)和CAPS(切割擴增的多態性序列)的分子遺傳分析的分類法也已是可行的。然而，有經驗的種植者需要目測通過其栽培特性來鑑別品種，而這不是剛好任何人都能夠判斷的。此外，需要糙米或精米特性的統計分析，並且需要確定一定量稻米的蒸煮品質。因此，不可能鑑別每個單獨的稻粒。就原理而論，分子遺傳分析已經解決了這些問題；然而實際上，雖然這種分析有效用於鑑別遠相關的品種，但該分析對於近相關的品種是困難的，因為很難獲得確定的分子標記。
根據定義，單核苷酸多態性(SNPs)是存在於DNA核苷酸序列中的單核苷酸差異。實際上，它們經常包括SSR(單一順序重複)和插入或缺失突變。毫不誇張地說，SNPs產生所有利用例如RFLP和CAPS的分子標記可檢測的遺傳學差異，並且所有的遺傳學差異反映在表型等中。近年來SNP研究和SNP分析系統已經有驚人的進展。目前，已經發展提供所有步驟的分析系統，從PCR到結果，在96孔平板中進行而不需要電泳，與傳統的分子標記相比能夠進行顯著有效的基因型鑑定。
最近，食品工業中標記需求的可靠性已經成為問題，而水稻也不例外。例如，以Koshihikari出售的水稻的數量超過Koshihikari的全國生產量。因此，不能否認揭露造假的可能性，並且消費者和銷售者都需要精確鑑別精米品種並且確定混合比率的分析。
發明公開本發明已經鑑於上述情況而實現。本發明的目的是提供快速而輕易鑑別水稻品種的新方法。更具體地說，本發明旨在提供利用多態性標記有效鑑別水稻品種的方法。
為了解決這些問題，本發明人進行深入的研究。首先，利用水稻基因組序列，通過選擇那些公眾可得到的水稻基因組核苷酸序列的染色體區域的主要推定的基因間區域，並且通過利用針對其他區域的RFLP標記探針等的序列來設計用於從基因組DNA擴增800bp-1kbp片段的引物。使用所設計的引物，和通過簡單方法從水稻品種Nipponbare、Koshihikari、Kasalath、Guang-lu-ai 4(下文為G4)、Kitaake，和野生稻(普通野生稻(Oryza rufipogon)，W1943)提取的DNA作為模板進行PCR擴增，以製備用於測序反應的模板。然後模板經受循環測序，並且製備用於測序的樣品。在品種間比較所得到的序列數據，以搜尋單核苷酸取代的多態性。每個品種用各個引物至少測序兩次，並且只有確定的情況被認為是多態性的。
在Nipponbare和Koshihikari，以及Nipponbare和Kitaake之間發現的多態性位置的核苷酸序列通過進行PCR和如上所述的測序檢驗，其中所使用的通過簡單方法提取的基因組DNA模板來自Nipponbare、Hatsushimo、Mutsuhomare、Yukinosei、Kirara 397、Tsugaruroman、Gohyakumangoku、Morinokumasan、Yumeakari、Hanaechizen、Koshihikari、Tsukinohikari、Akitakomachi、Asanohikari、Aichinokaori、Matsuribare、Hinohikari、Yumetsukushi、Hitomebore、Manamusume、Fusaotome、Dontokoi、Kinuhikari和Sasanishiki。比較品種間處於多態性位點的核苷酸序列。
其次，設計用於檢測對鑑別品種有用的SNPs的引物，並且利用AcycloPrime-FP試劑盒(Perkin Elmer)進行單核苷酸終止劑反應以製備用於基因型鑑定的樣品。通過利用ARVO(Perkin Elmer)進行基因型鑑定以測量螢光偏振。
結果顯示在通過測序確定為SNPs的那些位置附近產生的標記顯示獨特的模式，並且它們可組合用於將品種分類到不同的組。因此，本發明人成功獲得可用於鑑別24個水稻品種的多態性標記。
如上所述，本發明人在24個在日本具有大規模種植面積的水稻品種中搜尋SNPs，並且獲得能夠以快捷而簡單的方式鑑別品種的多態性標記。因此利用多態性標記實現新的用於鑑別水稻品種的方法。本發明的方法能夠區別近相關的品種並且在DNA水平加以鑑定。
因此，本發明涉及以快捷、簡單且更特異的方式來鑑別水稻品種的新方法，其提供[1]鑑別水稻品種的方法，包括下列步驟(a)和(b)(a)確定根據水稻基因組中下列(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中與該位置的核苷酸組成鹼基對的核苷酸的類型(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列的593位，(2)SEQ ID NO2的核苷酸序列的304位，(3)SEQ ID NO3的核苷酸序列的450位，(4)SEQ ID NO4的核苷酸序列的377位，(5)SEQ ID NO5的核苷酸序列的163位，(6)SEQ ID NO6的核苷酸序列的624位，(7)SEQ ID NO7的核苷酸序列的534位，(8)SEQ ID NO8的核苷酸序列的358位，(9)SEQ ID NO9的核苷酸序列的475位，(10)SEQ ID NO10的核苷酸序列的323位，(11)SEQ ID NO11的核苷酸序列的612位，(12)SEQ ID NO12的核苷酸序列的765位，(13)SEQ ID NO13的核苷酸序列的571位，(14)SEQ ID NO14的核苷酸序列的660位，(15)SEQ ID NO15的核苷酸序列的223位，(16)SEQ ID NO16的核苷酸序列的247位，(17)SEQ ID NO17的核苷酸序列的163位，(18)SEQ ID NO18的核苷酸序列的421位，(19)SEQ ID NO19的核苷酸序列的178位，(20)SEQ ID NO20的核苷酸序列的141位，(21)SEQ ID NO21的核苷酸序列的480位，(22)SEQ ID NO22的核苷酸序列的481位，(23)SEQ ID NO23的核苷酸序列的131位，(24)SEQ ID NO24的核苷酸序列的510位，
(25)SEQ ID NO25的核苷酸序列的248位，(26)SEQ ID NO26的核苷酸序列的92位，(27)SEQ ID NO27的核苷酸序列的743位，和(28)SEQ ID NO28的核苷酸序列的552位，以及(b)使步驟(a)中確定的核苷酸類型與水稻的品種相關；[2][1]的方法，其中通過利用以水稻基因組中下列(1)-(28)的任何突變為特徵的多態性標記來鑑別核苷酸的類型(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列中593位的核苷酸是T，(2)SEQ ID NO2的核苷酸序列中304位的核苷酸是T，(3)SEQ ID NO3的核苷酸序列中450位的核苷酸是A，(4)SEQ ID NO4的核苷酸序列中377位的核苷酸是C，(5)SEQ ID NO5的核苷酸序列中163位的核苷酸是C，(6)SEQ ID NO6的核苷酸序列中624位的核苷酸是C，(7)SEQ ID NO7的核苷酸序列中534位的核苷酸是C，(8)SEQ ID NO8的核苷酸序列中358位的核苷酸是G，(9)SEQ ID NO9的核苷酸序列中475位的核苷酸是G，(10)SEQ ID NO10的核苷酸序列中323位的核苷酸是A，(11)SEQ ID NO11的核苷酸序列中612位的核苷酸是A，(12)SEQ ID NO12的核苷酸序列中765位的核苷酸是T，(13)SEQ ID NO13的核苷酸序列中571位的核苷酸是T，(14)SEQ ID NO14的核苷酸序列中660位的核苷酸是G，(15)SEQ ID NO15的核苷酸序列中223位的核苷酸是A，(16)SEQ ID NO16的核苷酸序列中247位的核苷酸是A，(17)SEQ ID NO17的核苷酸序列中163位的核苷酸是A，(18)SEQ ID NO18的核苷酸序列中421位的核苷酸是C，(19)SEQ ID NO19的核苷酸序列中178位的核苷酸是G，(20)SEQ ID NO20的核苷酸序列中141位的核苷酸是G，(21)SEQ ID NO21的核苷酸序列中480位的核苷酸是C，(22)SEQ ID NO22的核苷酸序列中481位的核苷酸是C，(23)SEQ ID NO23的核苷酸序列中131位的核苷酸是C，(24)SEQ ID NO24的核苷酸序列中510位的核苷酸是A，
(25)SEQ ID NO25的核苷酸序列中248位的核苷酸是T，(26)SEQ ID NO26的核苷酸序列中92位的核苷酸是C，(27)SEQ ID NO27的核苷酸序列中743位的核苷酸是G，以及(28)SEQ ID NO28的核苷酸序列中552位的核苷酸是T；[3][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(c)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，以及(c)確定擴增的DNA的核苷酸序列；[4][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(d)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)用限制性內切酶消化所製備的DNA，(c)按大小分離DNA片段，以及(d)與對照比較所檢測DNA片段的大小；[5][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(e)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(c)用限制性內切酶消化所擴增的DNA，(d)按大小分離DNA片段，以及(e)與對照比較所檢測DNA片段的大小；[6][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(e)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(c)使所擴增的DNA變性為單鏈的DNAs，(d)在非變性的凝膠上分離變性的單鏈DNA，以及(e)與對照比較凝膠上所分離單鏈DNA的遷移率；[7][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)合成用報告螢光染料和淬滅螢光染料標記的2個不同寡核苷酸探針，其中寡核苷酸與包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的近側核苷酸序列是互補的，(c)將步驟(a)中製備的DNA與步驟(b)中合成的探針雜交，(d)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(e)檢測報告螢光的發射，以及(f)與對照比較步驟(e)中所檢測的報告螢光的發射；[8][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(h)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)合成探針，其中與包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的3′-側的核苷酸序列互補的序列，與完全無關的序列結合，(c)合成與包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的5′-側的區域互補的探針，(d)將步驟(c)中合成的探針與步驟(a)中製備的DNA雜交，(e)用單鏈DNA切割酶消化步驟(d)中雜交的DNA，並且分離步驟(b)中合成的探針部分，(f)將步驟(e)中離解的探針與用於檢測的探針雜交，(g)酶促消化步驟(f)中的雜交DNA，並且測量由此產生的螢光強度，以及(h)與對照比較步驟(g)中所測量的螢光強度。
[1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成具有該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(c)使所擴增的DNA變性為單鏈的DNAs，(d)從變性的單鏈DNAs只分離一個鏈，(e)從鄰近[1]的(1)-(28)的任何位置，或互補鏈中與該位置的核苷酸組成鹼基對的核苷酸進行延伸反應，其中由此反應一次延伸一個核苷酸，然後酶促發光顯示所產生的焦磷酸，並且測量發光強度，以及(f)與對照比較步驟(e)中所測量的螢光強度； [1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(c)合成與包括覆蓋鄰近於[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的序列的核苷酸序列互補的探針，(d)在存在螢光標記的核苷酸時，利用步驟(b)中擴增的DNA作為模板以及步驟(c)中合成的引物進行單核苷酸的延伸反應，(e)測量螢光偏振，以及(f)與對照比較步驟(e)中所測量的螢光偏振。
[1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(c)合成與包括覆蓋鄰近於[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的序列的核苷酸序列互補的引物，(d)在存在螢光標記的核苷酸時，利用步驟(b)中擴增的DNA作為模板以及步驟(c)中合成的引物進行單核苷酸的延伸反應，(e)利用測序儀確定步驟(d)的反應中所使用的核苷酸種類，以及(f)與對照比較步驟(e)中所確定的核苷酸；[12][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(d)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(c)利用質譜儀測量步驟(b)中所擴增的DNA的分子量，以及(d)與對照比較步驟(c)中所測量的分子量；[13][1]或[2]的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA，(c)提供固定核苷酸探針的基底，
(d)將步驟(b)中的DNA與步驟(c)中的基底接觸，(e)檢測DNA和固定在基底上的核苷酸探針之間的雜交強度，以及(f)與對照比較步驟(e)中所檢測的強度；[14][1]或[13]中任何的方法，進一步包括下列步驟(a)和(b)(a)在鹼性水溶劑中破裂水稻種子，以及(b)從步驟(a)中破裂的種子中提取水稻基因組DNA；[15][14]的方法，其中稻種是精米(polish)；[16]用於鑑別水稻品種的引物(或用於鑑別水稻品種的試劑)，其中引物是(a)用於擴增包括水稻基因組中[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的DNA區域的寡核苷酸，或(b)包括與覆蓋鄰近於水稻基因組中[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成該位置核苷酸鹼基對的互補鏈中核苷酸的序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸；[17]用於鑑別水稻品種的寡核苷酸(或用於鑑別水稻品種的試劑)，其中該寡核苷酸與包括[1]的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中與該位置的核苷酸組成鹼基對的核苷酸，包括至少15個核苷酸的DNA區域雜交；[18]用於鑑別水稻品種的試劑盒，包括[16]或[17]的寡核苷酸；以及[19][18]的試劑盒，進一步包括鹼性水溶劑。
本發明人分析24個水稻品種的基因組序列，並因此發現能夠精確鑑別水稻品種的多態性標記。SEQ ID NOs1-28顯示水稻基因組中包括由本發明人鑑定的多態性位點的DNA區域。每一多態性的位置顯示在

圖1-29以及表8和9中。
本發明提供用於鑑別水稻品種的方法。在本方法中，24個水稻品種基因組中由本發明人鑑定的多態性位點的核苷酸類型是首次確定的。更具體地說，在水稻基因組中確定了在下列(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或組成互補鏈中上述該位置核苷酸鹼基對的核苷酸(步驟(A))。
(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列的593位，(2)SEQ ID NO2的核苷酸序列的304位，(3)SEQ ID NO3的核苷酸序列的450位，(4)SEQ ID NO4的核苷酸序列的377位，(5)SEQ ID NO5的核苷酸序列的163位，(6)SEQ ID NO6的核苷酸序列的624位，
(7)SEQ ID NO7的核苷酸序列的534位，(8)SEQ ID NO8的核苷酸序列的358位，(9)SEQ ID NO9的核苷酸序列的475位，(10)SEQ ID NO10的核苷酸序列的323位，(11)SEQ ID NO11的核苷酸序列的612位，(12)SEQ ID NO12的核苷酸序列的765位，(13)SEQ ID NO13的核苷酸序列的571位，(14)SEQ ID NO14的核苷酸序列的660位，(15)SEQ ID NO15的核苷酸序列的223位，(16)SEQ ID NO16的核苷酸序列的247位，(17)SEQ ID NO17的核苷酸序列的163位，(18)SEQ ID NO18的核苷酸序列的421位，(19)SEQ ID NO19的核苷酸序列的178位，(20)SEQ ID NO20的核苷酸序列的141位，(21)SEQ ID NO21的核苷酸序列的480位，(22)SEQ ID NO22的核苷酸序列的481位，(23)SEQ ID NO23的核苷酸序列的131位，(24)SEQ ID NO24的核苷酸序列的510位，(25)SEQ ID NO25的核苷酸序列的248位，(26)SEQ ID NO26的核苷酸序列的92位，(27)SEQ ID NO27的核苷酸序列的743位，(28)SEQ ID NO28的核苷酸序列的552位。
