一種幹擾B型肝炎病毒基因的siRNA分子及其應用的製作方法

2023-10-31 19:45:52

專利名稱：一種幹擾B型肝炎病毒基因的siRNA分子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種幹擾B型肝炎病毒基因的SiRNA分子及其應用。
技術背景
肝炎，即肝臟炎症，有多種致病因素-如病毒、細菌、寄生蟲、化學毒物、藥 物和毒物、酒精等，侵害肝臟，使得肝臟的細胞受到破壞，肝臟的功能受到損害，它可 以引起身體的一系列不適症狀，以及肝功能指標的異常。肝炎多數情況下指是由甲型、 乙型、丙型、丁型、戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。
B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染導致的B型肝炎，是一種嚴重威脅全球人類健康的的傳染性疾病，也是最嚴重類型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患 者死於肝硬化和肝癌的風險極高。
HBV屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，全基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環 狀DNA。其基因組共有四個開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼蛋白包括表面抗原6基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。
據世界衛生組織報導，全世界估計有20億人感染HBV，其中有3.5億以上的人 為慢性B肝感染者，估計每年有60萬人死於急性或慢性B型肝炎。HBV可造成急性病 患，症狀可持續數周，包括皮膚和眼睛發黃(黃疸)，尿色深，極度疲勞，噁心，嘔吐和 腹痛。患者可能需要數月乃至一年才能痊癒。B型肝炎病毒也會造成慢性肝臟感染，以 後可能發展成肝硬化或肝癌。
B型肝炎病毒通過與受感染者的血液或其他體液(比如，精液和陰道分泌物)接 觸而在人與人之間傳播，傳播途徑與人類免疫缺陷病毒(愛滋病毒)相同。B型肝炎病 毒的傳染性比愛滋病毒強50-100倍，B型肝炎病毒在體外可存活至少7天以上。在此期 間，如果病毒進入未感染者的身體，它依然可造成感染。病毒潛伏期平均達90天，但也 可能為大約30至180天不等。B型肝炎病毒在感染後30至60天即可發現，持續時間差 別很大。
目前主要是通過嬰兒接種B型肝炎疫苗來預防B型肝炎的發生，但儘管如此， 人群HBV流行率仍然很高。目前主要治療慢性B型肝炎的方法僅局限於抑制患者體內病 毒基因的表達和複製。如口服核苷類抗病毒藥-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的復 制，但是停藥後復發率高，長期應用則可導致病毒變異，在用藥6個月後發生由病毒聚 合酶基因發生變異引起的耐藥性，使得臨床抗病毒治療面臨極大的挑戰。
近幾年來，隨著RNA幹擾(RNAi)技術的迅猛發展，為疾病尤其是癌症開闢 了全新的治療途徑，為科研工作者提供了一個全新的基因治療方法。該技術通過用小 幹擾RNA(small interfering RNA，siRNA)幹擾特定靶基因的表達，來達到治療疾病的 目的，是基因治療的重要組成部分。RNA幹擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引發的轉錄後基因沉默機制。其作用機制是 核糖核酸酶III家族的Dicer酶，與dsRNA結合，將其剪切成21_23nt及3』端突出的siRNA,隨後 siRNA 與 RNA 誘導沉默複合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列特異性地結合到靶信使 RNA(mRNA)上並將其切斷，引發靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應基因表達。 RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用於功能基因組學研究以及抗病 毒、抗腫瘤治療的研究中。
本發明提供了一種用RNAi技術來抗HBV的方法。應用RNA幹擾技術，用靶 向至HBV基因的siRNA作為靶向藥物，在基因的轉錄後進行幹擾，從而有效抑制HBV的 蛋白表達和病毒複製，具有特異性強、高效、副作用小、可持續用藥的優勢，且能彌補 目前治療B型肝炎藥物的不足，在不久的將來可能成為一種新的治療B型肝炎的方法。發明內容
本發明的目的在於提供一種通過SiRNA全位點分子庫技術篩選出的高效靶向 HBV基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成
