基於目標dna重複序列自身增強放大信號的dna電化學傳感器的製作方法

2023-12-01 02:07:21 2

專利名稱：基於目標dna重複序列自身增強放大信號的dna電化學傳感器的製作方法
技術領域：
本發明涉及基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器及其製備方法以及用於結核桿菌的快速檢測，屬於生物傳感技術領域。
背景技術：
目前，利用電化學與酶催化技術相結合構建的DNA電化學傳感器已得到廣泛的關注，並被應用於腫瘤等疾病的相關基因檢測研究。蛋白質控制組裝界面所構建的DNA電化學傳感器的製備方法具有較好的重複性，其原理為採用在金電極表面構建蛋白質控制組裝界面，使電極表面組裝一層球形的BSA分子層，在這些球形分子之間暴露出未被佔據的金位點，然後將探針有序地固定到暴露的金位點，從而有效控制探針的密度及其分布，使探針DNA與目標DNA雜交完全，再結合電化學酶聯安培放大技術對目標鏈進行檢測。基本原理為:(I)在電極表面組裝一層BSA分子層；(2)將捕獲探針組裝到BSA分子之間的有序間隙中；(3)捕獲探針與信號探針、目標DNA通過雜交形成「三明治」結構，在信號探針末端標記生物素，辣根過氧化物酶上修飾親和素，通過生物素與親和素的相互作用使酶結合到「三明治」結構上；(4)將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，在固定電位下測定TMB催化氧化產物的還原電流信號。如果所測序列與探針不能發生雜交，則無法形成「三明治」結構，即沒有酶結合到傳感器上，所以無法催化TMB的氧化，產生的電流信號很弱。因此通過信號強度大小便能實現對互補序列與錯配鹼基序列的識別和檢測。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種基於基因重複序列自身增強放大電信號的探針設計方法。本發明的第二個目的是提供一種基於基因重複序列自身增強放大電信號的重複性高的DNA電化學傳感器。本發明的第三個目的是提供一種基於基因重複序列自身增強放大電信號的DNA電化學傳感器對含有一段、兩段重複序列目標DNA的檢測方法。本發明的第四個目的是提供一種用於快速檢測結核桿菌的DNA電化學傳感器對結核分枝桿菌基因序列的檢測方法。本發明的目的是這樣實現的，所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器，包括電極、蛋白質、捕獲探針DNA、信號探針DNA、目標DNA和辣根過氧化物酶，電極採用金電極，蛋白質採用牛血清白蛋白，捕獲探針DNA採用5』端巰基修飾的單鏈DNA，信號探針DNA採用3』端生物素標記的單鏈DNA，目標DNA採用人工合成的含有一段重複序列或含有兩段重複序列的單鏈DNA，辣根過氧化物酶採用親和素標記的辣根過氧化物酶，其特徵是:在金電極表面有序組裝一層牛血清白蛋白分子層，在牛血清白蛋白分子之間的有序孔隙中組裝捕獲探針DNA，信號探針DNA與目標DNA中的重複序列發生充分雜交反應，形成穩定的雙鏈與單鏈交替排列的dsDNA-ssDNA-dsDNA-ssDNA-----ssDNA-dsDNA複合
物，使目標DNA結合上多個信號探針DNA，同時捕獲探針DNA與目標DNA中相互補的一段發生雜交反應，從而實現捕獲探針DNA對穩定複合物的識別，通過雜交反應即可在電極表面引入多個連接在信號探針上的生物素而形成末端修飾了生物素的信號探針DNA，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入連接在辣根過氧化物酶-親和素上的多個辣根過氧化物酶而形成末端修飾了親和素的辣根過氧化物酶。所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器，其特徵是:信號探針DNA採用結核桿菌基因重複序列的互補序列設計而成，則在雜交反應過程中，一個目標DNA中即可結合多個信號探針，進而結合多個酶，起到增強放大電流信號的效應，實現高靈敏基因檢測；所述的捕獲探針DNA為5 』 -CCGGATGATGGTGGT GCTGAAGGTTTCCGTTltl-(CH2)6-SH-3』，所述的信號探針 DNA 為 5』 -GTTTCCGTCC CCTCTCGGGGTTTTGGGTCTGACGAC-Biotin-3』，所述的含有一段重複序列的目標 DNA 為 