使用在此所公開的，例如核苷酸序列和多態性位點的信息，本領域的技術人員通常可容易地適當鑑定基因組上相應於多態性位點的實際位置。例如，本發明的多態性的基因組位置可通過參照公眾可得到的基因組資料庫等而鑑定。簡而言之，即使序列表中的核苷酸序列和實際的基因組序列之間存在微小的差別，實際基因組上的本發明的多態性位點可通過利用序列表中所顯示的核苷酸序列對基因組序列進行同源性搜索等而精確鑑定。
通常，基因組DNA由互補的雙鏈DNA組成。因此，即使當為了描述的目的而在此公開一個鏈的DNA序列，應自然地假定其互補的序列(核苷酸)也是公開的。當一個鏈的DNA序列(核苷酸)已知，其互補序列(核苷酸)對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
在此，″多態性″不限於包括例如取代、缺失和插入單個核苷酸突變的單核苷酸多態性(SNPs)。″多態性″也包括幾個連續核苷酸的多態性。″多態性的標記″在此定義為在多態性位點的關於核苷酸突變的信息(多態性突變)。更具體地說，本發明的多態性標記指關於核苷酸序列中突變的信息，其通過將水稻品種Nipponbare的基因組序列與另一個品種的基因組序列比較而鑑定，這可用於鑑別水稻品種。在此，用於確定核苷酸類型的多態性標記優選是下列(1′)-(28′)所描述的多態性標記。因此，在本發明優選的實施方案中，水稻品種通過利用下列(1′)-(28′)所描述的多態性標記而鑑別(1′)SEQ ID NO1的核苷酸序列中593位的核苷酸是T。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO1的核苷酸序列中593位的核苷酸包括C到T的取代。
(2′)SEQ ID NO2的核苷酸序列中304位的核苷酸是T。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO2的核苷酸序列中304位的核苷酸包括A到T的取代。
(3′)SEQ ID NO3的核苷酸序列中450位的核苷酸是A。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO3的核苷酸序列中450位的核苷酸包括G到A的取代。
(4′)SEQ ID NO4的核苷酸序列中377位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO4的核苷酸序列中377位的核苷酸包括T到C的取代。
(5′)SEQ ID NO5的核苷酸序列中163位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO5的核苷酸序列中163位的核苷酸包括T到C的取代。
(6′)SEQ ID NO6的核苷酸序列中624位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO6的核苷酸序列中624-626位的核苷酸是缺失的。
(7′)SEQ ID NO7的核苷酸序列中534位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO7的核苷酸序列中534位的核苷酸包括A到C的取代。
(8′)SEQ ID NO8的核苷酸序列中358位的核苷酸是G。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO8的核苷酸序列中358位和389位的核苷酸之間插入GT。
(9′)SEQ ID NO9的核苷酸序列中475位的核苷酸是G。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO9的核苷酸序列中475位的核苷酸包括T到G的取代。
(10′)SEQ ID NO10的核苷酸序列中323位的核苷酸是A。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO10的核苷酸序列中323位的核苷酸包括G到A的取代。
(11′)SEQ ID NO11的核苷酸序列中612位的核苷酸是A。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO11的核苷酸序列中612位和613位的核苷酸取代為CA到AG。
(12′)SEQ ID NO12的核苷酸序列中765位的核苷酸是T。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO12的核苷酸序列中765位的核苷酸包括G到T的取代。
(13′)SEQ ID NO13的核苷酸序列中571位的核苷酸是T。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO13的核苷酸序列中571位的核苷酸包括G到T的取代。
(14′)SEQ ID NO14的核苷酸序列中660位的核苷酸是G。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO14的核苷酸序列中660位的核苷酸包括A到G的取代。
(15′)SEQ ID NO15的核苷酸序列中223位的核苷酸是A。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO15的核苷酸序列中223位的核苷酸包括G到A的取代。
(16′)SEQ ID NO16的核苷酸序列中247位的核苷酸是A。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO16的核苷酸序列中247位的核苷酸包括G到A的取代。
(17′)SEQ ID NO17的核苷酸序列中163位的核苷酸是A。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO17的核苷酸序列中163位的核苷酸包括G到A的取代。
(18′)SEQ ID NO18的核苷酸序列中421位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO18的核苷酸序列中421位的核苷酸包括A到C的取代。
(19′)SEQ ID NO19的核苷酸序列中178位的核苷酸是G。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO19的核苷酸序列中178位的核苷酸是缺失的。
(20′)SEQ ID NO20的核苷酸序列中141位的核苷酸是G。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO20的核苷酸序列中141位的核苷酸包括A到G的取代。
(21′)SEQ ID NO21的核苷酸序列中480位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO21的核苷酸序列中480位的核苷酸包括T到C的取代。
(22′)SEQ ID NO22的核苷酸序列中481位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO22的核苷酸序列中481位的核苷酸包括T到C的取代。
(23′)SEQ ID NO23的核苷酸序列中131位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO23的核苷酸序列中131位的核苷酸包括G到C的取代。
(24′)SEQ ID NO24的核苷酸序列中510位的核苷酸是A。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO24的核苷酸序列中510位的核苷酸包括G到A的取代。
(25′)SEQ ID NO25的核苷酸序列中248位的核苷酸是T。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO25的核苷酸序列中248位的核苷酸包括C到T的取代。
(26′)SEQ ID NO26的核苷酸序列中92位的核苷酸是C。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO26的核苷酸序列中92位的核苷酸包括G到C的取代。
(27′)SEQ ID NO27的核苷酸序列中743位的核苷酸是G。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO27的核苷酸序列中743位的核苷酸包括A到G的取代。
(28′)SEQ ID NO28的核苷酸序列中552位的核苷酸是T。更具體地，Nipponbare基因組中SEQ ID NO28的核苷酸序列中552位的核苷酸包括C到T的取代。
在此，″確定核苷酸的類型″通常指確定在待鑑別品種的水稻(下文也描述為″待測試水稻″)的水稻基因組上任何上述(1)-(28)所描述位置的核苷酸序列。然而，不必具體確定核苷酸的實際種屬。即使在待測試水稻的基因組中不具體確定在任何上述(1)-(28)位的核苷酸序列，也可能通過檢驗其是否與Nipponbare相同而鑑別該水稻品種。
其次，在本發明的方法中，使上述步驟(A)中所確定的核苷酸序列與水稻品種相關(步驟(B))。
可通過本發明的方法鑑別的水稻品種如下(每個品種的名稱可如括號中所示的在此縮寫)Nipponbare(nhb)、Hatsushimo(hts)、Mutsuhomare(mth)、Yukinosei(yki)、Kirara 397(krr)、Tsugaruroman(tgr)、Gohyakumangoku(ghm)、Morinokumasan(mnk)、Yumeakari(yma)、Hanaechizen(hez)、Koshihikari(ksh)、Tsukinohikari(tkh)、Akitakomachi(akk)、Asanohikari(ash)、Aichinokaori(ank)、Matsuribare(mtb)、Hinohikari(hnh)、Yumetsukushi(ymt)、Hitomebore(hit)、Manamusume(mmm)、Fusaotome(fom)、Dontokoi(don)、Kinuhikari(knh)、Sasanishiki(ssk)、Akebono(akb)和Goropikari(grp)。
本發明鑑別水稻品種的方法通常可用於鑑定選自上述品種的未知品種的名稱，或確定水稻是否屬於上述的一個品種。
本發明人確定上述水稻品種的基因組中在上述(1)-(28)所描述位置的核苷酸序列，並且獲得多態性的標記。表1顯示多態性標記的詳細說明(多態性標記的名稱，和每一水稻品種的上述(1)-(28)位置的核苷酸序列)。
表1

在此，待測試水稻的品種可通過確定其基因組中上述(1)-(28)位置的核苷酸序列，並且將其與表1中所示的水稻品種的核苷酸序列數據比較而鑑定。在本發明優選的實施方案中，利用上述(1′)-(28′)所描述的多態性標記鑑別核苷酸序列。在本發明的方法中，不必確定上述(1)-(28)中所描述的所有位置的核苷酸序列。例如，多態性標記″S0124″可用於確定如上述(10)中所示的SEQ ID NO10的核苷酸序列中323位的核苷酸序列。如果確定核苷酸序列是A(腺嘌呤)，則待測試水稻確定為Kirara 397。在另一個情況中，多態性標記″S0126″和″S0015″可組合用於確定核苷酸序列。如果上述(9)中SEQ ID NO9的核苷酸序列中475位的核苷酸是G；並且上述(1)中SEQ ID NO1的核苷酸序列中593位的核苷酸是C，則待測試水稻確定為Yukinosei。因此，利用在上述(1)-(28)所描述位置的待測試水稻基因組中確定的核苷酸序列，本領域的技術人員能夠根據在此所提供的表1輕易地確定水稻品種。
此外，在本發明的方法中，不必確定上述(1)-(28)中所描述位置的核苷酸的類型。水稻品種可通過檢驗待測試水稻基因組中上述(1)-(28)位置的核苷酸序列是否與相同位置的Nipponbare序列相同而鑑別。在本發明優選的實施方案中，上述(1′)-(28′)的多態性標記可用於確定待測試水稻基因組中上述(1)-(28)位置的核苷酸序列是否與該位置的Nipponbare序列相同。
對於每個上述水稻品種，本發明人檢驗在上述(1)-(28)位置的核苷酸序列是否與Nipponbare的核苷酸序列相同，並且建立多態性標記的組合以使得能夠鑑別上述品種(表2-7)。在表2-7中，可鑑別品種的多態性標記的組合是加陰影的。多態性標記的組合不限於表2-7中所顯示的，並且本領域的技術人員可根據本發明所提供的26個水稻品種基因組中上述(1)-(28)位置的核苷酸序列信息，適當地選擇可用於鑑別品種的多態性標記的組合。在該表格中，圓形表示與Nipponbare匹配，而叉形表明不匹配。
表2
表3
表4
表5
表6
表7
例如，可利用針對如上述(12)所示的SEQ ID NO12的核苷酸序列中765位的核苷酸序列的多態性標記″S0135″，和針對如(19)所示的SEQ ID NO19的178位核苷酸序列的″S0208″來檢驗待測試水稻。如果待測試水稻的核苷酸序列不與Nipponbare的核苷酸序列在前面的位點相匹配，但是在後面的位點匹配，則待測試水稻確定為Fusaotome。通過利用上述(1′)-(28′)的每個多態性標記確定上述位置的核苷酸序列，可發現待測試水稻和Nipponbare的核苷酸序列在上述(1)-(28)的位置相配或不相配，並且可根據表2-7輕易鑑別待測試水稻的品種。
本領域的技術人員可利用公眾已知的用於確定核苷酸序列的方法，用於檢測多態性突變的方法等來確定本發明上述步驟(A)中的核苷酸種屬。例如，在本發明優選的實施方案中，可使用下列方法首先，從待測試水稻製備DNAs。在此，待測試水稻包括其葉、根、種子、愈傷組織、葉鞘、培養細胞等，但不限於此。此外，本領域的技術人員可從提取自待測試水稻的染色體DNAs製備DNAs。例如，在優選的方法中，稻種可在鹼性水溶液中破裂，然後可從破裂的種子提取基因組DNAs；然而，該方法不限於此。上文中，種子優選是精選加工的白米(polished)。
在這些方法中，隨後擴增包括上述任何(1)-(28)所描述位置的核苷酸，或組成互補鏈上該位置的上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA。在此，用於擴增DNA的方法可以是PCR，但不限於此，只要能夠使DNA擴增。
在本方法中，隨後確定所擴增DNA的核苷酸序列。核苷酸序列可通過本領域技術人員公知的常規方法來確定。
在這些方法中，隨後將確定的核苷酸序列與對照的核苷酸序列相比較。在此，對照通常是Nipponbare，其由SEQ ID NO1-NO28中所描述的序列表示。備選地，本領域的技術人員可從多種基因資料庫、參考文獻等獲得野生型Nipponbare基因組的核苷酸序列信息。在該方法中，通過與對照比較來確定待測試水稻基因組中存在或缺乏多態性。
本發明的用於鑑別水稻品種的方法可通過多種用於檢測多態性的方法進行，而不是如上所述直接確定來源於待測試水稻的DNA的核苷酸序列。例如，本發明用於鑑別水稻品種的方法可利用下列方法進行首先，從待測試水稻製備DNAs。然後用限制性內切酶消化所製備的DNA。然後按大小分離DNA片段，並且與對照比較所檢測片段的大小。在備選的實施方案中，首先從待測試水稻製備DNAs。然後擴增包括上述任何(1)-(28)所描述位置的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA。然後用限制性內切酶消化擴增的DNA。然後按大小分離DNA片段，並且與對照比較所檢測DNA片段的大小。
這種方法的實例是利用RFLP(限制性內切酶酶切片段長度多態性)、PCR-RFLP等的方法。具體地，如果突變存在於限制性內切酶識別位點，或如果通過限制性內切酶處理產生的DNA片段包括鹼基插入或缺失，則由限制性內切酶處理所產生片段的大小將不同於對照片段的大小。包括這種突變的區域可通過PCR擴增，並用相應的限制性內切酶處理以通過電泳後條帶遷移率的差異來檢測突變。備選地，染色體DNA可用這種限制性內切酶處理，通過電泳分離，然後可利用本發明的寡核苷酸進行Southern印跡以檢測突變的存在或缺乏。本領域的技術人員可根據突變適當地選擇限制性內切酶。
此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs。然後擴增包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈上上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA。然後將擴增的DNA離解成單鏈。在非變性的凝膠上分離離解的單鏈DNA。將凝膠上分離的單鏈DNA的遷移率與對照的遷移率比較。
上述方法的實例是PCR-SSCP(單鏈構象多態性)(染色體11上不確定Alu重複的克隆和聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性分析，基因組Genomics 12(1)139-146(1992，1月1日)；通過聚合酶鏈式反應產物的單鏈構象多態性分析檢測人腦瘤中p53基因的突變，癌基因Oncogene 6(8)1313-1318(1991，8月1日)；標記後基於多重螢光的PCR-SSCP分析，PCR方法應用PCRMethods Appl.4(5)275-282(1995，4月1日))。由於例如相對減少操作和需要少量樣品的優點，這些方法特別適於篩選大量的DNA樣品。該方法的原理如下當雙鏈DNA片段離解成單鏈，每個鏈根據其核苷酸序列產生獨特的構象。因此，當離解的DNA鏈通過電泳在非變性的聚丙烯醯胺凝膠上分離時，相同長度的互補的單鏈DNAs根據其各自構象的差異遷移到不同的位置。單個核苷酸的取代可改變單鏈DNA的構象，導致在聚丙烯醯胺凝膠上電泳期間的不同遷移率。因此，DNA片段中存在例如點突變、缺失和插入的突變，可通過檢測遷移率的變換而測定。