正義鏈5，-GCCAAGUCUGUACAGCAUCUUGNN-3『(SEQ ID NO 3)
反義鏈5，-CAAGAUGCUGUACAGACUUGGCNN-3『 (SEQ ID NO 4)
其中，N是A、T、C、G或U鹼基的任何一種。
換言之，該雙鏈siRNA分子的主幹序列為
正義鏈5，-GCCAAGUCUGUACAGCAUCUUG-3，(SEQID NO 5)
反義鏈5，-CAAGAUGCUGUACAGACUUGGC-3『(SEQ ID NO 6)
在一個優選的實施方式中，上述序列中3』端的「NN」是兩個脫氧胸腺嘧啶 dTdL
本發明的另一目的在於提供上述siRNA分子在製備抗HBV藥物中的應用。
體外實驗證明，本發明的SiRNA分子的反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的 mRNA結合，降解mRNA，從而幹擾轉錄後翻譯過程，抑制HBV蛋白質翻譯和病毒復 制，達到抗HBV的治療目的。


圖1是抽提的HBV基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。M為Ikb plus DNA Ladder (標準參照)。
圖2AHBV聚合酶片段1瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，製備得到的DNA片段大小為 1625bp。圖2B是HBV聚合酶片段2瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，製備得到的DNA片段大 小為 874bp。M 為 Ikb plus DNA Ladder (標準參照)。
圖3是siRNA分子庫構建流程示意圖。
圖4是U6_siRNA轉錄模板-HI表達框結構示意圖。
圖5是PCR製備的U6-siRNA轉錄模板_H1表達框純化後瓊脂糖凝膠電泳檢 測圖。圖中，M 為 Ikb plus DNA Ladder(標準參照)；1 為 HBV-22 ； 2 為 HBV-676 ； 3 為 HBV-877 ； 4 為 HBV-638 ； 5 為 HBV-1003 ； 6 為 HBV-748 ； 7 為 HBV-182 ； 8 為 HBV-261 ； 9為陰性對照。
圖6是表達框轉染細胞後實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA表達量柱形4圖，縱坐標表示HBV聚合酶基因mRNA表達水平；橫坐標表示處理實驗組，「Negative Control"為陰性對照組。
圖7是化學合成的SiRNA轉染細胞後實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA 表達量柱形圖，縱坐標表示HBV聚合酶基因mRNA表達水平；橫坐標表示處理實驗組，「NegativeControl，，為陰性對照組。
具體實施方式
本發明中諸如「siRNA」、「siRNA序列」或「siRNA分子」等術語可以互換，其表示的意思和範圍相同。
其中，siRNA序列可以是單鏈結構，也可以是雙鏈結構。
本發明的siRNA分子來源於針對HBV聚合酶基因的功能保守區而製備的siRNA 分子庫，本發明所用siRNA全位點分子庫技術是百奧邁科生物技術有限公司的專利技術 (中國發明專利號為ZL 200710024217.6，專利名稱PCR高通量構建siRNA全位點分 子庫製備方法)，其優點在於所製備得到的siRNA隨機分布於HBV聚合酶基因區段，長 度可控性分布於18-25bp，可以提高有效靶位點的命中率。
siRNA的製備可採用多種方法，比如化學合成法、體外轉錄、酶切長鏈 dsRNA、載體表達siRNA、PCR合成siRNA表達元件等，這些方法的出現為研究者提供 了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。
本發明的siRNA分子可以作為抗HBV藥物的有效成分。
作為該siRNA分子的另一種表達形式，可將其製備成DNA表達框形式，比如 U6啟動子-siRNA轉錄模板-Hl啟動子。
簡言之，在下文中將「U6啟動子-siRNA轉錄模板-Hl啟動子」簡寫為 「U6-siRNA轉錄模板-HI」或「U6-siRNA-Hl」，它們表示的意思和範圍相同。
出於應用目的，可將siRNA分子、表達siRNA分子的DNA表達框、或者包含siRNA分子表達框的質粒作為藥物直接給藥於受藥者身上特定部位，比如病灶組織。
本發明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合於相應疾病的給藥、並且恰當 地保持siRNA分子的活性。比如，對於注射用給藥系統，劑型可以是凍乾粉。
任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學可接受的輔助劑，只要其適合於相 應的給藥體系、並且恰當地保持SiRNA分子的活性。
為了實現本發明的設計思想並驗證篩選得到的SiRNA的抗HBV效果，設計了如下實驗方案