5』-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCAGCATGTCGTCAGA CCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3，，所述的含有兩段重複序列的目標 DNA 為 5』 -A CGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCAGCATGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAACCCTTCGACGCCGGATTCGTGATCTCTTCCCGCGGA TAGGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3，。本發明所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器的製備方法，包括如下步驟:(I)蛋白質控制組裝界面的構建:將金電極浸泡在BSA溶液中，室溫下組裝後清洗，氮氣吹乾；(2)捕獲探針DNA的組裝:取捕獲探針DNA溶液，滴塗到經組裝蛋白質後的金電極表面，室溫放置後，衝洗電極表面，氮氣吹乾。所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器的製備方法，其特徵是:(I)蛋白質控制組裝界面的構建:將金電極浸泡在0.lwt%的BSA溶液中，在室溫下組裝15min後，用雙蒸水清洗，氮氣吹乾；(2)捕獲探針的組裝:取捕獲探針DNA溶液，滴塗到經組裝蛋白質後的金電極表面，室溫放置Ih後，以雙蒸水衝洗電極表面，氮氣吹乾。本發明所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器的檢測方法，包括以下步驟:(I)將目標DNA與50nmol/L信號探針DNA混合，配製成雜交溶液；(2)將製備好的傳感器放在步驟(I)所得到的雜交溶液中，在44° C下雜交60min後，取出用雙蒸水清洗，氮氣吹乾；(3)在電極表面滴加3μ I HRP-avidin酶溶液，室溫下反應30min，用含有0.05%Tween-20的PBS洗液攪拌清洗5min ；(4)將傳感器浸入到Iml含H2O2的TMB底物溶液中，以鉬絲電極為對電極，Ag/AgCl為參比電極,記錄電流-時間曲線。本發明所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器應用於對目標DNA的靈敏性檢測，其特徵是:在捕獲探針DNA檢測目標DNA時，
(I)當含一段重複序列的目標DNA與捕獲探針DNA及信號探針DNA發生雜交反應時，即可在電極表面引入一倍生物素，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入一倍辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，TMB在傳感器表面被一倍辣根過氧化物酶催化氧化，在OV電位下可測定到TMB催化氧化產物一倍的還原電流信號；(2)當含兩段重複序列的目標DNA與捕獲探針DNA及信號探針DNA發生雜交反應時，即可在電極表面引入兩倍生物素，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入兩倍辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，TMB在傳感器表面被兩倍辣根過氧化物酶催化氧化，在OV電位下可測定到TMB催化氧化產物兩倍的還原電流信號。所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器應用於對目標DNA的靈敏性檢測，其特徵是:當含兩段重複序列的目標DNA的濃度在0.0lpmol/L飛nmol/L範圍內，電流信號隨著目標序列濃度的增加而逐漸增大，檢測限為3.3fmol/L。本發明所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器用於基因序列特異性檢測，其特徵是:在捕獲探針DNA檢測目標DNA時，(I)當重複序列目標DNA與捕獲探針DNA及信號探針DNA互補時，發生雜交反應，即可在電極表面引入生物素，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，TMB在傳感器表面被辣根過氧化物酶催化氧化，在OV電位下可測定到TMB催化氧化產物的還原電流信號；(2)當重複序列目標DNA與捕獲探針DNA或信號探針DNA互補不發生雜交反應時，則無法在電極表面引入辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，在OV電位下無法測定到TMB催化氧化產物的還原電流信號。