具體地，首先通過PCR等擴增包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈上上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA。通常，用於擴增的區域優選是大約200bp-400bp長度。本領域的技術人員可通過適當地選擇反應條件等進行PCR。擴增的DNA產物可在PCR期間利用例如32P的同位素，或螢光染料、生物素等標記的引物來標記。備選地，擴增的DNA產物可通過進行PCR來標記，其中已經將用例如32P的同位素，或螢光染料、生物素等標記的核苷酸底物加入到PCR混合物中。此外，擴增的DNA片段可在PCR後，利用附著用例如32p的同位素，或螢光染料、生物素等標記的核苷酸底物的Klenow酶等來標記。所得到的標記的DNA片段經例如加熱而變性，並且在沒有例如尿素的變性劑的聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。用於分離DNA片段的條件可通過將合適量的甘油(大約5-10％)加入聚丙烯醯胺凝膠而改進。用於電泳的條件可根據各個DNA片段的特性而不同；通常電泳在室溫下(20-25℃)進行。如果不能達到所需要的分離，可測試4和30℃之間針對最適遷移率的溫度。電泳後，檢測DNA片段的遷移率並且利用X光膠片經放射自顯影分析，或在用於螢光檢測的掃描儀上掃描等分析。當檢測到不同遷移率的條帶，直接從凝膠切下條帶，利用PCR再擴增，並且經直接測序以證實突變的存在。此外，如果不利用標記的DNAs，條帶可在具有溴化乙錠的電泳後通過用銀染等染色凝膠而檢測。
此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs(步驟(a))。其次，合成2個不同的探針，其中寡核苷酸與接近包括任何上述(1)-(28)所描述的核苷酸序列，或接近組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA的核苷酸序列是互補的，其用螢光報告劑和螢光淬滅劑標記(步驟(b))。然後(步驟(c))，將步驟((a))中製備的DNA與步驟(b)中合成的探針雜交。然後擴增包括任何上述(1)-(28)中所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA(步驟(d))，並且檢測報告螢光發射(步驟(e))。然後(步驟(f))，將步驟(e)中檢測的螢光報告發射與對照的螢光報告發射比較。
這種方法的實例是TaqMan PCR(SNP基因多態性中的策略，KennichiMatsubara和Yoshiyuki Sakaki，Nakayama-Shoten，第94-105頁；Genet.Anal.14143-149(1999))。具體地，探針的5′-末端首先用螢光報告劑標記。在此，螢光報告劑包括FAM和VIC，但不限於此。此外，上述探針的3′-末端用螢光淬滅劑標記。在此，螢光淬滅劑可以是能淬滅螢光報告劑的任何物質。然後，將用螢光報告劑和螢光淬滅劑標記的探針與製備的DNA雜交。雜交通常在嚴謹條件下進行。嚴謹條件是，例如通常為42℃，2×SSC和0.1％SDS，優選為50℃，2×SSC和0.1％SDS，以及更優選為65℃，0.1×SSC和0.1％SDS，但不限於此。許多因素，例如溫度和鹽濃度可影響雜交的嚴謹度，並且本領域的技術人員可通過適當地選擇上述因素而達到最適的嚴謹度。
利用包括5′-核酸酶活性的DNA聚合酶擴增包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA。因此消化用螢光報告劑和螢光淬滅劑標記的探針的螢光報告劑標記的部分，並且釋放螢光報告劑。在此，具有5′-核酸酶活性的DNA聚合酶優選是Taq DNA聚合酶，但不限於此。在本方法中，然後檢測釋放的螢光報告劑，將螢光報告劑的發射與對照的發射比較。
此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs(步驟(a))。然後合成探針，其中將與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸序列，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的3′-側核苷酸序列互補的序列與無關的序列結合(步驟(b))。然後合成另一個探針，其與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸序列，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的5′-側區域互補(步驟(c))。然後(步驟(d))，將步驟(c)中合成的探針與步驟(a)中製備的DNA雜交。然後將步驟(d)中雜交的DNA用單鏈DNA切割酶消化，釋放出步驟(b)中合成的探針部分(步驟(e))。在此，單鏈DNA切割酶不是具體限制的；例如，可如下所述使用切割酶。在本方法中，然後將步驟(e)中釋放的探針與(步驟(f))中的檢測探針雜交。然後(步驟(g))，酶促消化步驟(f)中的雜交DNA，並測量由此發射的螢光強度(步驟(g))。然後(步驟(h))，將步驟(g)中測量的螢光強度與對照的螢光強度比較。
上述方法的實例是Invader方法(SNP基因多態性中的策略。KennichiMatsubara和Yoshiyuki Sakaki.Nakayama-Shoten，第94-105頁；基因組研究Genome Research 10330-343(2000))。具體地，首先合成探針(探針A)，其與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸序列，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的3′-側區域中的模板互補，並且包括與5′-側區域的模板(側翼(flap))無關的序列。其次，合成探針(探針B)，其包括與上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸序列，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的5′-側區域中模板互補的序列。在探針B中，相應於上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的核苷酸，可以是任何種屬。然後，將探針與製備的模板DNA雜交。相應於上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸序列，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的，探針B中的核苷酸隨後產生包括由於侵入而處於5′-末端側翼的區域。因此，雜交的DNA用識別包括側翼的區域，並且在相應核苷酸的3′-側切下探針A的核酸內切酶(切割酶)消化。從而釋放側翼。然後將所釋放的側翼與檢測探針雜交。檢測探針通常稱為螢光共振能量傳遞(FRET)探針。探針具有可形成互補結合的5′-區域，並且3′-區域與側翼互補。在可與其本身互補的5′-區域內，其5′-末端和3′-側分別用螢光報告劑和螢光淬滅劑標記。雜交中，釋放側翼的3′-末端的核苷酸侵入用螢光報告劑標記的FRET探針的互補結合位點，並且產生受切割酶識別的結構。在此，檢測通過利用切割酶消化用螢光報告劑標記的區域而釋放的螢光報告劑，並且將所測量的螢光強度與對照的螢光強度比較。
此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs(步驟(a))。然後擴增包括上述任何(1)-(28)所描寫的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA(步驟(b))。然後離解擴增的DNA成為單鏈(步驟(c))。其次(步驟(d))，只分離離解單鏈DNAs的一個鏈。然後從接近於上述任何(1)-(28)中所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸進行單個核苷酸的延伸反應；酶促發光表明由此產生的焦磷酸；並且測量發光的強度(步驟(e))。然後將步驟(e)中測量的螢光強度與對照的螢光強度比較(步驟(f))。這種方法的實例是Pyrosequencing方法(Anal.Biochem.10103-110(2000))。
此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs(步驟(a))。然後擴增包括上述任何(1)-(28)中所描寫的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA(步驟(b))。然後合成引物，其與直到上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈上述核苷酸鹼基對的核苷酸緊接的核苷酸互補(步驟(c))。然後(步驟(d))，在存在螢光標記的核苷酸時，利用步驟(b)中擴增的DNA作為模板，用步驟(c)中合成的引物進行單個核苷酸的延伸反應。然後，測量螢光偏振(步驟(e))。然後將步驟(e)中測量的螢光偏振與對照的螢光偏振比較(步驟(f))。這種方法的實例是AcycloPrime方法(基因組研究GenomeResearch 9492-498(1999))。
AcycloPrime方法使用一對用於擴增基因組的引物，和用於檢測SNPs的單個引物。首先，通過PCR擴增包含SNPs的基因組區域。該步驟按照標準的基因組PCR進行。其次，擴增的PCR產物與用於檢測多態性的引物退火，並且進行延伸反應。設計用於檢測多態性的引物與鄰近於靶多態性位點的區域退火。通常，用於延伸反應的核苷酸底物是用其3′-OH封閉的螢光染料(終止劑)標記的核苷酸衍生物。因此，延伸在結合上互補於多態性位點核苷酸的單個核苷酸時終止。核苷酸衍生物結合到引物中可根據由於分子量增加而增加螢光偏振(FP)來檢測。通過利用2個包括獨特波長的不同FP染料標記可在2個核苷酸之間鑑別特定多態性位點的核苷酸。由於螢光偏振的水平是可定量的，就有可能通過進行單個分析而確定靶等位基因是否是同源或異源的。本發明的方法中上述步驟(A)可優選地通過AcycloPrime方法進行。
本領域的技術人員可根據基因組序列和多態性位點的信息，適當地製備用於基因組擴增的引物和在AcycloPrime方法中用於檢測多態性的引物。在本發明利用AcycloPrime方法鑑別水稻品種的方法中使用的，用於基因組擴增的引物和用於檢測多態性的引物的實例顯示在表8和9中，但其不限於此。
表8

表9

此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs(步驟(a))。然後擴增包括上述任何(1)-(28)中所描寫的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA(步驟(b))。然後合成引物，其與覆蓋上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸緊接的核苷酸序列互補(步驟(c))。然後(步驟(d))，在存在螢光標記的核苷酸時，利用步驟(b)中擴增的DNA作為模板，用步驟(c)中合成的引物進行單個核苷酸的延伸反應。然後(步驟(e))，利用測序儀確定步驟(d)的反應中所使用的核苷酸。然後將步驟(e)中確定的核苷酸序列與對照相比較(步驟(f))。這種方法的實例是SNuPe方法(Rapid Commun.Mass Spectrom.14950-959(2000))。
此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs(步驟(a))。然後擴增包括上述任何(1)-(28)中所描寫的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA(步驟(b))。然後利用質譜儀測量步驟(b)中擴增的DNA的分子量(步驟(c))。然後將步驟(c)中獲得的分子量與對照的分子量比較(步驟(d))。這種方法的實例是MALDI-TOF MS方法(Trends Biotechnol.1877-84(2000))。
此外，在另一個方法中，首先從待測試水稻製備DNAs(步驟(a))。然後擴增包括上述任何(1)-(28)所描寫的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA(步驟(b))。然後提供其上固定核苷酸探針的基底(步驟(c))。
在此，″基底(substratum)″指能夠固定核苷酸的平面物質。在本發明中，核苷酸包括寡核苷酸和多核苷酸。本發明的基底不限於任何具體的基底，只要其容許核苷酸固定，但是一般可合適地使用用於DNA晶片技術的基底。DNA晶片通常是由成千上萬以高密度列印在基底上的核苷酸組成的。通常，DNAs列印在基底的無孔表面上。通常，基底的表面是玻璃，但是也可使用例如硝化纖維素膜的多孔膜。
在本發明中，用於固定核苷酸(晶片)的方法的實例是由Affymetrix開發的主要由寡核苷酸組成的晶片。在這樣的寡核苷酸晶片中，寡核苷酸通常是原位合成的。例如，利用光刻(photolithographic)技術(Affymetrix)原位合成寡核苷酸和固定化合物(Rosetta Inpharmatics)的噴墨方法是已知的，並且可使用任何技術構建本發明的基底。
固定在基底上的核苷酸探針不限於任何具體的探針，只要其提供檢測上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的單核苷酸多態性。因此，該探針可以是例如能夠與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA特異雜交的探針。該核苷酸探針可以不與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA完全互補，只要該雜交是特異的。在本發明中，當寡核苷酸被固定，固定在基底上的核苷酸探針的長度通常是10-100鹼基，優選為10-50鹼基，以及更優選為15-25鹼基。
在本方法中，然後將步驟(b)中的DNA與步驟(c)的基底接觸(步驟(d))。該步驟容許DNA與上述核苷酸探針雜交。用於雜交的溶液和條件可根據許多因素而改變，包括固定在基底上的核苷酸探針的長度，但是雜交通常利用本領域技術人員普遍已知的方法進行。
在本方法中，隨後檢測DNA與固定在基底上的核苷酸探針之間的雜交強度(步驟(e))。該檢測可通過例如在掃描儀上掃描螢光信號而進行。在DNA微陣列中，固定在載片上的DNA通稱為探針，而溶液中的標記DNA被稱為靶。因此，在本說明書中，上述固定在基底上的核苷酸被描述為核苷酸探針。在本方法中，然後將步驟(e)中檢測的強度與對照的強度比較(步驟(f))。
這種方法的實例是利用DNA晶片的方法(SNP基因多態性中的策略.Kennichi Matsubara和Yoshiyuki Sakaki.Nakayama-Shoten第128-135頁；自然遺傳學Nature Genetics 22164-167(1999))。
除上述方法外，可使用特異於等位基因的寡核苷酸(ASO)雜交檢測只在特定位置的突變。製備包括其中被認為應當存在的突變的核苷酸序列的寡核苷酸，並且用於與DNA雜交。如果存在突變，雜交形成的效率會降低。這種變化可通過例如Southern印跡的方法，或利用雜交物內由於插入缺口染色體而淬滅的特異螢光試劑的特性的方法等來檢測。
此外，本發明提供用於鑑別水稻品種的引物的寡核苷酸，用於擴增包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA區域。可以設計這種寡核苷酸的實例以使得其覆蓋上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的寡核苷酸。可通過本領域技術人員普遍已知的方法設計併合成PCR引物。PCR引物不受長度限制，並且通常是15-100bp，以及優選為17-30bp。本發明也提供寡核苷酸，其包括與覆蓋上述任何(1)-(28)中所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸緊接的核苷酸的序列互補的核苷酸序列。這種寡核苷酸對於用作本發明方法的引物是有用的，例如可用於通過AcycloPrime方法來鑑別水稻品種。這種寡核苷酸的實例顯示在表8或9中。
此外，本發明提供用於鑑別水稻品種方法的，包括至少15個核苷酸的寡核苷酸，其可與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA區域雜交。該寡核苷酸可例如用作探針。
