一種檢測c型肝炎病毒感染的方法
2023-11-11 06:26:02 1
一種檢測c型肝炎病毒感染的方法
【專利摘要】本發明涉及在活體外檢測生物樣品中的C型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括同時檢測HCV衣殼蛋白及針對所述衣殼蛋白的抗體，所述方法使用包括衍生自截短HCV衣殼的抗原性片段的肽來捕獲抗衣殼抗體。本發明還涉及用於捕獲抗衣殼抗體的肽及包括所述肽的試劑盒。
【專利說明】一種檢測C型肝炎病毒感染的方法
[0001] 本發明涉及C型肝炎病毒（HCV)感染的活體外檢測及衍生自病毒的衣殼蛋白的抗 原性肽用於此目的的用途。
【背景技術】
[0002] 人們早已認識到，C型肝炎病毒感染尤其在輸血中是令人擔心的健康問題。
[0003] 為降低輸血後的風險，需要在抗體出現之前及在汙染後儘可能快地檢測病毒本身 的存在。該介於汙染與血清轉化（即出現抗體）之間的時期被稱為"血清學窗口期"。
[0004] 為了找到一種簡單、靈敏、特異性、可再現、廉價且容易使用並且可自動進行大規 模篩選以首先檢測血清學窗口期期間的HCV抗原、然後監測患者在血清轉化後的血清學演 化的方法，已提出檢測抗HCV抗體以及檢測HCV抗原。
[0005] 然而，主要問題在於存在於血清中的抗HCV抗體與經標記的抗HCV抗體之間存在 幹擾。因此，出於檢測所給出抗體的目的，在固相上引入具有與被用於同時夾心（sandwich) 檢測抗原的經標記的抗體所識別的那些表位相同的表位的靶抗原將使得經標記的抗體不 可逆地固定在固相上，且因此使測試產生假陽性反應。
[0006] 在用於在同一固相上同時檢測抗HCV衣殼抗體及HCV衣殼抗原的系統中尤其如 此。因此，出於檢測抗HCV衣殼抗體的目的，在固相上沉積具有與被用於檢測衣殼抗原的經 標記的抗HCV衣殼抗體所識別的那些表位相同的表位的衣殼抗原可使得經標記的抗體固 定在固相上，且使測試產生假陽性反應。
[0007] 為了解決幹擾問題，申請EP1020727(先端生命科學研究所（AdvancedLife ScienceInstitute))提出用於同時測定HCV衣殼抗原及抗HCV衣殼抗體的方法（"組合 (Combo) "型測試），其中用針對衣殼表位的抗體捕獲且標記該抗原，所述衣殼表位與用於同 時捕獲且檢測抗衣殼抗體的衣殼表位不同。該申請給出代表性實施例，其中在以間接分析 夾心檢測抗原及抗體的同時分析中，為了檢測抗原，使用針對HCV衣殼的第100位胺基酸 (AA)至第130位胺基酸的序列的表位的第一（捕獲）抗體以及針對序列AA40-50的表位的 第二（檢測）抗體，並且為了檢測抗體，所使用的捕獲抗原就其本身而言含有序列AA1-42 及AA66-80。
[0008] 專利申請W001/96875 (CHIRON)尤其描述了採用N-月桂基肌氨酸作為洗滌劑來同 時檢測衣殼及抗NS3和NS4抗體的分析。其提及用於同時檢測衣殼抗原（夾心法）及抗衣 殼和抗非結構HCV蛋白抗體（夾心法，雙抗原）的分析。為捕獲抗原，使用兩種抗體cll-3 及cl1-7,這兩種抗體被認為可識別HCV衣殼的延長的N端部分（AA10-53)，並且為了檢測， 使用第三抗體cll-14,該第三抗體被認為可識別HCV衣殼的C端部分（AA120-130)。為了 檢測抗體，所使用的捕獲抗原是與超氧化物歧化酶（"S0D"）的片段融合的具有多個表位的 融合抗原，其含有抗原NS3、NS4、NS5及一系列來自若干HCV菌株的衣殼序列：帶有R47L突 變的AA9-53、AA64-88 及AA67-84。
[0009] 專利申請EP1251353 (Ortho-Clinical Diagnostics)描述了使用相同抗體來檢測 衣殼的"組合型完全"分析，但並未說明抗體的來源或其表位特異性。抗衣殼抗體通過以下 經修飾（通過誘變）的衣殼抗原來檢測：C22KSNV47、48(具有SOD的融合蛋白，其包括第47 和48位胺基酸缺失的衣殼序列AA10-99)或C22KSR47L(具有SOD的融合蛋白，其包括衣殼 序列AA10-99,且在第47位用亮氨酸替代精氨酸）。