本發明的製備和檢測原理及檢測過程如圖1所示。為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:(一)探針的設計根據靶基因序列中選擇一段特異性高的序列(含30個鹼基)，將其互補序列設計為捕獲探針DNA ;將重複序列的互補序列設計為信號探針DNA。(二)蛋白質控制組裝探針識別界面的構建將金電極浸沒在牛血清白蛋白溶液中，在室溫下組裝後，用雙蒸水衝洗電極表面，氮氣吹乾。在蛋白質組裝界面上滴塗捕獲探針溶液，室溫下放置組裝後，以雙蒸水清洗電極界面，氮氣吹乾。(三)DNA雜交與檢測將含有一定濃度的信號探針DNA與含有一段重複序列的目標DNA的混合製備雜交溶液，將製備好的傳感器置於雜交溶液中進行DNA雜交。取出傳感器並用雙蒸水清洗傳感器界面，氮氣吹乾，在電極表面滴加辣根過氧化物酶-親和素溶液，室溫下反應，用含有Tween-20的磷酸鹽洗液攪拌清洗後，立即進行電化學檢測。將含有一定濃度的信號探針DNA與含有兩段重複序列的目標DNA的混合製備雜交溶液，將製備好的傳感器置於雜交溶液中進行DNA雜交。取出傳感器並用雙蒸水清洗傳感器界面，氮氣吹乾，在電極表面滴加辣根過氧化物酶-親和素溶液，室溫下反應，用含有Tween-20的磷酸鹽洗液攪拌清洗後，立即進行電化學檢測。(四)電化學檢測
以所製備的傳感器作為工作電極，鉬絲電極為對電極，Ag/AgCl為參比電極。將工作電極浸入到含過氧化氫的TMB底物溶液中，記錄電流時間曲線。本發明的優點為:1)本發明設計了一種新的方法，以目標基因的重複序列片段作為特異性目標DNA，設計出一種自身增強放大信號的新型三明治型DNA電化學傳感器對目標DNA進行檢測。重複序列在基因組中廣泛存在，在基因表達、調控和遺傳等方面起著重要的作用，同時具有高度多態性，即具有高度保守性，可用於區分多種不同目標基因。根據結核桿菌自身基因序列DR區的多個重複序列設計信號探針，使少量結核桿菌序列結合多個信號探針，從而結合多個酶放大電化學相應信號，大大提高了方法的靈敏度。2 )當目標DNA濃度相同時，含有兩段重複序列的檢測電流信號高於含有一段重複序列的檢測電流信號的兩倍，由實施例3、4、5的結果表明:本發明的方法所構建的新型DNA電化學傳感器具有目標DNA自身增強放大信號的效應，可實現對含有重複序列的目標基因的高靈敏檢測。3)本發明利用所構建的目標DNA自身增強放大電信號的新型DNA電化學傳感器對結核桿菌基因序列進行定量檢測，觀察電流值隨目標DNA濃度的變化。在0.0lpmol/Llnmol/L範圍內，電流信號隨著含有兩個重複序列的目標DNA濃度的增加而逐漸增大，檢測限為3.3fmol/L0結果表明，這種目標DNA自身增強放大電信號的新型DNA電化學傳感器對互補基因序列識別具有較高的靈敏度。


圖1為基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的新型DNA電化學傳感器的原理圖。圖2為新型DNA電化學傳感器檢測含有一段重複序列的目標DNA有無雜交反應圖。圖3A為目標DNA濃度均為5nmol/L時，檢測電流值與含有兩段重複序列的目標DNA濃度的關係圖；圖中:T1表示為含有一個重複序列的目標DNA ;T2表示為含有兩個重複序列的目標DNA。圖3Β為目標DNA濃度均為lnmol/L時，檢測電流值與含有兩段重複序列的目標DNA濃度的關係圖；圖中:T1表示為含有一個重複序列的目標DNA ;T2表示為含有兩個重複序列的目標DNA。圖3C為目標DNA濃度均為lOOpmol/L時，檢測電流值與含有兩段重複序列的目標DNA濃度的關係圖；圖中:T1表示為含有一個重複序列的目標DNA ;T2表示為含有兩個重複序列的目標DNA。圖4為目標基因重複序列自身增強放大電化學響應信號圖。