這種寡核苷酸可與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA區域特異雜交。在此，特異地雜交指該寡核苷酸不與其他的DNAs在標準的雜交條件下，以及優選在嚴謹條件下產生顯著量的交叉雜交(例如，在Sambrook等人，分子克隆Molecular Cloning.冷泉港實驗室出版社，紐約，美國第二版，(1989)中所描述的條件)。只要雜交是特異的，寡核苷酸不需要與包括上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸的DNA完全互補。不限制寡核苷酸的長度，只要其是15個核苷酸或更長的。這種寡核苷酸可利用例如商品化的寡核苷酸合成儀製備。備選地，它們可作為通過限制性內切酶處理等獲得的雙鏈DNA片段來製備。
此外，所使用的寡核苷酸優選是適當標記的。用於標記的方法可包括其中寡核苷酸的5′-末端通過用T4多核苷酸激酶磷酸化而用32P標記的方法，其中用例如32P的同位素、螢光染料、生物素等標記的核苷酸底物利用例如隨機六聚體寡核苷酸的引物和例如Klenow酶的DNA聚合酶(隨機引物法)結合到寡核苷酸中的方法。此外，本發明也包括根據上述任何(1′)-(28′)，在上述任何(1)-(28)所描述的核苷酸，或組成互補鏈中上述核苷酸鹼基對的核苷酸中，包含多態性突變的15個核苷酸或更長的寡核苷酸。
此外，本發明提供包括本發明的上述寡核苷酸，用於鑑別水稻品種的試劑盒。本發明的試劑盒可進一步包含鹼性水溶液。該試劑盒也可與用作對照的標準水稻樣品、描述使用該試劑盒的方法的說明書等一起包裝。
附圖簡述圖1顯示SEQ ID NO1的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖2顯示SEQ ID NO2的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖3顯示SEQ ID NO3的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖4顯示SEQ ID NO4的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖5顯示SEQ ID NO5的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖6顯示SEQ ID NO6的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖7顯示SEQ ID NO7的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖8顯示SEQ ID NO8的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖9顯示SEQ ID NO9的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖10顯示SEQ ID NO10的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖11顯示SEQ ID NO11的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖12顯示SEQ ID NO12的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖13顯示SEQ ID NO13的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖14顯示SEQ ID NO14的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖15顯示SEQ ID NO15的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖16顯示SEQ ID NO16的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖17顯示SEQ ID NO17的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖18顯示SEQ ID NO18的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖19顯示SEQ ID NO19的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖20顯示SEQ ID NO20的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖21顯示SEQ ID NO21的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖22顯示SEQ ID NO22的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖23顯示SEQ ID NO23的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖24顯示SEQ ID NO24的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖25顯示SEQ ID NO25的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖26顯示SEQ ID NO26的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖27顯示SEQ ID NO27的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖28顯示SEQ ID NO28的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖29顯示SEQ ID NO29的核苷酸序列，其表明24個水稻品種之間的多態性位點，以及用於擴增包括該位點的DNA區域的引物序列。
圖30顯示表示使用從精白米提取的DNA作為模板進行PCR的結果的照片。該精白米樣品是商品化的水稻，稱為″平成12年(2000年)在茨城縣生產的Akitakomachi″「Akitakomachi Produced in Zbaraki Prefecture in Heisei12)。用於PCR的引物是PGC1001(U5′-accgggtagggaaacaaaac-3′/SEQ ID NO113；L5′-aataatacttcggcgcatcg-3′/SEQ ID NO114)。利用通過下列方法提取的DNA作為模板來進行PCR，並且通過在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳來分離反應混合物。
M分子量標記(_X/HaeIII)；1方法1(CTAB)；2方法2(鹼+CTAB)；3方法3(簡單提取法)；4方法4(簡單提取法+酚:氯仿處理)；5方法5(鹼+簡單提取法)；6方法6(鹼+簡單提取法+酚:氯仿處理)；7對照(由CTAB從Habataki的綠葉提取的DNA，40ng)；和8對照(由CTAB從Sasanishiki的綠葉提取的DNA，40ng)。
實現本發明的最佳方式本發明將參考實施例在下文進行詳細說明，但不應認為只限於此。
單核苷酸多態性的檢測(SNPs)利用在水稻基因組研究項目主頁上(http//rgp.dna.affrc.go.jp/)公眾可得到的關於水稻染色體組分析的信息，和在DDBJ(http//www.ddbj.nig.ac.jp/)中註冊的水稻基因組序列來設計用於擴增水稻基因組DNA的800bp-1kbp的引物。不被預測包含基因的區域主要用於公眾可得到的水稻基因組核苷酸序列的染色體區域，和RFLP標記探針序列等用於除此之外的區域。使用引物設計支持站點，Primer3(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)設計引物。
利用所設計的引物，首先利用Ampli Taq Gold(應用生物系統AppliedBiosystems)和通過簡單方法從水稻品種Nipponbare、Koshihikari、Kasalath、Guang-lu-ai 4(下文為G4)，Kitaake和野生稻(普通野生稻，W1943)提取的DNA作為模板進行PCR擴增。為了證實所擴增的片段，通過在瓊脂糖凝膠上電泳分離反應混合物部分。餘下的反應混合物用ExoSAP-IT(AmershamBiosciences)處理以除去未反應的引物和dNTPs，然後作為模板接受測序反應。將用於第一個擴增的一個起始引物再次加入模板，並且利用MegaBACE的DYEnamic ET染料終止劑循環測序試劑盒(Amersham Biosciences)通過進行循環測序反應製備用於測序的樣品。利用MegaBACE 1000 DNA測序系統(分子動力學Molecular Dynamics)進行測序。在品種之間比較所獲得的序列數據以搜尋單核苷酸取代的多態性。用各個引物對每個品種至少進行兩次測序，並且只有某些情況被認為是多態性的。
在Nipponbare和Koshihikari，以及Nipponbare和Kitaake之間顯示單核苷酸多態性的位點，進一步通過類似地進行PCR和利用通過簡單方法從Nipponbare、Hatsushimo、Mutsuhomare、Yukinosei、Kirara 397、Tsugaruroman、Gohyakumangoku、Morinokumasan、Yumeakari、Hanaechizen、Koshihikari、Tsukinohikari、Akitakomachi、Asanohikari、Aichinokaori、Matsuribare、Hinohikari、Yumetsukushi、Hitomebore、Manamusume、Fusaotome、Dontokoi、Kinuhikari和Sasanishiki提取的基因組DNA作為模板進行測序，並且比較每個品種的多態性位點的核苷酸序列來進行檢驗。圖1-28顯示存在於上述24個水稻品種之間的多態性。根據下列規則顯示多態性數據[數據規則的說明](1)引物位點由方括弧標明，而上遊引物位點和下遊引物位點分別標記為″p:″和″q:″。
實例actctactta a[p:gcagagcga tgaacctgca]atattgagaa aactc[q:aatcacgcccatccttgcct](2)SNP位置由方括弧和標識號顯示。
實例cg[1a]agag[2aa]cttc[3a[4c4]cattt gggg[5c5]acac3]c註解通常，標識號附於方括弧的首尾；然而，標識號可從對比明顯的較後方括弧省略掉。
(3)分析的品種由下列附於序列的代碼表明。品種代碼由″/″分開。
實例nhb/ksh/kal/gla/pwl/kta[品種代碼]每個上述水稻品種通過使用3個字母表字母的縮寫表示。例如，Nipponbare和Koshihikari分別是″nhb″和″ksh″。
(4)品種代碼後面有SNP數據，顯示為″標識號，品種代碼SNP″。
實例1 ksh:g[其他的實施例](5)缺失以″-″表示。不考慮缺失核苷酸的數目，只使用一個″-″。
實例g[5agg]ggtcat ctgttacatt atag5kal:-(6)其中存在於相同位置但長度不同的缺失取決於品種實例gtttg[20a:gtat[20b:t ccattatgta ttatttcatt tgct20b]t20a]ttatg
20akal:-，20bgla:-既然缺失存在於相同位置，則使用相同的標識號。然而，缺失長度的差異由字母表字母的差異而闡明，例如″20a:″和″20b:″。
(7)對於插入，將″-″插入公開的序列。使用單個″-″。
實例tacaca[7-]gtca attttattca7kal:aa其次，設計用於對鑑別品種有用的SNPs，可檢測該SNPs的引物，並且利用AcycloPrime-FP試劑盒(Perkin Elmer)進行單個核苷酸終止劑反應以製備用於基因型鑑定的樣品。通過用ARVO(Perkin Elmer)測量螢光偏振來進行基因型鑑定。
通過測序顯示在那些位置產生的標記是SNPs的結果，在品種間顯示出獨特的模式，並且可組合用於品種分類(表2-7)。表8和9顯示產生SNP標記的數據，例如引物序列和所使用的SNP位點。
用於從精白米、糙米和米飯(cooked rice)提取DNA的方法的檢驗檢驗從精米、糙米和米飯提取DNA的方法。首先，將精米、糙米和米飯的單個穀粒放入2ml管(Eppendorf)中，並且向此加入0.4ml的提取緩衝液(1MKCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1N NaOH)和3mm直徑的氧化鋯球。試管蓋上其蓋子後在4℃靜置30分鐘。該穀粒使用Retch裂解混合器碾磨MM300進行2輪的300Hz破裂2分鐘，並且獲得乳狀溶液。該溶液在10,000rpm離心10分鐘，並將所得到的上清液(0.3ml)轉入新鮮的試管。加入0.3ml異丙醇後，充分混合溶液並且在10,000rpm再次離心10分鐘。丟棄上清液，將1ml的70％乙醇加入沉澱中，然後在10,000rpm離心3分鐘。丟棄上清液，乾燥沉澱顆粒，再溶於30μl的無菌水中(方法5)。
備選地，將方法5中的上清液(0.3ml)轉入新鮮試管後，加入0.3ml的酚∶氯仿(1∶1)，充分混合該溶液並且在10,000rpm離心10分鐘。然後將上清液轉入新鮮的試管，並且用異丙醇處理沉澱(方法6)。
備選地，將用於方法5和6的提取緩衝液的組合物變化為1M KCl，10mMTris-HCl和1mM EDTA(分別為方法3和4)。
在其它備選的方法中，使用CTAB提取法。具體地，將精白米穀粒(kernel)和0.2ml CTAB緩衝液(方法1)，或0.2ml 0.1N的NaOH(方法2)放入2ml的試管，並且向此加入直徑為3mm的氧化鋯球。將試管頂部封閉，在與方法5相同的條件下破裂穀粒。然後加入0.7ml的CTAB緩衝液，在56℃加熱20分鐘。向該溶液加入640μl的酚∶氯仿(1∶1)，然後混合，並且在10,000rpm離心10分鐘。將上清液(0.7ml)轉入新鮮的試管，並且加入1.3ml的CTAB沉澱緩衝液。然後在10,000rpm離心10分鐘。通過加入包含RNA酶的0.5ml 1N NaCl溶解沉澱顆粒，然後加入1ml乙醇，並且在10,000rpm離心10分鐘。沉澱顆粒用1ml70％乙醇洗滌，乾燥，並且溶於30μl的無菌水。
通過上述方法獲得的DNAs可用作PCR的模板，其中使用引物PGC1001(U5′-accgggtagggaaacaaaac-3′/SEQ ID NO113；L5′-aataatacttcggcgcatcg-3′/SEQ ID NO114)。
這些結果顯示在圖30中。雖然利用通過方法1或2從精白米提取的DNA沒有獲得擴增產物，但用通過方法3-6提取的DNA觀察到好的擴增。據此表明當提取的DNA來自精白米時，酚:氯仿處理是不必要的，並且因此方法3或5是最簡單的方法。方法3和5之間的差異存在於用於破裂穀粒的緩衝液中，其中方法5中的是鹼性的。鹼性緩衝液是有利的，因為其使精白米組織迅速脆化，並且輕易地實現充分破裂。因此，選擇方法5作為最簡單和最有效的方法。
對於糙米和米飯，不能從由方法1和2提取的DNA獲得擴增產物，而對於方法3-6可觀察到擴增。對於由方法6提取的DNA觀察到最好的擴增。因此，利用鹼性緩衝液和酚:氯仿處理的方法顯示對於提取自糙米或米飯(cooked rice)的DNA是最有效的。
鑑別精白米的品種購買標明為″平成(Heisei)12年(2000年)在茨城縣(Ibaraki)生產的100％的Akitakomachi″的商品化精白米。隨機選擇32個穀粒，並且利用方法5分別從每一單個穀粒提取DNA。利用提取的DNAs作為模板，和足夠從另外25個水稻品種鑑別Akitakomachi所必需的3個標記(S0115、S0146和S0178)的引物進行PCR。此外，利用PCR產物作為模板進行AcycloPrime反應，並且確定單核苷酸的多態性。
結果是，27個穀粒確定為Akitakomachi，但是3個穀粒結果是除Akitakomachi外的品種。這些穀粒中的2個沒有鑑別出來，因為3個標記中的一個沒有給出結果。根據其模式，確定不是Akitakomachi的3個穀粒估計可能是Kirara 397、Koshihikari、Yumetsukushi或Kinuhikari。
上述結果證實本發明可用於鑑別精白米的品種。
精白米品種的鑑別為了確定實施例3中確定不是Akitakomachi，並且可能是Kirara 397、Koshihikari、Yumetsukushi或Kinuhikari的3個穀粒的品種，利用提取的DNAs作為模板和足夠鑑別3個品種所需要的2個標記(S0015，S0045)的引物進行PCR。此外，利用PCR產物作為模板進行AcycloPrime反應，並且確定單核苷酸的多態性。
結果顯示所有的3個穀粒具有如Koshihikari的相同模式。因此，推測實施例3中使用的精白米很可能除Akitakomachi外包含Koshihikari。
精白米的混合比例的檢驗檢查據稱為″Kirara 397，30％；Tsugaruroman，40％；Hitomebore，30％″的精白米以確定3個品種是否如所標明的進行混合。從該精白米中隨機選擇32個穀粒，並且利用方法5分別從每個穀粒提取DNA。利用提取的DNAs作為模板，以及足夠從26個可鑑別的水稻品種中鑑別Kirara 397、Tsugaruroman和Hitomebore所必需的7個標記(S0115、S0135、S0161、S0252、S0310、S0336和S0375)的引物進行PCR。此外，利用PCR產物作為模板進行AcycloPrime反應，並且確定單核苷酸的多態性。