[0010] 專利申請W02003/002749 (Abbott)描述了多種抗原及用於檢測HCV衣殼抗原的分 析。其以名稱"真實組合（RealCombo)"描述的唯一"組合型完全"分析採用被固定於固相 中的對應於衣殼的第11-28位胺基酸的生物素化肽來檢測抗衣殼抗體。為了檢測衣殼，其 採用在固相中的先端生命科學研究所抗體Cll-14(識別衣殼序列AA45-50)與經吖啶標記 的C11-10(識別衣殼序列AA32-36)的組合。因此，申請W003/002 749通過兩個明顯分開 即不重疊的衣殼位點（用於檢測抗體及抗AA32-36抗體的AA11-28,以及用於檢測抗原的 AA45-50)來捕獲衣殼抗原並捕獲抗衣殼抗體。
[0011]專利申請EPl 310 512 (Ortho-Clinical Diagnostics)描述了使用含有突變衣殼 序列的肽，從而消除了與用於檢測HCV感染的測試中所用的HCV特異性小鼠單克隆抗體結 合的可能性。
[0012] 專利申請W02003/095968中所描述的發明的作者通過結構修飾人為地使用於捕 獲抗體的靶抗原的某些表位有所不同。然後破壞由此修飾的表位。同時，用於捕獲和/或 檢測抗原的抗體就其本身而言被選擇成使其精確識別存在於患者抗原上的未經修飾的表 位，且從而使得其因此無法與不再具有這些相同表位的經修飾的抗原結合。由於表位不再 相同，用於捕獲和/或檢測HCV抗原的抗體與患者的抗體之間不再存在競爭。專利申請 W02003/095968更精確地描述了在至少兩個分開的表位位點處被突變的HCV衣殼肽，且尤 其描述了肽 1-75(G34-G44-G47)。
【發明內容】
[0013] 本發明人現提出甚至更有利的檢測HCV感染的方法。
[0014] 在避免幹擾問題的同時，該方法具有極佳靈敏度，允許早期檢測，同時容許監測患 者在血清轉化後的血清學演化。
[0015] 更精確而言，本發明提供了在活體外檢測生物樣品中的C型肝炎病毒（HCV)感染 的方法，其包括同時檢測HCV衣殼蛋白及針對所述衣殼蛋白的抗體，所述方法採用包括衍 生自截短HCV衣殼的抗原性片段的肽來捕獲抗衣殼抗體。
[0016] 因此，本發明的一個目標是在活體外檢測生物樣品中的C型肝炎病毒（HCV)感染 的方法，其包括同時檢測存在於生物樣品中的HCV衣殼蛋白及針對所述衣殼蛋白的抗體， 所述方法包括a)使生物樣品與針對所述衣殼蛋白的捕獲抗體及能夠捕獲存在於樣品中的 抗衣殼蛋白抗體的捕獲抗原接觸；b)在允許形成抗原-抗體複合物的條件下溫育混合物； c)檢測所形成的抗原-抗體複合物，這任選地採用能夠與捕獲的衣殼蛋白結合的經標記的 檢測抗體和/或任選地也採用能夠與針對捕獲的衣殼的抗體結合的經標記的檢測抗原；所 述方法的特徵在於所述捕獲抗原是包括衍生自HCV衣殼的至多第1位胺基酸至第44位氨 基酸的抗原性片段或由所述抗原性片段組成的肽，所述抗原性片段包括以下序列或由以下 序列組成：i)來自HCV衣殼蛋白的第6至37位胺基酸且在第33至36位的至少一個氨基 酸、且優選第34位的胺基酸處具有至少一個點突變的序列，或ii)後者的同源序列。
[0017] 本發明的另一個目標是包括所述抗原性片段的肽。
[0018] 本發明的另一個目標是用於檢測生物樣品中的HCV病毒感染的試劑盒，其包括所 述肽作為抗HCV衣殼抗體的捕獲抗原。
【具體實施方式】
[0019] 定義
[0020] 術語"C型肝炎病毒"或"HCV"在本文中涵蓋引起C型肝炎的病毒的所有菌株、所 有類型、亞型及基因型。本發明的方法實際上旨在檢測任何HCV感染，無論其來源及其基因 型如何。具體而言，這包括在歐洲、美國、日本等流行的病毒的熟知類型及亞型（即6種主 要基因型：1、2、3、4、5、6 及其亞型la、lb、3a等）。參見Stuyver等人（1994) ;Bukh(1995)。
[0021]HCV衣殼蛋白是具有191個胺基酸的蛋白質，其序列為SEQIDNO: 1 :
[0022] Imstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqivggvyllprrgprlgvratrktsersqprg