具體實施例方式如圖1所示，本發明所述的基於目標基因重複序列自身增強放大信號的新型DNA電化學傳感器，包括電極、牛血清白蛋白2、捕獲探針DNA3、信號探針DNA、目標DNA和辣根過氧化物酶-親和素，辣根過氧化物酶-親和素指辣根過氧化物酶採用親和素標記，電極優選金電極1，捕獲探針DNA優選巰基修飾的單鏈DNA，信號探針DNA優選生物素修飾的單鏈DNA，目標DNA採用含有重複序列的目標DNA4，重複序列的目標DNA4優選人工合成的含有一段重複序列或含有兩段重複序列的單鏈DNA，人工合成的含有一段重複序列或含有兩段重複序列的單鏈DNA為採用現有技術合成的、人工合成技術為本領域的技術人員能實現的技術，先在金電極表面有序組裝一層牛血清白蛋白(BSA)分子層，利用蛋白質分子之間的有序孔隙組裝捕獲探針。將目標DNA與信號探針DNA按一定濃度比混合製備雜交溶液。將捕獲探針DNA置於雜交溶液中，在一定溫度下進行雜交反應，在此過程中，信號探針DNA與目標DNA中的重複序列發生充分雜交反應，形成穩定的雙鏈與單鏈交替排列的
dsDNA-ssDNA-dsDNA-ssDNA-----ssDNA-dsDNA複合物，使目標DNA結合上多個信號探針DNA，
同時，捕獲探針DNA與目標DNA中相互補的一段發生雜交反應，從而實現捕獲探針DNA對穩定複合物的識別，即對目標DNA的識別。通過雜交反應即可在電極表面引入多個連接在信號探針上的生物素即圖1中的末端修飾了生物素的信號探針DNA5，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入連接在辣根過氧化物酶-親和素上的多個辣根過氧化物酶即圖1中的末端修飾了親和素的辣根過氧化物酶6。將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，TMB即可在傳感器表面通過多個辣根過氧化物酶的催化放大氧化還原反應，在固定電位下測定TMB催化氧化產物的還原電流信號，則該電流信號得到放大，且信號大小與目標DNA的濃度相關。實施例1:
基於基因重複序列自身增強放大電信號的DNA電化學傳感器的製備步驟如下:(I)金電極於Piranha溶液(30wt%的H2O2與濃度98wt%的濃H2SO4,以1:3的體積比混合)中室溫靜置5min,用去離子水超聲清洗2次,每次5min,然後分別用0.3μηι、0.05 μ mAl2O3和雙蒸水的混合物拋光至鏡面，依次用乙醇、雙蒸水超聲清洗。將超聲好的電極置於0.5M H2SO4中，在(Tl.6V電位範圍循環伏安掃描至穩定，用雙蒸水清洗，N2吹乾後待用；(2)將步驟(I)處理好的裸金電極浸沒在0.lwt°/c^^BSA溶液中，在室溫下組裝15min後，用雙蒸水清洗，氮氣吹乾，取4μ I捕獲探針DNA (5，-CCGGA TGATG GTGGT GCTGAAGGTT TCCGT T1Q-(CH2)6-SH-3』)溶液(I μ mol/L，寡核苷酸，由寶生生物工程有限公司合成)，滴塗到電極表面，室溫放置Ih後，以雙蒸水衝洗電極表面，氮氣吹乾。實施例2:基於基因重複序列自身增強放大電信號的DNA電化學傳感器對目標DNA的檢測步驟如下:(I)將信號探針 DNA (5，-GTTTC CGTCC CCTCT CGGGG TTTTG GGTCT GACGAC-Biotin-3』)(寡核苷酸，由寶生生物工程有限公司合成)與含有一段重複序列的目標DNA(5，-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCAGCATGTCG TCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3』 )在雜交緩衝溶液(由 IOmmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4 和 lmol/LNaCl 配製，並用H3PO4和NaOH調節pH至7.40，實驗用水為雙蒸水)中混合，配製成雜交溶液。(2)實施例1獲得的固定在電極表面的捕獲探針DNA (5，-CCGGA TGATG GTGGTGCTGA AGGTT TCCGT Tltl-(CH2) 6-SH_3 』 )與步驟(I)所得雜交溶液在 44°C水浴雜交 60min，形成雙鏈DNA，依次用pH7.40的PBS緩衝液，雙蒸水清洗，氮氣吹乾。在電極表面滴加3 μ IHRP-avidin溶液(1.0U/mL)，室溫下反應30min，用含有0.05wt%Tween_20的PBS洗液攪拌清洗5min後，立即進行電化學檢測；(3)將步驟(2)製得的電極浸入到Iml TMB底物溶液(K-blue，Neogencorporation)中，以鉬絲電極為對電極,Ag/AgCl為參比電極,記錄電流-時間曲線(初始電位:0伏；採樣間隔:0.1秒；採樣時間:100秒)。