結果表明7個穀粒來自於Kirara 397，11個來自於Tsugaruroman，並且5個來自於Hitomebore，然而2個穀粒不來自於任何這3個品種。另7個穀粒是不確定的，因為7個標記中的一些沒有提供數據。根據基於25個收集數據的穀粒的3個品種的比率，所檢驗精白米的混合比例推測為Kirara 397，28％；Tsugaruroman，44％；以及Hitomebore，20％；其他品種為4％。
工業實用性本發明提供用於鑑別水稻品種的方法。基於其栽培特性的，用於鑑別品種的傳統方法需要有經驗種植者的目測，並且因此進行簡單區別是很困難的。此外，不能鑑別每個米粒的品種。相比之下，本發明的方法在水稻基因組中檢驗多態性，並且因此能夠利用極少量的水稻樣品精確地鑑別品種。此外，可應用本發明的方法精確地鑑別近緣的品種。
序列表110株式會社植物基因組研究中心(Plant Genome Center)120用於鑑別水稻品種的方法130P2-A0202P140
141
150JP 2002-1688751512002-06-10160114170PatentIn Ver.2.12101211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異(variation)222(309)223/栽培品種(cultivar)＝″ksh，krr，tgr，mnk，yma，tkh，akk，mtb，hit，mmm，fom，don，或ssk″/注＝″用″t″置換″c″″220
221變異222(438)223/栽培品種＝″ksh，krr，tgr，mnk，yma，tkh，akk，mtb，hit，mmm，fom，don，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(593)223/栽培品種＝″ksh，krr，tgr，mnk，yma，tkh，akk，mtb，hit，mmm，fom，don，或ssk″/注＝″用″t″置換″c″″
4001tattcttcac gtgattcagc gaagataaca ctctttaaac actgcaattg ccactggaag 60aattagcacg aatttgagat gttttttcac cggaagataa gttcataact aaggtgtttc 120ttcgtttcaa caaacaagat ataaagttca accagatttt acatttttga aaacctttta 180tctttacata tatcagtggt ggagttgaaa tgggagatac atcaactcta aattagagaa 240atttttagga tacaactaaa caagtttaac caaatttccc ttgtcctaaa cagcaaatga 300ttcagtgaca cattgggttg atttagcgac ttcaaaccta ttgtcttctt tttcattttt 360caaatttcta gctctacaac taattcaatg actactcagt ttaaaacaaa acaaatggaa 420gattggttgg gagatttaag aagaaacttg ccaggtggtg gcttggtccg tggaggaaag 480agggctcagg ggctaaccac ctcgcaactt agggctctgg cctccgtctc ccgccttttc 540gccgagagcc cgcaaggtga cagagtgcgg cgaggtcgac acttcggccg ttcggggtcg 600ccgcgtcggg cgtccgggcg gcgtcgtggt tcgggggact gagggcagct actcagctag 660accgctggag cccaaaggaa tctaaggtta catgctgtct tgttgagcct attttatggg 720cctgcgactt tgcagttagc cgaggcatat tggaataaat ttaatttagg tctctcaatt 780tgtcgtcgag cctgaaattc atcactggac cgcaaaacta gatacatcgc attccccaac 840ttagttaagg tagcagtggt ggtgggcagc cagcgaggag ggccgtggtg gtccgtgatg 9002102211960212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(304)223/栽培品種＝″yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″t″置換″a″″4002tttaacttta ttgttagtat tagtactagc tctggttgtc tatcactctg ctgcctctgc 60acatactgat ctagaacaca catgttctct acttctctgc agtcactgct actgacatgt 120gggccctact ctctttgggc cagcatgtca gtgtcagcag aggatctcat tcctacagtc 180aatccatgtg tgctactccg ttaaaaaaac gaattccaag ctacaaacct aaacacgttt 240ttttggacgg aggggtatat ataaacaaag aaaaagcact gtaggtacat aatatagtac 300tagatcagtc ttattacagc tgttcaaaaa cagttcagta tatagtgaat ctagttggtc 360tgttgctact gcagttaatt ggctctggtt gcttttgttg atctgttgct actgcagtta 420attagctccg gttgcttagt tgatcaagtt aattagctct ggctgtgccc taatcaaaat 480tcatatatag tagcttcaag cacgacatac cacctttcct accttctggt ggatactcct 540ctcttttata atttctgcag taagcttgaa acataagtag acactgccat taattaaaca 600agcacagtga attaacccag atatgtgtaa tctgcatact aattaaatta ggttcgtgcc 660agttcaaggc agccacaacc acatacaggc gatccatata ttgatttata tatctgatcc 720
gtttgttgag gttggtgcat caatcccccc tgaagcagct atgtcgagcc taattgcgat 780ttgattaatc aatttttctc atccaacgat ttaattatgc gtgattttaa tgattcgatc 840ggtacagttt tttttctctt tcttcagtgc tagtgcttct actagtattc gtgacaataa 900cctgtcggat ttggaatata tgattgctga tgtggtgtcg tttttattaa caagcccttg 9602103211840212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(201)223/栽培品種＝″ksh，hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″t″置換″a″″220
221變異222(356)223/栽培品種＝″ksh，hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(450)223/栽培品種＝″ksh，hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″a″置換″g″″220
221變異222(514)223/栽培品種＝″ksh，hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″t″置換″c″″220
221變異222(515)223/栽培品種＝″ksh，hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(552)223/栽培品種＝″ksh，hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″t″置換″c″″220
221變異222(695)223/caltivar＝″ksh，hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″4003tagcattagg ataaaagggg cgctccttca aaactttaaa atatcaaaga acaccctttt 60gagattgaat tgcttcttct ggtctttgcc tcttctttcg cttttcagca ccagaatcgt 120acttcctatt tctagctgac ataatgagga ttgaggaaat aagtgtcttc ctatttcata 180aacaaaagaa aagtaatttg agtcaaacag tcacatcact atttaagttt tgattcaatc 240gatagtttga ttcatattac atctactatt tgatacgaga ctcaatgtct caactcttaa 300gtctaaaagt aactttccaa tgctgcacaa aggtagtagt cagggacacg aagataagtg 360gatgagaggc actgacaaag gtagccggcc aaccgcttgg cattgatggc gcttgcccgt 420tggtcgctcg ctgcctcgtg ttgggctggg gtcgggactt tgcaggcatc gtcatttcat 480cgtcgaattt gaaatcgaga ttgactccag tcacacgaca tgactacaca acagtgtgac 540ttgatctcgt tcgcctctca gcctccaatg cacctgatgg cagatgggcc tctctaatcg 600attcacaggt agaagcagga ttgtggctcg gctatgcatt aatgtgcgcc tctccgatta 660acttgggtgc cccaaaaaaa ttgggggaca ctctatcatc gccaatgtcg cacacaacct 720tcgacaggct tgcccattag tgtgacactc ctgcccacat cactgctcca ttgtcatcca 780tcaccttgtc gaccattgtg gtgtgccaaa ccgcggctgt cgtctgtttg tgattttgta 8402104211960212DNA213稻(Oryza sativa)
220
221變異222(377)223/栽培品種＝″ksh，ymt，don，或knh″/注＝″用″c″置換″t″″4004tccaaaatcc acatgcaatg tgccattcca taggaatttc atgggatttg aaaatcgtca 60atcctttgaa tcaaatggcc aaataggaaa atttcgtata ggatttgaat cctatgaaaa 120tcctatataa atcctttgat tcaaagggcc ctaagtttcg tacgtgtgca actgtgcatc 180cagcacgtac tactacgtac tcctatgtac ttgtagtggt gtagcctata catatgcatg 240aagcgttcca ggaaaaatag gagtctcagt aatttgtgca ggcatgcggc ccatggagta 300atagaccatg ctgaataatt tcagttcaaa tttcatactc caactgtaat accatacgca 360aaccatcaac ttacaatact gatatacttg acatttcaaa ataacatagc ctttggtttt 420agctgacgta gcgactgagt aagctagcac gaggctcata tgggtcccac atgtcagcgg 480cccaatcttc ttccacatct ctcctctctt cccaatccta atctctctcc atgcctctag 540ggtggtgggg gtgggaagaa gctcgacagc ggtggccaac acatacgcaa ggagaagctc 600gaggactgca agacgacttt cttttcgcct accactggaa ggcaacacct tgtttccctg 660ccttctagtt gagcgaggac actgaatgca tggaggtgtt gtgacccaaa tctacggcag 720aatccctcgc cggaagttcg ccggagatct agcagagaag aggcgagaag aacagggtag 780aaaggggaaa cacgaggaag cagctgggga ggaggatatt tttcatttct ttcatgaatt 840gttttctcaa tacagctgga gtatatatac tcacgcactc cacccctctt gcccttaggg 900cccaccttgt catagacact tctatctata aagagtagaa gatgtattca cttctgaaaa 9602105211840212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(163)223/栽培品種＝″hts，mth，yki，krr，yma，hez，ank，mmm，fom，或don″/注＝″用″c″置換″t″″4005tgctgcatgt ttcagtccaa gctaggcgcc acagaacgga caaaagtaag aaaatcgcta 60cgtacaactc acgtctgacc agcacttagc tgctaattgc cctagccaca tggagagaag 120ttggtctgcg tgaagcgtaa cgattggcag ataaagttgg attggatggg aatcggacga 180gggagtcgaa cgtatagcaa cactccagaa gtaaagcagt aaaccgaaaa agttttgcta 240tcacttgtat gaccgtctcc acaagtggcg actggcacga catggccact cgacagaacc 300
gcacaacaaa tgctgatcct ttgcccctat tccatgcgaa gttgcgactt gcgagtcttt 360gggcagggca tgcactactg acaagatgaa agaagaaaat caaccgtaat tcgggcgtgc 420actgctgcag aatagtcctt gtgatcatgt ccatgtgacc atgttcgtta cgttctgagg 480cgtcgatagc gagcgatgct ggtaatcgtg accaatctcg ttcacgtcca ccttgttgac 540gcgcacgtac gtcgctatat atgacaacgt cctgctacat atagccttgc tcactttcgg 600actttgacgt atgtgaagag agcacgacta ggagccacta atcatatggt ttggtacatg 660agaggatatg catgtttcac tttgcaccca acatgtactg tactcatcta gtcatcctac 720tagtattttc catcggtgtc cctttctcct gtgatctctc gctttgcaca caaacctcgc 780aacaaaacgg tctcgctgtc gcctttcagc gcttcggcaa aggattggtc ggttcatgag 8402106211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(515)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，ghm，mnk，yma，ksh，akk，ank，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，或knh″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(624)..(626)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，ghm，mnk，yma，ksh，akk，ank，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，或knh″/注＝″″tgc″缺失″4006aattattatt attattattt ccaatcagcc atatatatgg cttgccaacc gatggcagca 60caaatctttc gcgtccgttt gaacccattc ttcaaacttg aagttggatt tggacgtaat 120agaaggtgca gttgttcact tgttcctggc atcaacgtgt acggttgaac aaatcggtgg 180atctcttatg gttaacgtgc cctgttgatg tctgaaaacc catctgttct ttgttctaac 240tcctatctta tcctctcatt ttttttcgct tggtctcaac ttcgtgttct actagttttg 300aacgagtcac tcactcggac tcgagagctc tgaacttctg aacaagccaa aatgctgtct 360gaaccgagat cttcttggcg ctgtcagcct gtcacaaact cgcaatccaa ttgcacttcc 420agcggttgag caggttcaat tcaacatgac tttcatcagg agatggtaag ttaggaacag 480attactgtca caactcacaa cagttattac tactatcgca acaaatgcta gctgtcctta 540tcctcatcga ctggatactt cagaaacaag cataacagta gcattggagc aaaggacaca 600gcatggctag aagtagatgc tgctgcctag agatatcatc tcgaattcat ggcatgaaca 660aacgtcgttc atgcagccat gcaggaataa taagctcaga acaggattca ggacaaattc 720aagctatcta caagcttgcc agcatcatca tattataata attgctttaa tagtcagcaa 780