[0023] 61rrqpipkarqpegrawaqpgypwplygnegmgwagwllsprgsrpswgpsdprrrsrnlg
[0024] 121kvidtltcgfadlmgyiplvgaplggaaralahgvrvledgvnyatgnlpgcsfsifIla
[0025] 181llscltipasa
[0026] 除非另有說明，否則胺基酸定位於衣殼蛋白中（參考序列SEQIDN0:1)，該序列是 基因型1(亞型la、lb、lc)的共有序列。
[0027] 已鑑別出衣殼蛋白的若干表位。尤其已知定位於第16位胺基酸與第40位胺基酸 之間的表位。
[0028] 表述"至多第1位胺基酸至第44位胺基酸"意指具有至多44個胺基酸的肽不延 伸超出序列SEQIDNO: 1的第44位胺基酸，但可任選地縮短，前提是其含有第6-37位序列 (仍參考SEQIDNO: 1)。
[0029] 在本發明背景下，"生物樣品"優選由生物流體例如血液、血漿、血清、尿、腦脊液、 唾液等組成。
[0030] 術語"抗體"是指任何全抗體或抗體的功能片段，所述功能片段包括至少一個抗原 識別位點或由至少一個抗原識別位點組成，所述至少一個抗原識別位點允許所述抗體與抗 原性化合物的至少一個抗原決定簇結合。可提及片段Fab、Fab'、F(ab'）2以及鏈SCFv(單 鏈可變片段）、dsFv(雙鏈可變片段）等作為抗體片段的實例。這些功能片段尤其可通過遺 傳工程來獲得。
[0031]用於本發明背景下的單克隆抗體或單特異性多克隆血清是基於常規技術而產生， 其細節在稍後給出。
[0032] "捕獲抗體"意指優選固定在固相上的抗體或抗體的一部分，其能夠通過親和結合 來保留存在於生物樣品中的HCV抗原。
[0033] 生物樣品中抗體及抗原的存在通過特異性標記物來揭露。就抗原檢測而言，本發 明尤其構想了通過至少一種"檢測抗體"來檢測。所述經標記的"檢測抗體"能夠通過親和 結合、識別與捕獲抗體所識別的表位位點不同的表位位點來結合捕獲的抗原。就抗體檢測 而言，尤其可使用經標記的抗免疫球蛋白抗體或抗同種型抗體，例如間接ELISA形式中的 抗免疫球蛋白G抗體或夾心形式中的經標記的抗原。
[0034] 捕獲抗體和/或檢測抗體識別HCV衣殼蛋白的第33-36位部分的天然表位。
[0035] 術語"經標記"是指直接標記（經由酶、放射性同位素、螢光染料、發光化合物等） 及間接標記（例如，經由本身經直接標記的抗體或利用經標記的"親和對"試劑，例如但不 限於經標記的抗生物素蛋白-生物素對等）二者。
[0036] "捕獲抗原"意指優選固定在固相上的分離的抗原性片段，其能夠被抗HCV抗體識 別且能夠允許與後者親和結合。
[0037] "檢測抗原"意指經標記的抗原。其使得可通過競爭來檢測捕獲的抗原或通過常規 的抗原-抗體-抗原夾心技術（也稱為"雙抗原夾心"方法）來檢測抗體（Maiolini等人 (1978))。
[0038] 術語"特異性的"或"特異性地"在指抗體識別或特異性結合抗原時表示，抗體與 該抗原相互作用且實質上不與其它抗原相互作用，或者如果談及"特異性"識別表位則指接 近唯一地識別該表位。結合常數優選大於IO8Lmol'
[0039] 術語"同源物"是指包括衍生自HCV衣殼的至多44個胺基酸的抗原性片段的肽。 該抗原性片段包括與HCV衣殼蛋白的至多第1至44位胺基酸的序列不同的序列，該不同之 處在於一個或多個胺基酸的保守取代或在N末端（第1至5位胺基酸）和/或C末端（第 38至44位胺基酸）處的一個或多個胺基酸的缺失。
[0040] 捕獲並檢測抗體及抗原
[0041] 本發明中所使用的抗體是抗原的特異性抗體，且出於此原因為單克隆抗體或單特 異性多克隆抗體，即其僅特異性識別一個表位。
[0042] 本發明的方法更具體而言涉及抗衣殼抗體的檢測，且採用能夠固定存在於生物樣 品中的抗衣殼抗體的捕獲抗原。