測定結果見圖2。從圖2結果可以看出利用所構建的新型DNA電化學傳感器對含有一段重複序列的目標DNA (lOnmol/L)的雜交反應進行檢測。(a)為不含有目標DNA時傳感器的電流相應信號(109.6nA), (b)為含有目標DNA時傳感器的電流相應信號(3240nA)。結果表明，所構建的新型DNA電化學傳感器可用於識別目標DNA序列。實施例3:基於基因重複序列自身增強放大電信號的DNA電化學傳感器對目標DNA的檢測步驟如下:(I)將信號探針 DNA (5，-GTTTC CGTCC CCTCT CGGGG TTTTG GGTCT GACGAC-Biotin-3』 ) (50nmol/L寡核苷酸，由寶生生物工程有限公司合成)與含有兩段重複序列的目標 DNA (5nmol/L, 5，-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCAGC ATGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAACCCTTCGACGCCGGATTCGTG ATCTCTTCCCGCGGATAGGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3』)在雜交緩衝溶液(由 10mmol/L Na2HPO4-NaH2POjP lmol/L NaCl配製，並用H3PO4和NaOH調節pH至7.40，實驗用水為雙蒸水)中混合，配製成雜交溶液。(2)實施例1獲得的固定在電極表面的捕獲探針DNA (5，-CCGGA TGATG GTGGTGCTGA AGGTT TCCGT Tltl-(CH2) 6-SH_3 』 )與步驟(I)所得雜交溶液在 44°C水浴雜交 60min，形成穩定的雙鏈與單鏈交替的dsDNA-ssDNA-dsDNA-ssDNA-dsDNA複合物，用雙蒸水清洗電極，氮氣吹乾。在電極表面滴加3μ I HRP-avidin溶液(1.0U/mL)，室溫下反應30min，用含有0.05wt%Tween-20的PBS洗液攪拌清洗5min後，立即進行電化學檢測；(3)將步驟(2)製得的電極浸入到Iml TMB底物溶液(K-blue，Neogencorporation)中，以鉬絲電極為對電極,Ag/AgCl為參比電極,記錄電流-時間曲線(初始電位:0伏；採樣間隔:0.1秒；採樣時間:100秒)。測定結果見圖3A。從圖3A結果可以看出，當目標DNA濃度均為5nmol/L時，含有兩段重複序列與含有一段重複序列的檢測電流信號分別為5576nA、2582nA ;結果表明，當目標DNA濃度相同時，含有兩段重複序列的檢測電流信號高於含有一段重複序列的檢測電流信號的兩倍。實施例4:基於基因重複序列自身增強放大電信號的DNA電化學傳感器對目標DNA的檢測步驟如下:(I)將信號探針 DNA (5，-GTTTC CGTCC CCTCT CGGGG TTTTG GGTCT GACGAC-Biotin-3』 ) (50nmol/L，寡核苷酸，由寶生生物工程有限公司合成)與含有兩段重複序列的目標 DNA (lnmol/L,5，-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCAG CATGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAACCCTTCGACGCCGGATTCGTGATCTCTT CCCGCGGATAGGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3』)在雜交緩衝溶液(由 10mmol/L Na2HPO4-NaH2POjP lmol/LNaCl配製，並用H3PO4和NaOH調節pH至7.40，實驗用水為雙蒸水)中混合，配製成雜交溶液。(2)實施例1獲得的固定在電極表面的捕獲探針DNA (5，-CCGGA TGATG GTGGTGCTGA AGGTT TCCGT Tltl-(CH2) 6-SH_3 』 )與步驟(I)所得雜交溶液在 44°C水浴雜交 60min，形成穩定的雙鏈與單鏈交替的dsDNA-ssDNA-dsDNA-ssDNA-dsDNA複合物，用雙蒸水清洗電極，氮氣吹乾。