actcgtacag aatagccaga tccaaatttc cacaaactat atatcatcat caggaatttt 840aaaaagagaa ctcggaatcg atttcgcatg atattcgagg acacccaagc caaactgacg 9002107211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(247)223/栽培品種＝″hts，mth，yki，krr，mnk，hez，ksh，akk，ank，hnh，ymt，hit，mmm，fom，或knh″/注＝″用″c″置換″a″″220
221變異222(341)..(342)223/栽培品種＝″hts，mth，yki，krr，mnk，hez，ksh，akk，ank，hnh，ymt，hit，mmm，fom，或knh″/注＝″用″tgtg″置換″tg″″220
221變異222(534)223/栽培品種＝″hts，mth，yki，krr，mnk，hez，ksh，akk，ank，hnh，ymt，hit，mmm，fom，或knh″/注＝″用″c″置換″a″″4007taaccacttg cttcagttgc tgcatgctta gtacatcagt actgtcatgc cattggttgg 60tgtggctgtg agtgaacatt gtgcagcaga gaagcaagca acaatagcat tggaccccca 120agaaccagta cattatctct atctgtgaca gagaacacaa gaatgcaaat gctgataaag 180aatcaagaaa gcattgtgca agcagcaagg tgagtagaga gtgatggaag cagagagaag 240ctgcagacta gtgatgaaaa tgattggtga gtacagtgta acaactaaca acaagtctct 300atgaagaagc aggtactaag catgcatgtg tgtgtgtgtg tgatggcatg tggtatcaat 360gcttctgggg ttgttcactt gtccaccaga gcaaccagga caagtcttct cactctacca 420ttccggtgtc attttctctc tcaacccctc ctcttgttgc tttagcaagc ctgcagctta 480aactagatta tgttttcttt cctcaataaa gattaatagt attgttaatc atgacatctt 540tccctcacct gtttctctct caagagagag gaggaggtgc acaggcacag acagctcaca 600caaacattgt gttgttcatg tctctttctt gcctaccttt gttgaactgg tttgccttgg 660gagacacaca ggacactcga ggctgcctgg ctggcctctt tgtcagggag aaacctgcta 720atctgctata atagtgttgc ttataattct atgattctat ccatcacaaa ggacacagta 780
tagctgcatc ctttaactgc agcttgcagg cctttttcat cgtttacttg ttagcttatc 840agccgcgacc aaaattttta gtactaaaac tcaatattag agttgatgtt agggtttttt 9002108211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(247)223/栽培品種＝″mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，ksh，tkh，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″t″置換″a″″220
221變異222(259)223/栽培品種＝″mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，ksh，tkh，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″c″置換″t″″220
221變異222(307)223/栽培品種＝″mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，ksh，tkh，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″a″置換″g″″220
221變異222(358)..(359)223/栽培品種＝″mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，ksh，tkh，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″tgta″置換″ta″″220
221變異
222(396)223/栽培品種＝″mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，ksh，tkh，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(444)223/栽培品種＝″mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，hez，ksh，tkh，akk，ash，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″c″置換″t″″4008tgtatagtgt caaatttact cataggttgt ttgtttttgc gatggaggga gtattggttt 60gactggatgg gtcatggaaa actggaaaag caacagcggt atgcatggca aaagagggac 120aaaagaacaa gacgaaacat aggtaggatt gcaggatgct caagtgagaa cttgtagttg 180tagatgaagt gaagtgacaa gccgaagtcc cgtgaacgaa gcaacaaaaa attgtgggag 240ttttccattt gttgtatgtg tattatttgc gatttgaaat ccaggctgtg tttagttcct 300tccaaagtta gaagtttggg ttgaaattga taccatgtga ctgaaaagtt gtgtgtgtat 360gacaggttga tgtgatggaa aaagtttgaa gtttgaattc aaagtttgga tctaaacaca 420gccccaatgt ttaaagagaa ctttaacgat taaatttggc cacgaccggt aagccgataa 480acaaaagatg agaataaagt actgtatata caacttccag cctcatcttt tcacttatgc 540ttatgtttat caactaaaat ttaaattttc aaccttaaat ttagagttga ttttagggtt 600ttttttatcg aagtttattt tttagccttt acttttagat cgtaggaaca cgtatatgaa 660aaaattattt ttcatttgca attataccgt ttgtcttatt ccctatataa gcgaaacgag 720ggaccttccc tgtcttgctt gtgatcatca gtcatctcat ctatccgctg gatgtgaagt 780tacgacagaa atgatccatc gttcaacttg aattacactt gtactactag cggtgtacgc 840tcgcatgtca gcgtaacgaa acgatgacat cgccatcaca gtaggagtat tggtactaat 9002109211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(475)223/栽培品種＝″yki，yma，或ssk″/注＝″用″g″置換″t″″4009
attacaaaaa ttatatgaac atgcttaaac aatttacaag aataattctg gttgatggct 60tgaggcacgt caaaatgttt cataaagtgt gaagtgagtg taactcaact ggttatgttt 120ttttatggaa tcagtctacc taagttgaag tcctagactt acgccgatgc ttgtatttat 180tgttaatttt tttttcgtgc tagacgccta tcatgacttc gttaatctca agatatgctc 240gcacagtctt tcggaggtgc tcatatgagt aagatgtgcg tgtgtacgtt catatgagtg 300agtatacgtg tgctacgaga gtctgcgtat acagtgtgct tctaccaaaa aatgtttcag 360agtaaatttc acaaaactgc aggtactttg atcaaattat tataaaacta cagatttaat 420gtgatgtatt acaaaactac atatttaacc atgaaattat tacagaacta cagatttaag 480attaagtatc acaaaactac aaatttaata ataaaattat cacaaagata taggttttgg 540ggtttaaatt cttagcacta atatgttatg attgagttat aaatatctaa gttttgtaat 600taaattgatg ctaaacatat agttccacga taattttgtt actaaatctg tagttttata 660atattctacc ttaaatctat aattttatga gaaattcagt gttaaatctg tagttttgta 720atatattatc ttaaatatat agttttgtga aatttaatca atgtttcaca ggagacgtgg 780catatatgta tactccacag agcgtgtaat taaacgtaat taaaatatga ccaacatgaa 840cgacggaaga ctacgtgtga accagccagc taattggccc tggaatccgt gatgaccaag 900210102111020212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(209)223/栽培品種＝″krr″/注＝″用″t″置換″g″″220
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221變異222(758)223/栽培品種＝″krr″/注＝″用″t″置換″c″″40010aaaagtccca cggaaacagc caaaagttta ttaaacctta ccattgaatg cagcattggt 60gaccttgctg cccttgaaag cttagttagt tcattggtat caaaaggaga aatttcatcc 120
aacacggtgc actcttgttt cccttcaaag tttgctcata gcaacctttc aaatgctatt 180ttttacagtt tagttacagt aatgctaagt actcccccca ttccaaaata tagggcacaa 240cgattttttc ccctaatgtt gcataatacg aggttcgcat gcatgcgtgc atgctattga 300ctagcacctc cccctcctct aagttctatt tttaaagcct ctaccctcaa gatctctgat 360ctctaatccc attgggtgca tgcattttat ttattgggat gatccaaatt agaaggtgat 420aataattttt tcttggtttt tgcgtaagag atagttgctc attatatttt ggaatgtagg 480ggagtactca tttattctag cacaccaatc tcctgtgcac caaaagtgat tctgcacata 540gattgagaat gcaaggtagt actaacttgc aattaagtga gtgcattaat tgctgaatat 600gcataaatta agaacttaag atgcatgcaa agaatattgc tcccagtttc tccactttct 660gatgtgaact tcccttatct agatcctaca gtgggaactt ttttctgttc atcttgaagt 720atcttttgtt agctgctcat caaaataatt tatattgcct ataacataac ttataccatt 780ttgtcgaatg ttatttatct aacttcagtg acacctatta tcttttgttg gggaagttca 840cacttgttaa atcccattgt cttttgcaga taacagccct gtgggattat ttttgctttc 900acatcaatgg tgtgaaacca gtgcaaagcc gtggagcttt atcgattctt tgcatggcag 960caaagtcatc tcccagcatt ttgggtactc atttgcaaga tattattgat attgggtttg 102021011211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(612)..(613)223/栽培品種＝″krr，tgr，yma，ksh，tkh，akk，ash，mtb，ymt，don，或knh″/注＝″用″ag″置換″ca″″40011cttaatccct taatcttcat gtttagaaga ttcgaacggg ggatccagtc ttcaacttgg 60cacgcacacg tctcaatctg cctctccatt aatagccaaa caagctgtgt ggcttttctc 120ttgcaacttg cagctgtgct gatgttgctg cattctggtg aactaggcta aaaggcattt 180tgtggtcagg ccctgtttag ttttacggtg aaaagttttg gcgtgtcaca tcggatatac 240ggacacacat ttaaatatta aatatagtct aataacaaaa taaattacat attccgtctg 300taaattgcga gacgaattta ttaagcctaa ttaatacttt tatcaaatca tggcgcaatt 360aggcttaaaa gattcgtctt acaatttaca cgcaatctgt gtaattagtt tttttattta 420tatttaatac taaatacatg tgtccaaata ttcgatgtga catgatgaaa agtttttgcg 480tgaaaactaa acaggacctc atccacattg ccatggatac atatcattca tgccatggct 540agctacctct tgataatagt agaattgtca cgccccgaac tagtcccgac cggaactagc 600ccgtgacgct ccaatttaac ctgttaatcg ataccagtcc caggaaatag tgctggtatg 660acagggagac agaatatcac agcaacagag gtctctttat tatagagtag aggtacagtc 720atgttgggct gcggacagat cccgagctca caactgcatt acagaaggga aacggaagcc 780aggacttgga ccaaacaaca caggcgcgac ttgggaacta ggccgaaacc ctaaaactca 840