(1)構建HBV聚合酶基因的SiRNA分子庫，該分子庫中包含靶向至HBV聚合酶 基因的siRNA效應分子，長度分布於18-25bp。
(2)製備具有相應效應的SiRNA表達框，其結構為U6啟動子-siRNA轉錄模 板-Hl啟動子，使其更易於體外篩選。
(3)運用實時定量PCR技術，檢測上述SiRNA表達框在細胞中轉錄出的效應 siRNA分子對HBV聚合酶基因的抑制作用。
(4)化學合成上述方法篩選得到的最優靶點siRNA，在體外細胞實驗中進一步運 用實時定量PCR技術檢測HBV聚合酶基因的mRNA表達水平。離心機(Eppendorf公
下述實施例僅用於闡明本發明，並非是對本發明進行限制
實施例1
SiRNA全位點分子庫的製備
1.主要儀器、試劑和材料
1.1儀器PCR儀(ABI公司)；電轉儀(Bio-Rad公司)；司)，長波長紫外燈等。
1.2材料和試劑HepG22.2.15細胞(百奧邁科公司保存)；Ikb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；DNase I (Roche 公司)；MnCl2 (BBI 公司)；磷酸接頭 (Sigma-aldrich 公司)；ATP (BBI 公司)；BSA (NEB 公司)；BmsbI (NEB 公司) T4DNA連接酶(NEB公司)；Tag DNA聚合酶(百奧邁科公司)；瓊脂糖(BBI公司) dNTP (上海生工)；酚氯仿抽提試劑(上海生工)；低分子量DNA Ladder (NEB公司) EcoP 151 (NEB 公司)；T4DNA 聚合酶(NEB 公司)；R)kl 酶(NEB 公司)；SfiI 酶(NEB 公司)；感受態細胞(invitrogen公司)；pU6Hl_GFP表達載體(NT Oimcs公司)。凝膠 抽提試劑盒QIAEX II Gel ExtrationKit (QIAGEN公司)；質粒抽提試劑盒(百奧邁科公 司)。其他生化試劑均購於Sigma-aldrich公司。
2.siRNA全位點分子庫的構建
2.1HBV聚合酶基因的獲得從細胞HepG22.2.15的基因組DNA(如圖1所示) 中PCR擴增HBV聚合酶片段。HepG22.2.15細胞含2個拷貝的HBV基因組，能穩定分 泌HBsAg、HBeAg> HBcAg及Dane顆粒，並可檢測到細胞內HBV的DNA和RNA等 中間複製體 Bells etal.Proc Natl Acad Sci，1987 ； 84: 1005-1009),其含有 HBV 的血清 亞型為ayw(GenBankAccession number U95551)，根據GenBank報導的核酸序列設計 PCR擴增引物，分成兩個片段為HBV聚合酶片段1和HBV聚合酶片段2，長度分別為 1625bp (如圖2A所示)和874bp (如圖2B所示)。引物序列如下


HBV聚合酶片段1上遊引物 HBV聚合酶片段1下遊引物 HBV聚合酶片段2上遊引物 HBV聚合酶片段2下遊引物 1)HBV聚合酶片段1序列5'-AATTCCACAACCTTTCACCAA-3 『5'-TCACGGTGGTCTCCATGCGA-3 『 5，-ATGCCCCTATCCTATCAACAC-3 『5'-CCACTGCATGGCCTGAGGAT-3 『1aattccacaacctttcaccaaactctgcaagatcccagagtgagaggcctgtatttccct61gctggtggctccagttcaggagcagtaaaccctgttccgactactgcctctcccttatcg121tcaatcttctcgaggattggggaccctgcgctgaacatggagaacatcacatcaggattc181ctaggaccccttctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaata241ccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggaactaccgtgtgt301cttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcctgtcctccaact361tgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctcttcatcctgctg421ctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcct481ctaattccaggatcctcaaccaccagcacgggaccatgccgaacctgcatgactactgct541caaggaacctctatgtatccctcctgttgctgtaccaaaccttcggacggaaattgcacc601tgtattcccatcccatcatcctgggctttcggaaaattcctatgggagtgggcctcagcc
661cgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagg gctttccccc
721actgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggRRccaaRtctRtacaRcatc
781ttgagtccctttttaccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaacc
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1021ctgccccatttacacaatgtggttatcctgcgttaatgcccttgtatgcatgtattcaat
1081ctaagcaggctttcactttctcgccaacttacaaggcctttctgtgtaaacaatacctga
1141acctttacccCgttgCCCggcaacggccaggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaaccc
1201ccactggctggggcttggtcatgggccatcagcgcgtgcgtggaaccttttcggctcctc
1261tgccgatccatactgcggaactcctagccgcttgttttgctcgcagcaggtctggagcaa
1321acattatcgggactgataactctgttgtcctctcccgcaaatatacatcgtatccatggc
1381tgctaggctgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttacgtcccgtcgg
1441cgctgaatcctgcggacgacccttctcggggtcgcttgggactctctcgtccccttctcc
1501gtctgccgttccgaccgaccacggggcgcacctctctttacgcggactccccgtctgtgc
1561cttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccac
1621cgtga (SEQ ID NO 1)
2) HBV聚合酶片段2序列
2281atgcccctatcctatcaacacttccggaaact
2341actgttgttagacgacgaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacga
2401aggtctcaatCgCCgCgtCgcagaagatctcaatctcgggaacctcaatgttagtattcc
2461ttggactcataaggtggggaactttactggtctttattcttctactgtacctgtctttaa
2521tcctcattggaaaacaccatcttttcctaatatacatttacaccaagaca
2581atgtgaacagtttgtaggcccacttacagttaatgagaaaagaagattgcaattgattat
2641gcctgctaggttttatccaaaggttaccaaatatttaccattggataagggtattaaacc
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2761atggaaggcgggtatattatataagagaga3.3. C 3.3. C 3. C 3. agcgcctcattttgtgggtc
2821accatattcttgggaacaagatctacagcatggggcagaatctttccaccagcaatcctc
2881tgggattctttcccgaccaccagttggatccagccttcagagcaaacacagcaaatccag
2941attgggacttcaatcccaacaaggacacctggccagacgccaacaaggtaggagctggag
3001cattcgggctgggtttcaccccaccgcacggaggccttttggggtggagccctcaggctc
3061agggcatactacaaactttgccagcaaatccgcctcctgcctccaccaatcgccagacag
3121gaaggcagcctaccccgctgtctccacctttgagaaacactcatcctcaggccatgcagt
3181gg(SEQ ID NO 2)
2.2siRNA分子庫構建用百奧邁科生物技術有限公司的專利技術構建SiRNA分子庫(專利號為ZL 200710024217.6，專利名稱PCR高通量構建siRNA全位點分子庫製備方法)，構建流程如圖3所示。
成功構建HBV聚合酶基因的SiRNA分子庫，隨機挑取克隆進行測序，其序列長 度可控性分布在18-25bp之間，顯示出位點及長度的多樣性。7