在電極表面滴加3μ I HRP-avidin溶液(1.0U/mL)，室溫下反應30min，用含有0.05wt%Tween-20的PBS洗液攪拌清洗5min後，立即進行電化學檢測；(3)將步驟(2)製得的電極浸入到Iml TMB底物溶液(K-blue，Neogencorporation)中，以鉬絲電極為對電極,Ag/AgCl為參比電極,記錄電流-時間曲線(初始電位:0伏；採樣間隔:0.1秒；採樣時間:100秒)。測定結果見圖3B。從圖3B結果可以看出，當目標DNA濃度均為lnmol/L時，含有兩段重複序列與含有一段重複序列的檢測電流信號分別為2534nA、1260nA ;結果表明，當目標DNA濃度相同時，含有兩段重複序列的檢測電流信號高於含有一段重複序列的檢測電流信號的兩倍。實施例5:基於基因重複序列自身增強放大電信號的DNA電化學傳感器對目標DNA的檢測步驟如下:(I)將信號探針 DNA (5，-GTTTC CGTCC CCTCT CGGGG TTTTG GGTCT GACGAC-Biotin-3』 ) (50nmol/L，寡核苷酸，由寶生生物工程有限公司合成)與含有兩段重複序列的目標 DNA (100pmol/L，5，-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCA GCATGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAACCCTTCGACGCCGGATTCG TGATCTCTTCCCGCGGATAGGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3』 )在雜交緩衝溶液(由 lOmmol/L.Na2HPO4-NaH2PO4 和lmol/L NaCl配製，並用H3PO4和NaOH調節pH至7.40，實驗用水為雙蒸水)中混合，配製成雜交溶液。(2)實施例1獲得的固定在電極表面的捕獲探針DNA (5，-CCGGA TGATG GTGGTGCTGA AGGTT TCCGT Tltl-(CH2) 6-SH_3 』 )與步驟(I)所得雜交溶液在 44°C水浴雜交 60min，形成穩定的雙鏈與單鏈交替的dsDNA-ssDNA-dsDNA-ssDNA-dsDNA複合物，用雙蒸水清洗電極，氮氣吹乾。在電極表面滴加3μ I HRP-avidin溶液(1.0U/mL)，室溫下反應30min，用含有0.05wt%Tween-20的PBS洗液攪拌清洗5min後，立即進行電化學檢測；(3)將步驟(2)製得的電極浸入到Iml TMB底物溶液(K-blue，Neogencorporation)中，以鉬絲電極為對電極,Ag/AgCl為參比電極,記錄電流-時間曲線(初始電位:0伏；採樣間隔:0.1秒；採樣時間:100秒)。測定結果見圖3C。從圖3C結果可以看出，當目標DNA濃度均為lOOpmol/L時，含有兩段重複序列與含有一段重複序列的檢測電流信號分別為1340nA、618.2nA。結果表明，當目標DNA濃度相同時，含有兩段重複序列的檢測電流信號高於含有一段重複序列的檢測電流信號的兩倍。以上實施例3、4、5表明:此方法所構建的新型DNA電化學傳感器具有目標DNA自身增強放大信號的效應，可實現對含有重複序列的目標基因的高靈敏檢測。實施例6:基於基因重複序列自身增強放大電信號的DNA電化學傳感器的製備以及對重複序列目標DNA的檢測步驟如下:(I)將信號探針 DNA (5，-GTTTC CGTCC CCTCT CGGGG TTTTG GGTCT GACGAC-Biotin-3』 ) (50nmol/L,寡核苷酸，由寶生生物工程有限公司合成)與不同濃度(0.01pmol/L 5nmol/L)含有兩段重複序列的目標 DNA (5，-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCC GGCGCCTCAGCTCAGCATGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAACCCTTCGACGCCGGATTCGTGATCTCTTCCCGCGGATAGGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3』 )在雜交緩衝溶液(由IOmmoI/L Na2HPO4-NaH2PO4 和 lmol/LNaCl 配製，並用 H3PO4 和 NaOH 調節 pH 至 7.40，實驗用水為雙蒸水)中混合，配製成雜交溶液。