tcatagccgg cttgctcctg gaagaactcc tcatcagcag gatccgcttc atcttcttca 90021012211960212DNA213稻(Oryza sativa)220
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221變異222(571)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，ghm，mnk，yma，tkh，akk，mtb，hnh，或don″
/注＝″用″t″置換″g″″40013gaagcatctt aattccagac aagtcaaatt tcatagcaag ggacgatgtt atgattattt 60attgaattgt acagtactat tcaacctgac aaacattgtg caatcacatg gaaatggagc 120gttcatttat caaatttgca cgaattcggc gatctcaacc tcaagaggag caactaccgt 180attcatcctc aatgttaatt tctccccgaa catattatcc tactaccgta ttcatcctca 240atgttaattt ctccccgaac atattatcct ttcgtgcttg atctaatttt aggcatagct 300caaaattagt gcaactaatc tacaaactgt gaatggacaa aaatatacag cttcagcttc 360tcaaaaccac ttcccccatt cgaacctgaa caaaacccaa ctctgatggc acagtaaata 420actaactagg gcaagaacca tcgcgcgaca cgggcgcggg ctagatcgat cgatcggtcg 480atcaagcccc tcccccaaga gggaaacacg accagcgaca gcgatccatc caacgccgtc 540gcatcattca cagctatagc ctagcttgga ggaatcaaac catggatttt ggccttgacg 600ttgtcgatgt gtcgctgctc tccacctcga gaaacntggc cccgtcaggt cttaaatacg 660ggtgtctt 66821014211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
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21015211490212DNA213稻(Oryza sativa)220
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221變異222(55)223/栽培品種＝″krr，ghm，ksh，tkh，ymt，hit，mmm，fom，don，或knh″/注＝″用″g″置換″t″″220
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/注＝″用″a″置換″g″″220
221變異222(133)..(134)223/栽培品種＝″krr，ghm，ksh，tkh，ymt，hit，mmm，fom，don，或knh″/注＝″用″ttc″置換″tc″″220
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213稻(Oryza sativa)220
221變異222(163)223/栽培品種＝″ksh，tgr，mnk，yma，hez，akk，hnh，ymt，hit，mmm，fom，don，或knh″/注＝″用″a″置換″g″″40017ttgaatcggt tgcaggagag ggcggtggcg atggcggagt tggttgggcc gcgggtgtac 60agctgctgct gctgccattg ccggaaccac gtctgcactc cacgacgaca tcatctccaa 120ggcctttcag gtgaagaaga acttgagttc ttggggattt gtggggctga ttgctcaagt 180gacaaatact aatcttaggt catgtactga caatctagat tgaattggat ttaatcacta 240ggcttctgat gtgcgtagtg ccggattgat ttggtatatt atgctaaaga aggtaaaaac 300atggcatagc cgca 31421018211644212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(421)223/栽培品種＝″ksh，krr，tgr，mnk，yma，hez，tkh，akk，ash，ank，mtb，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″c″ 置換″a″″40018cgaccccatg aagcttttgc ctctctcacg cttcttgcca cagccaaagt atgatgctag 60cctaatttat agcttactgt ttccggtgtt aaatttgctt gtagattcgg gttcacgtgc 120aaacttgaat tgataacacc atgtcatgcc aactgctatc tttctcccaa caagtatttc 180taaaactcaa ttgaacattg ataattctca agaaagctaa taagtgttac aaatactagc 240agctctaaga aatatattca aattctaatg tatgcctatt aagcccaaag attccactat 300tgtagtctgc attgtttgga attaattgat gaatctactg caggttctga ctacagaaat 360agtgcagctt ctctgtccta tatgactata cgaaatgtta caagcaaagc atgaggaatg 420aatataaaaa actaaacaaa tagtgaaata tctatctaat taacaccaag gagttgcgta 480actctgtttg ccttctctgc aggggccaaa gtcaaggagg gggcagaggt ggtggccgtg 540gtggtggaag aggcggtttc cgtggccgtg gtggtggtgg cttccgtgga agaggtgcgc 600caaggggccg tggtggacct cctaggggtg gaggtcgtgg attt 644
21019211549212DNA213稻(Oryza sativa)220
221misc_feature222(3)223n＝a，t，g，或c220
221變異222(172)223/栽培品種＝″hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，ksh，akk，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，don，knh，或ssk″/注＝″用″g″置換″t″″220
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221變異222(298)223/栽培品種＝″hts，mth，yki，krr，tgr，ghm，mnk，yma，ksh，akk，ank，mtb，hnh，ymt，hit，mmm，don，knh，或ssk″/注＝″用″c″置換″t″″40019atntccccct atcggatcgg tcatggagat gctactgcca ccaccgatga actcctctcc 60
cagtcgcggc gaatcaagcg accccgatga aaaatcgagc tccccggcga cggatcgacc 120tgccacgatg gcggattgag cggctcacct ctcctcaccg gatccagcca gtgtcgtggc 180catcttcgag ctcgagctgc atgcctccgt gcgacagcgg cggtggatcg gacaagggtg 240acgcggatct gtcggcctcc accccagatg agcgattttc cactctaccg gattgagtgt 300atatttggct ttgtctttta tctgactgga tttctcttct ttttcttctt aattaggatt 360caattgttct taccataaag atgtttttag gcccgatttg gttaggtttt gggggaattt 420gggttaaact ctatcggttt tctataggag agacggggat agattcggtc ggtttcttta 480ggagggacgg acagaggaag tgcggagggc ggaggggatc gtgaacaaag gggacgctcc 540accaaaata 54921020211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
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220
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220
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221變異222(481)223/栽培品種＝″krr，tgr，ghm，mnk，yma，ksh，akk，ymt，hit，mmm，fom，don，或knh″/注＝″用″c″置換″t″″220
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221變異222(722)
223/栽培品種＝″krr，tgr，ghm，mnk，yma，ksh，akk，ymt，hit，mmm，fom，don，或knh″/注＝″用″g″置換″a″″220
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221變異
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gtgaaggaga ggtatattga aatattatgt ggattatgtg ggatgataat ttaattaaca 180tgcttgcatt ttaaagttct aaaacttaat aaattagcat gcttgcatga gatttaagat 240gtattaaatg ttagtggatg atgtggcatc tttgcatgtt gagctttaag atgtagtggg 300ctttaacttt atagaaatat aggattaatt cctatagaat gtcatgatgc aggatgtcat 360taataatcct ccaagctgtt cccttttaac ttttttccct gttacttgaa acttgactaa 420ggattctctt cgtattaatg tggattgtgt cactgaccat atggttgtat ctttctttca 480gcgcttcgct gggacttgga atgtttgttg tttttcagtg ctttcatggc catggaactc 540agaatgtctc caacgtgcaa attcttggtt gtgatctaga agatggttat ttgtttgaaa 600caatggaagc acttgatgtt cccttagcat atacacttgt gagcttgtgt tgatagaatt 660gtaaagctta catatgtttt agttctacta ttattttgaa gagggaaatg tgcagctgga 720tgc 72321025211799212DNA213稻(Oryza sativa)220
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221變異
222(216)223/栽培品種＝″krr″/注＝″用″t″置換″c″″220
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221變異222(445)..(446)
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221變異222(92)223/栽培品種＝″mth，krr，ghm，yma，hez，ksh，tkh，akk，ank，mtb，ymt，hit，mmm，fom，don，knh，或ssk″/注＝″用″c″置換″g″″40026attttcagaa cagtcatcat agacatgcca atttactaca agcgaagact ggagaggtta 60ggattcaaat agttaataat taactttttt tggaatcagt atgctatata tagttaaact 120ttaggagaaa gaacattgtt gatatgaaga cactattgct ctaaatatga acaacacaca 180caataaatct aagttcggtg tactgaacta tcaggtatgg acctatattc aaaactaaca 240taggaggcca gcacgtggtc atatcccttg atcccgaggt gaaccagttc atatttcaac 300
aagaggggaa gttgttccaa tcctggtttc cagaaaccac actaaacatc tttggaaaga 360agacactcac cacgtataat agaactgctc acaagttgat ccggagcttc gtatgcaagc 420tctatggccc tgaaaacgtg aaaaaatcac tcctgccaga actagagaac tccatgaggg 480aaagcttggc gtcatggata ggaaaaccta gtgtcgaggt gaatgatggc gtgtcaaatg 540taagttaaca tctgcatttc tacataagta ttcacaattg cacagtgctc ataaaatcat 600catgatgttt tactatgatt aatttctatt gtgcagatga tcttcggcct agctgccaaa 660cattgattgg cctcgacatc accattcagg agattgaaaa agacttcag 70921027211900212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(743)223/栽培品種＝″krr″/注＝″用″g″置換″a″″40027cacacatcaa gcacgatcgg aaacgttgta ctgtatctcc cgcataatga ttatggagtt 60ggcactcgag atcaagatat cagaatagta tatttttctg ttttcaattc ttcctctcca 120cagagctctt cctagcctcg gcttgtgaga gtaagcgcgc ctcccagcca actaagaatt 180tgtcggcctt cgcaatggtt ggttgcaggt ctgctgttct caacttttgg attgacaaag 240gaagacctaa ttaggacatt agcagggatt cctgtttgca ttgcagagtg tgaatcagct 300gagactcttc ctccgctccc acatagatgc atatcattgt gctcttacta aagttgattt 360gcagacttgt tgccctagaa aactcgtcta ggcaatgctt tagtggtgtt acataagcaa 420tcgaagctcg tcaaataatc aatataacat tggcatactg cagagctgta cgaggtctct 480gagggtacag atggtgtcca gagcagggtt tgctctaaga aggcattgga gcacatctgc 540cggatgaaca agtaaggtga cataggatca ccttgacgta gccctctctt acaaccgatc 600cacctgccca ggacttcatt gagaaggata gttgactttg aagtctgcta catgttgatc 660acccaatgga tccaagtatc gggaatcctc ttgccctcat aatatctagc agactttccc 720atcttatggt ttaggaggaa ttatatggtg tttgacaaat ttctaattaa atcttattgg 780catatatttt tcagggaaat atattggttt tggttctaag cacaactaca aatgtgtgaa 840aagtacaaga agctaaaaca tactgcatat caaaacttgg agtccacggc cataaatata 90021028211840212DNA213稻(Oryza sativa)220