[0043] 欲用於捕獲抗衣殼抗體的肽包括衍生自HCV衣殼的至多第1至44位胺基酸的抗 原性片段，所述抗原性片段包括HCV衣殼蛋白的第6至37位胺基酸的序列或後者的同源序 列。因此應理解，本發明的捕獲抗原缺少第45至191位胺基酸（其在HCV衣殼蛋白中通常 存在）。根據【具體實施方式】，可用作本發明捕獲抗原的肽的胺基酸序列包括32至44個氨基 酸或由32至44個胺基酸組成，例如由44個胺基酸的序列組成。
[0044] 肽在第33-36位序列中的至少一個胺基酸、且優選第34位胺基酸處具有至少一個 點突變。其可以是用任何非保守胺基酸取代。對於第34位胺基酸而言，優選使用不同於異 亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸殘基的胺基酸。優選選擇不帶電荷的胺基酸。 第34位胺基酸纈氨酸優選被甘氨酸取代。
[0045] 由於捕獲抗原性肽的突變，在樣品的經固定的抗原-抗衣殼抗體反應與樣品的經 固定的抗體-衣殼抗原反應之間不存在幹擾。
[0046] 根據優選實施方式，固定在固相上的捕獲抗體是針對衣殼蛋白的第33-36位天然 表位的抗體，而在cl)處經直接或間接標記的檢測抗體針對與存在於所述HCV衣殼蛋白的 第33至36位、更通常為第6至37位部分中的天然表位不同的表位。例如，其可以是針對 衣殼的第44-47位表位的抗體。
[0047] 根據另一優選實施方式，固定在固相上的捕獲抗體是針對與存在於所述HCV衣殼 蛋白的第33至36位、更通常為第6至37位部分中的天然表位不同的表位的抗體，例如其 可以是針對衣殼的第44-47位表位的抗體，而在cl)處經直接或間接標記的檢測抗體是針 對衣殼蛋白的第33-36位天然表位的抗體。
[0048] 根據【具體實施方式】，捕獲抗原是由HCV衣殼蛋白的第1至44位序列組成且在第34 位的胺基酸處具有點突變、優選為取代成甘氨酸的肽。
[0049] 因此，優選的實例是序列SEQIDNO:2的肽。
[0050] !Mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqivggg mYllprrgprl
[0051] 也可使用由如上文所定義的序列組成、但此外在N端或c端側截短1至5個氨基 酸的同源肽。因此，可使用肽6-37,其在第33-36位序列中的至少一個胺基酸、且優選第34 位胺基酸處具有點突變。其優選為序列SEQIDNO:3的肽。
[0052] 6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGGmYLL37
[0053] 本發明也包括與以上肽的不同之處僅為保守取代的肽。
[0054] 表述"保守取代"表示一個胺基酸殘基被另一個胺基酸殘基的任何替代而不改變 該肽的一般構象或抗原性。保守取代包括但不限於被具有相似性質（例如形狀、極性、氫鍵 合電位、酸度、鹼度、疏水性等）的胺基酸替代。具有相似性質的胺基酸是本領域技術人員 所熟知的。例如，精氨酸、組氨酸及賴氨酸是鹼性親水性胺基酸且可互換。按照相同方式， 疏水性胺基酸異亮氨酸可被亮氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸替代。可彼此替代的中性親水性氨 基酸包含天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸及蘇氨酸。本發明的"經取代"及"經修飾"意指相對 於在自然界中發現的胺基酸已經改變或修飾的胺基酸。
[0055] 因此，在本發明背景下，保守取代是一個胺基酸被另一個具有相似性質的胺基酸 取代。保守取代的實例在下表1中給出：
[0056] 表1.保守取代I
[0057]
【權利要求】
1. 一種在活體外檢測生物樣品中的C型肝炎病毒（HCV)感染的方法，其包括同時檢測 存在於所述生物樣品中的HCV衣殼蛋白及針對所述衣殼蛋白的抗體，所述方法包括a)使所 述生物樣品與針對所述衣殼蛋白的捕獲抗體及能夠捕獲存在於所述樣品中的抗衣殼蛋白 抗體的捕獲抗原接觸；b)在允許形成抗原-抗體複合物的條件下溫育混合物；c)檢測所形 成的抗原-抗體複合物，這任選地採用能夠與捕獲的衣殼蛋白結合的經標記的檢測抗體和 /或任選地也採用能夠與捕獲的抗衣殼抗體結合的經標記的檢測抗原；所述方法的特徵在 於所述捕獲抗原是包括衍生自所述HCV衣殼的至多第1位胺基酸至第44位胺基酸的抗原 性片段或由所述抗原性片段組成的肽，所述抗原性片段包括以下序列或由以下序列組成： i)來自所述HCV衣殼蛋白的第6至37位胺基酸且在第33至36位的至少一個胺基酸處具 有點突變的序列，或ii)後者的同源序列。