(2 )實施例1獲得的固定在電極表面的捕獲探針DNA( 5 』 -CCGGA TGATG GTGGTGCTGAAGGTT TCCGT Tltl-(CH2) 6_SH_3』)與步驟(I)所得雜交溶液在44°C水浴雜交60min，形成穩定的雙鏈與單鏈交替的dsDNA-ssDNA-dsDNA-ssDNA-dsDNA複合物，用雙蒸水清洗電極，氮氣吹乾。在電極表面滴加3μ I HRP-avidin溶液(1.0U/mL)，室溫下反應30min，用含有0.05wt%Tween-20的PBS洗液攪拌清洗5min後，立即進行電化學檢測；(3)將步驟(2)製得的電極浸入到Iml TMB底物溶液(K-blue，Neogencorporation)中，以鉬絲電極為對電極,Ag/AgCl為參比電極,記錄電流-時間曲線(初始電位:0伏；採樣間隔:0.1秒；採樣時間:100秒)。結果見圖4。從圖4結果可以看出，利用所構建的目標DNA自身增強放大電信號的新型DNA電化學傳感器對結核桿菌基因序列進行定量檢測，觀察電流值隨目標DNA濃度的變化。在
0.0lpmol/Llnmol/L範圍內，電流信號隨著含有兩個重複序列的目標DNA濃度的增加而逐漸增大，檢測限為3.3fmol/L。結果表明，這種目標DNA自身增強放大電信號的新型DNA電化學傳感器對互補基因序列識別具有較高的靈敏度。
權利要求
1.一種基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器,包括電極、蛋白質、捕獲探針DNA、信號探針DNA、目標DNA和辣根過氧化物酶，電極採用金電極，蛋白質採用牛血清白蛋白，捕獲探針DNA採用5』端巰基修飾的單鏈DNA，信號探針DNA採用3』端生物素標記的單鏈DNA，目標DNA採用人工合成的含有一段重複序列或含有兩段重複序列的單鏈DNA，辣根過氧化物酶採用親和素標記的辣根過氧化物酶，其特徵是:在金電極表面有序組裝一層牛血清白蛋白分子層，在牛血清白蛋白分子之間的有序孔隙中組裝捕獲探針DNA，信號探針DNA與目標DNA中的重複序列發生充分雜交反應，形成穩定的雙鏈與單鏈交替排列的dsDNA-ssDNA-dsDNA-ssDNA-----ssDNA-dsDNA複合物，使目標DNA結合上多個信號探針DNA,同時捕獲探針DNA與目標DNA中相互補的一段發生雜交反應，從而實現捕獲探針DNA對穩定複合物的識別，通過雜交反應即可在電極表面引入多個連接在信號探針上的生物素而形成末端修飾了生物素的信號探針DNA (5)，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入連接在辣根過氧化物酶-親和素上的多個辣根過氧化物酶而形成末端修飾了親和素的辣根過氧化物酶(6)。
2.根據權利要求1所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器，其特徵是:信號探針DNA採用結核桿菌基因重複序列的互補序列設計而成，則在雜交反應過程中，一個目標DNA中即可結合多個信號探針，進而結合多個酶，起到增強放大電流信號的效應，實現高靈敏基因檢測；所述的捕獲探針DNA為5』-CCGGATGATGGTGGTGCTGAAGGTTTCCGT T10- (CH2) 6-SH-3，，所述的信號探針 DNA 為 5』 -GTTTCCGTCCCCTCTCGGGGTTTTGGGTCTGACGAC-Biotin-3，， 所述的含有一段重複序列的目標 DNA 為 5』-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCAGCATGTCGTCAGA CCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3，，所述的含有兩段重複序列的目標DNA 為 5，-ACGGAAACCTTCAGCACCACCATCATCCGGCGCCTCAGCTCAGCATGTCGTCAGACCCA AAACCCCGAGAGGGGACGGAAACCCTTCGACGCCGGATTCGTGATCTCTTCCCGCGGATAGGTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC-3，。
3.權利要求1所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器的製備方法，包括如下步驟: (1)蛋白質控制組裝界面的構建:將金電極浸泡在BSA溶液中，室溫下組裝後清洗，氮氣吹乾； (2)捕獲探針DNA的組裝:取捕獲探針DNA溶液，滴塗到經組裝蛋白質後的金電極表面，室溫放置後，衝洗電極表面，氮氣吹乾。