221變異222(164)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″c″置換″t″″220
221變異222(225)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(254)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″a″置換″g″″220
221變異222(261)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(268)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(296)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或sks″/注＝″用″c″置換″t″″220
221變異222(326)
223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或sks″/注＝″用″g″置換″a″″220
221變異222(552)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″t″置換″c″″220
221變異222(667)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″t″置換″c″″220
221變異222(728)223/栽培品種＝″mth，krr，tgr，mnk，yma，hez，ksh，akk，hnh，hit，mmm，fom，或ssk″/注＝″用″a″置換″g″″40028ttgaataaac catggaaaat tattacacat ataatacatt agcgaccaaa ttgtttcgcc 60cctaactaga tgatgccccg cgctttgctg cgggatatat gttagatact ggagaaatga 120acaaatgatt tggattaaaa tattatgaaa atggtttgag aattagtatg tttagttttg 180gaatgaagta aattgtagat ataattacta tatgcttgca tgttaaactt tgtgtgctta 240atgggttgat gtggcatgct acatgtaagt tttaggagtg ctaataaata ctatgtttat 300atgttgagct ttaggtgttt agtggacatt agctttatag aaagaagaga tccctttcct 360ttttcaggtg attttctgtc cagtccacct cttttcatct ttttttggta taataactct 420cgtggacgag aatttagagt atttaccatc caattcgtgt gcctcaactt ttttacactc 480aatccgtatg ccctctataa tactccgtat gacattagga ctgctaacta gtctatttgg 540taccactttc tcagtttttg atgtatttct catttcttaa ctcaatttgt atttctttta 600tggcattgtg gacaattttg cccctaggcc cactgtaaga tcaaaggaag attgtcgtag 660gctctccgga ccttccatta tatttgagag ataaagtgaa taattcaagt catcaaacaa 720gcataatgaa acatccgacg cctcgagaga gaaatattgg agacattgct ggacctttag 780cctgccagtc aacttcagcc taaaatgtgc tcgtcaaacc actcgaaggc ggcgaccaga 8402102921120
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223人工序列的描述人工合成的引物序列400114aataatactt cggcgcatcg 20
權利要求
1.鑑別水稻品種的方法，包括下列步驟(a)和(b)(a)確定在根據水稻基因組的任何下列(1)-(28)的位置的核苷酸類型，或確定互補鏈上與該位置核苷酸組成鹼基對的核苷酸的類型(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列的593位，(2)SEQ ID NO2的核苷酸序列的304位，(3)SEQ ID NO3的核苷酸序列的450位，(4)SEQ ID NO4的核苷酸序列的377位，(5)SEQ ID NO5的核苷酸序列的163位，(6)SEQ ID NO6的核苷酸序列的624位，(7)SEQ ID NO7的核苷酸序列的534位，(8)SEQ ID NO8的核苷酸序列的358位，(9)SEQ ID NO9的核苷酸序列的475位，(10)SEQ ID NO10的核苷酸序列的323位，(11)SEQ ID NO11的核苷酸序列的612位，(12)SEQ ID NO12的核苷酸序列的765位，(13)SEQ ID NO13的核苷酸序列的571位，(14)SEQ ID NO14的核苷酸序列的660位，(15)SEQ ID NO15的核苷酸序列的223位，(16)SEQ ID NO16的核苷酸序列的247位，(17)SEQ ID NO17的核苷酸序列的163位，(18)SEQ ID NO18的核苷酸序列的421位，(19)SEQ ID NO19的核苷酸序列的178位，(20)SEQ ID NO20的核苷酸序列的141位，(21)SEQ ID NO21的核苷酸序列的480位，(22)SEQ ID NO22的核苷酸序列的481位，(23)SEQ ID NO23的核苷酸序列的131位，(24)SEQ ID NO24的核苷酸序列的510位，(25)SEQ ID NO25的核苷酸序列的248位，(26)SEQ ID NO26的核苷酸序列的92位，(27)SEQ ID NO27的核苷酸序列的743位，和(28)SEQ ID NO28的核苷酸序列的552位，以及(b)使步驟(a)中確定的核苷酸類型與水稻的品種相關。
2.權利要求1的方法，其中通過利用以水稻基因組中任何下列(1)-(28)的突變為特徵的多態性標記鑑別核苷酸的類型(1)SEQ ID NO1的核苷酸序列中593位的核苷酸是T，(2)SEQ ID NO2的核苷酸序列中304位的核苷酸是T，(3)SEQ ID NO3的核苷酸序列中450位的核苷酸是A，(4)SEQ ID NO4的核苷酸序列中377位的核苷酸是C，(5)SEQ ID NO5的核苷酸序列中163位的核苷酸是C，(6)SEQ ID NO6的核苷酸序列中624位的核苷酸是C，(7)SEQ ID NO7的核苷酸序列中534位的核苷酸是C，(8)SEQ ID NO8的核苷酸序列中358位的核苷酸是G，(9)SEQ ID NO9的核苷酸序列中475位的核苷酸是G，(10)SEQ ID NO10的核苷酸序列中323位的核苷酸是A，(11)SEQ ID NO11的核苷酸序列中612位的核苷酸是A，(12)SEQ ID NO12的核苷酸序列中765位的核苷酸是T，(13)SEQ ID NO13的核苷酸序列中571位的核苷酸是T，(14)SEQ ID NO14的核苷酸序列中660位的核苷酸是G，(15)SEQ ID NO15的核苷酸序列中223位的核苷酸是A，(16)SEQ ID NO16的核苷酸序列中247位的核苷酸是A，(17)SEQ ID NO17的核苷酸序列中163位的核苷酸是A，(18)SEQ ID NO18的核苷酸序列中421位的核苷酸是C，(19)SEQ ID NO19的核苷酸序列中178位的核苷酸是G，(20)SEQ ID NO20的核苷酸序列中141位的核苷酸是G，(21)SEQ ID NO21的核苷酸序列中480位的核苷酸是C，(22)SEQ ID NO22的核苷酸序列中481位的核苷酸是C，(23)SEQ ID NO23的核苷酸序列中131位的核苷酸是C，(24)SEQ ID NO24的核苷酸序列中510位的核苷酸是A，(25)SEQ ID NO25的核苷酸序列中248位的核苷酸是T，(26)SEQ ID NO26的核苷酸序列中92位的核苷酸是C，(27)SEQ ID NO27的核苷酸序列中743位的核苷酸是G，以及(28)SEQ ID NO28的核苷酸序列中552位的核苷酸是T。
3.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(c)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括在權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA，以及(c)確定所擴增的DNA的核苷酸序列。
4.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(d)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)用限制酶消化所製備的DNA，(c)按大小分離DNA片段，以及(d)與對照比較所檢測DNA片段的大小。
5.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(e)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括在權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA，(c)用限制酶消化所擴增的DNA，(d)按大小分離DNA片段，以及(e)與對照比較所檢測DNA片段的大小。
6.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(e)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括在權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA，(c)使所擴增的DNA變性為單鏈的DNAs，(d)在非變性的凝膠上分離變性的單鏈DNA，以及(e)與對照比較凝膠上所分離的單鏈DNA的遷移率。
7.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)合成用報告螢光染料和淬滅螢光染料標記的兩個不同寡核苷酸探針，其中該寡核苷酸與包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對的核苷酸之近側的核苷酸序列是互補的，(c)將步驟(a)中製備的DNA與步驟(b)中合成的探針雜交，(d)擴增包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA，(e)檢測報告螢光的發射，以及(f)與對照比較步驟(e)中所檢測的報告螢光的發射。
8.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(h)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)合成探針，其中與包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的3′-側的核苷酸序列互補的序列，與完全無關的序列組合，(c)合成與包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的5′-側的區域互補的探針，(d)將步驟(c)中合成的探針與步驟(a)中製備的DNA雜交，(e)用單鏈DNA切割酶消化步驟(d)中的雜交DNA，並且解離步驟(b)中合成的探針部分，(f)將步驟(e)中解離的探針與用於檢測的探針雜交，(g)酶促消化步驟(f)中的雜交DNA，並且測量由此產生的螢光強度，以及(h)與對照比較步驟(g)中所測量的螢光強度。
9.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中與該位置核苷酸組成鹼基對的核苷酸的DNA，(c)使擴增的DNA變性為單鏈的DNAs，(d)從變性的單鏈DNAs只分離一個鏈，(e)從鄰近權利要求1的(1)-(28)的任何位置，或互補鏈中的與該位置核苷酸組成鹼基對的核苷酸進行延伸反應，其中由此反應一次延伸一個核苷酸，然後酶促發光顯示所產生的焦磷酸，並且測量發光強度，以及(f)與對照比較步驟(e)中測量的螢光強度。
10.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置核苷酸組成鹼基對的核苷酸的DNA，(c)合成探針，該探針與包括覆蓋鄰近於權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中與該位置核苷酸組成鹼基對的核苷酸的序列之核苷酸序列互補，(d)在存在螢光標記的核苷酸時，利用步驟(b)中擴增的DNA作為模板以及步驟(c)中合成的引物進行單個核苷酸延伸反應，(e)測量螢光偏振，以及(f)與對照比較步驟(e)中測量的螢光偏振。
11.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA，(c)合成與核苷酸序列互補的引物，該核苷酸序列包括覆蓋鄰近於權利要求1的(1)至(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中與該位置核苷酸組成鹼基對的核苷酸的序列，(d)在存在螢光標記的核苷酸時，利用步驟(b)中擴增的DNA作為模板以及步驟(c)中合成的引物進行單個核苷酸延伸反應，(e)利用測序儀確定步驟(d)的反應中所使用的核苷酸種類，以及(f)與對照比較步驟(e)中所確定的核苷酸。
12.權利要求1或2方法，包括下列步驟(a)-(d)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA，(c)利用質譜儀測量步驟(b)中擴增的DNA的分子量，以及(d)與對照比較步驟(c)中測量的分子量。
13.權利要求1或2的方法，包括下列步驟(a)-(f)(a)從待測試水稻製備DNA，(b)擴增包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA，(c)提供固定核苷酸探針的基底，(d)將步驟(b)中的DNA與步驟(c)中的基底接觸，(e)檢測DNA和固定在基底上的核苷酸探針之間的雜交強度，以及(f)與對照比較步驟(e)中檢測的強度。
14.權利要求1-13的任何方法，進一步包括下列步驟(a)和(b)(a)在鹼性水溶劑中破裂水稻種子，以及(b)從步驟(a)中破裂的種子中提取水稻基因組DNA。
15.權利要求14的方法，其中水稻種子是精製的。
16.用於鑑別水稻品種的引物，其中引物是(a)用於擴增包括水稻基因組中權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的DNA區域的寡核苷酸，或(b)包括與覆蓋鄰近於水稻基因組中權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置的核苷酸組成鹼基對之核苷酸的序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸。
17.用於鑑別水稻品種的寡核苷酸，其中該寡核苷酸與包括權利要求1的(1)-(28)的任何位置的核苷酸，或互補鏈中的與該位置核苷酸組成鹼基對的核苷酸，包括至少15個核苷酸的DNA區域雜交。
18.用於鑑別水稻品種的試劑盒，包括權利要求16或17的寡核苷酸。
19.權利要求18的試劑盒，進一步包括鹼性水溶劑。
全文摘要
在24個在日本具有大規模種植面積的品種中搜尋多態性位點，並且比較品種間的多態性位點。從而獲得可用於以方便而快捷的方式鑑別品種的多態性標記。該標記對於每個品種顯示獨特的模式，表明其組合能夠用於鑑別品種。因而本發明者成功獲得了可鑑別24個水稻品種的分子標記。通過利用這些標記能夠區別近緣的水稻品種並且在DNA水平加以鑑定。
文檔編號C12Q1/68GK1675373SQ0381915
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月10日 優先權日2002年6月10日
發明者美濃部侑三, 門奈理佐, 鈴木淳子, 太田理惠子, 根本博, 出田収 申請人:株式會社植物基因組研究中心