2. 權利要求1的方法，其中所述捕獲抗原是在第34位胺基酸處具有點突變的肽。
3. 權利要求2的方法，其中所述捕獲抗原是由所述HCV衣殼蛋白的第1至44位序列組 成且在第34位的胺基酸處具有點突變的肽。
4. 權利要求1至3中任一項的方法，其中第34位的胺基酸是甘氨酸殘基。
5. 權利要求1至4中任一項的方法，其中將所述捕獲抗體及所述捕獲抗原固定在固相 上。
6. 權利要求5的方法，其中所述固相還包括至少一種衍生自並非所述衣殼的HCV蛋白 的抗原，優選為NS3或NS4。
7. 權利要求1至6中任一項的方法，其中所述檢測抗體在抗原-抗體複合物形成後添 加至所述混合物。
8. 權利要求1至7中任一項的方法，其中使所述檢測抗體和/或所述檢測抗原與所述 捕獲抗體及所述捕獲抗原同時與所述生物樣品接觸。
9. 一種肽，其包括衍生自HCV衣殼的至多第1位胺基酸至第44位胺基酸的抗原性片 段或由所述抗原性片段組成，所述抗原性片段包括以下序列或由以下序列組成：來自所述 HCV衣殼蛋白的第6至37位胺基酸且在第33至36位的至少一個胺基酸處具有點突變的序 列，或ii)後者的同源序列。
10. 權利要求9的肽，其在第34位的胺基酸處具有點突變。
11. 權利要求10的肽，其由所述HCV衣殼蛋白的第1至44位序列組成，且在第34位的 胺基酸處具有點突變。
12. 權利要求9至11中任一項的肽，其中第34位的胺基酸是甘氨酸殘基。
13. -種偶聯肽，其包括權利要求9至12中任一項的肽，所述肽在其N末端共價結合至 間隔物。
14. 權利要求13的偶聯肽，其中所述間隔物是C-Hx，其中C是半胱氨酸且Hx是6-氨 基己酸。
15. 權利要求13和14中任一項的偶聯肽，其中如權利要求9至12中任一項所定義的 肽與其本身共價偶合或經由所述間隔物而具有攜載分子。
16. -種可用於檢測生物樣品中的HCV病毒感染的試劑盒，其包括如權利要求9至12 中任一項所定義的肽作為抗HCV衣殼抗體的捕獲抗原。
17. 權利要求16的試劑盒，其除了所述捕獲抗原外還包括用於檢測存在於所述生物樣 品中且與所述捕獲抗原複合的抗HCV抗體的構件，所述檢測構件優選是經標記的抗免疫球 蛋白抗體或抗同種型抗體。
18. 權利要求16和17中任一項的試劑盒，其包括 al)抗HCV衣殼抗體的捕獲抗原，其是如權利要求9至12中任一項所定義的肽； a2)優選以及抗非結構蛋白抗體的捕獲抗原，所述捕獲抗原包括非結構蛋白NS3、NS4 和/或NS5中的一些或全部， b)針對所述HCV衣殼蛋白的捕獲抗體； 將所述捕獲抗原及所述捕獲抗體固定在固相上；以及 cl)經標記的檢測抗體， c2) -種或多種抗免疫球蛋白抗體或任選地經標記的檢測抗原，所述檢測抗原是如權 利要求9至12中任一項所定義的肽。
19. 權利要求16至18中任一項的試劑盒，其包括：抗HCV衣殼抗體的捕獲抗體，其被 固定在固相上，針對所述衣殼蛋白的第33-36位天然表位；以及經直接或間接標記的檢測 抗體，其針對與存在於所述HCV衣殼蛋白的第33至36位、更通常為第6至37位部分中的 天然表位不同的表位。
20. 權利要求16至18中任一項的試劑盒，其包括：抗HCV衣殼抗體的捕獲抗體，其被 固定在固相上，針對與存在於所述HCV衣殼蛋白的第33至36位、更通常為第6至37位部 分中的天然表位不同的表位；以及經直接或間接標記的檢測抗體，其針對所述HCV衣殼蛋 白的第33-36位天然表位。
【文檔編號】G01N33/569GK104302660SQ201280063508
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2012年12月19日 優先權日:2011年12月20日
【發明者】斯特凡·加德勒, 弗朗索瓦·裡厄尼耶 申請人:博瑞創新公司