實施例2
SiRNA表達框的製備與靶位點篩選
1.主要儀器、試劑和材料
1.1儀器PCR儀(ABI公司)；實時定量PCR儀(Bi0-Rad公司)；凝膠電泳設 備(北京六一)；長波長紫外燈；細胞培養箱ahermo公司)等。
1.2 材料和試劑Ikb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；Pfo DNA 聚合酶(百 奧邁科公司)；瓊脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生工)；瓊脂糖凝膠純化試劑盒(百 奧邁科公司)，Lipofectamin 2000 (invitrogen 公司)，DMEM 培養基(Gibco 公司)， TurboCapturemRNA kit (QIAGEN 公司)，SensiMix One-Step Kit (Quantace 公司)等。 其他生化試劑均購於上海生工。
1.3PCR引物(百奧邁科合成)
5，U6 啟動子弓丨物5，-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3『
3，Hl 啟動子弓丨物5，-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3，
HBV 聚合酶正向引物5，-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3，
HBV 聚合酶反向引物5』 -GCGTCAGCAAACACTTGG-3『
GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，
GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，
2.siRNA表達框的製備
2.1PCR擴增製備U6-siRNA轉錄模板-Hl表達框選取8例HBV聚合酶siRNA陽性克隆質粒為模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通過PCR的方法擴增製備U6-siRNA 轉錄模板-Hl表達框(圖3為表達框示意圖)。
各PCR 反應體系為 50μ1 反應體系0.5μ1 模板 DNA(10-50ng)，1μ15，U6 啟動子引物(10 μ Μ)，1μ13，Hl 啟動子引物(10 μ Μ)，1 μ 1 dNTP(IOmM)，0.5 μ 1 Pfo DNA聚合酶，用ddH20補足到50 μ 1。反應條件為95°C Imin預變性，95°C 15sec變 性，58°C30seC退火，72°C30seC延伸，20個循環。1.0%瓊脂凝膠電泳檢測，PCR產物條帶單一，片段大小符合實驗要求。
2.2表達框PCR產物純化1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增得到的表達框， 並用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化凝膠產物。純化後的DNA再次進行1.0%瓊脂糖凝膠電 泳檢測，純化後的U6-siRNA轉錄模板-Hl表達框純度和濃度符合要求，如圖4所示。 同時用紫外分光光度計測得製備後的表達框濃度約為200ng/y 1。
3.靶位點篩選
3.1細胞培養肝癌細胞HepG22.2.15在含10%FBS的DMEM培養基中，37°C、5% CO2培養箱培養。
3.2細胞鋪板並轉染將細胞按IX IO5/孔接種到96孔細胞培養板中，在無抗含 10% FBS的DMEM培養基中，37°C、5% CO2培養箱培養過夜。
轉染按照Lipofectamin 2000的說明書轉染，U6_siRNA轉錄模板-Hl表達框 DNA量按0.2 μ g/孔加入。
3.3實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA水平用mRNA提取純化試劑盒 TurboCapture mRNA kit提取純化細胞RNA，操作按試劑盒說明書進行，用80 μ 1無RNase水/孔溶解RNA，取4 μ 1 RNA為模板進行實時定量PCR反應。
用基因特異性引物檢測樣本中HBV聚合酶基因mRNA表達水平，同時擴增看家 基因GAPDH作為內參對照。每個反應做3個平行實驗。建立如下25 μ 1的反應體系 4μ1 模板 RNA，12.5 μ 1 2Χ SensiMix One-Step，1μ15，正向引物(6μΜ)，1μ13，反 向引物(6 μ Μ)，0.5 μ 1 50XSYBR Green I,用無RNase水補足體系至25 μ 1。 反應條 件42°C反轉錄 30η ι，95°C預變性 7min，95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環45次。
3.4結果分析用實時定量PCR 2_ΔΔΛ法分析實驗結果，並作出柱狀圖，如圖5 所示，結果顯示對應於HBV聚合酶基因多個位點的SiRNA均呈現較好的沉默效果，尤其 是HBV-1003，相對於未轉染組其沉默效果達到59%。
尤其需要說明的是，HBV-1003正義鏈序列與HBV聚合酶基因的第762-783位 (下劃線部分 gccaagtctgtacagcatcttg)相對應。
實施例3
化學合成SiRNA驗證沉默效果
1.主要儀器、試劑和材料
1.1儀器核酸合成儀(GE公司)、PCR儀(ABI公司)；實時定量PCR儀 (Bio-Rad公司)；細胞培養箱CThermo公司)等。
1.2 材料和試劑Lipofectamin 2000 (invitrogen 公司)，DMEM 培養基(Gibco 公 司)，TurboCapture mRNA kit (QIAGEN 公司)，SensiMix One-Step Kit (Quantace 公司)等。其他生化試劑均購於上海生工。
1.3PCR引物(百奧邁科合成)
HBV 聚合酶正向引物5，-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3『
HBV 聚合酶反向引物5』 -GCGTCAGCAAACACTTGG-3『
GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC—3，
GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，
2.化學合成製備SiRNA
利用百奧邁科生物技術有限公司擁有的核酸合成儀(美國GE公司)分別合成 siRNAl的正義鏈(sense strand)和反義鏈(antisense strand)的RNA。並進行純化，將正 義鏈和對應的反義鏈退火成siRNA雙鏈(duplex)，分裝IOD/管，最後冷凍乾燥，轉染前 用無RNase水溶解至20 μ M。
3.沉默效率驗證
3.1細胞培養肝癌細胞HepG22.2.15在含10%FBS的DMEM培養基中，37°C、5% CO2培養箱培養。
3.2細胞鋪板並轉染將細胞按IX IO5/孔接種到96孔細胞培養板中，在無抗含 10% FBS的DMEM培養基中，37°C、5% CO2培養箱培養過夜。
轉染按照Lipofectamin 2000的說明書轉染，RNA按IOnM/孔加入。
3.3實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA水平用mRNA提取純化試劑盒 TurboCapture mRNA kit提取純化細胞RNA，操作按試劑盒說明書進行，用80 μ 1無RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ 1 RNA為模板進行實時定量PCR反應。
用基因特異性引物檢測樣本中HBV聚合酶mRNA表達水平，同時擴增看家基 因GAPDH作為內參對照。每個反應做3個平行。建立如下25μ1反應體系4μ1模 板 RNA，12.5 μ 12 X SensiMix One-Step，1μ15，正向引物(6μΜ)，1μ13，反向引物 (6 μ Μ), 0.5 μ 150 X SYBR GreenI，用無 RNase 水補足體系至 25 μ 1。反應條件42°C反 轉錄 30η ι，95°C預變性 7min，95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環 45次。
3.4結果分析用實時定量PCR 2_ΔΔΛ法分析實驗結果，並作出柱狀圖，如圖6 所示，結果顯示靶向至HBV聚合酶基因的HBV-1003的沉默效果達到79%。
權利要求
1.一種幹擾B型肝炎病毒基因的SiRNA分子，其特徵在於，具有如下序列結構 正義鏈5，-GCCAAGUCUGUACAGCAUCUUGNN-3『 SEQ ID NO 3, 反義鏈5，-CAAGAUGCUGUACAGACUUGGCNN-3『 SEQ ID NO 4, 其中，N是A、T、C、G或U鹼基的任何一種。
2.如權利要求1所述的幹擾B型肝炎病毒基因的SiRNA分子，其特徵在於，所述N 為T。1
3.權利要求1 2中任一項所述的SiRNA分子在製備抗病毒藥物中的應用。
4.如權利要求3所述應用，其特徵在於，所述的病毒為B型肝炎病毒。
全文摘要
本發明涉及一種幹擾B型肝炎病毒基因的siRNA分子及其應用。該siRNA分子正義鏈為SEQ ID NO3，反義鏈為SEQ ID NO4，其中，反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的mRNA結合，降解mRNA，從而幹擾轉錄後翻譯過程，達到抗B型肝炎病毒的目的。
文檔編號C12N15/113GK102021170SQ20101052197
公開日2011年4月20日 申請日期2010年10月28日 優先權日2010年10月28日
發明者M·格拉漢姆, 付博峻, 唐小軍, 孫雲成, 朱遠源, 李鐵軍, 王晉康, 陸毅祥 申請人:百奧邁科生物技術有限公司