4.根據權利要求3所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器的製備方法，其特徵是: Cl)蛋白質控制組裝界面的構建:將金電極浸泡在0.lwt%的BSA溶液中，在室溫下組裝15min後,用雙蒸水清洗,氮氣吹乾； (2)捕獲探針的組裝:取捕獲探針DNA溶液，滴塗到經組裝蛋白質後的金電極表面，室溫放置Ih後，以雙蒸水衝洗電極表面，氮氣吹乾。
5.權利要求1所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器的檢測方法或按權利要求2或3製備方法所製備的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器的檢測方法，包括以下步驟:(1)將目標DNA與50nmol/L信號探針DNA混合，配製成雜交溶液； (2)將製備好的傳感器放在步驟(I)所得到的雜交溶液中，在44°C下雜交60min後，取出用雙蒸水清洗，氮氣吹乾； (3)在電極表面滴加3μ I HRP-avidin酶溶液，室溫下反應30min，用含有·0.05%Tween-20的PBS洗液攪拌清洗5min ； (4)將傳感器浸入到Iml含H2O2的TMB底物溶液中，以鉬絲電極為對電極，Ag/AgCl為參比電極，記錄電流-時間曲線。
6.權利要求1所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器或按權利要求2或3製備方法所製備的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器應用於對目標DNA的靈敏性檢測，其特徵是:在捕獲探針DNA檢測目標DNA時， (1)當含一段重複序列的目標DNA與捕獲探針DNA及信號探針DNA發生雜交反應時，即可在電極表面引入一倍生物素，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入一倍辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，TMB在傳感器表面被一倍辣根過氧化物酶催化氧化，在OV電位下可測定到TMB催化氧化產物一倍的還原電流信號； (2)當含兩段重複序列的目標DNA與捕獲探針DNA及信號探針DNA發生雜交反應時，即可在電極表面引入兩倍生物素，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入兩倍辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，TMB在傳感器表面被兩倍辣根過氧化物酶催化氧化，在OV電位下可測定到TMB催化氧化產物兩倍的還原電流信號。
7.根據權利要求6所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器應用於對目標DNA的靈敏性檢測，其特徵是:當含兩段重複序列的目標DNA的濃度在0.01pmol/L^5nmol/L範圍內，電流信號隨著目標序列濃度的增加而逐漸增大，檢測限為·3.3fmol/L。
8.權利要求1所述的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器或按權利要求2或3製備方法所製備的基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器用於基因序列特異性檢測，其特徵是:在捕獲探針DNA檢測目標DNA時， (1)當重複序列目標DNA與捕獲探針DNA及信號探針DNA互補時，發生雜交反應，即可在電極表面引入生物素，利用生物素與親和素的相互作用，即可引入辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，TMB在傳感器表面被辣根過氧化物酶催化氧化，在OV電位下可測定到TMB催化氧化產物的還原電流信號； (2)當重複序列目標DNA與捕獲探針DNA或信號探針DNA互補不發生雜交反應時,則無法在電極表面引入辣根過氧化物酶；將傳感器置於含有底物TMB和H2O2的測定溶液中，在OV電位下無法測定到TMB催化氧化產物的還原電流信號。
全文摘要
本發明公開一種基於目標DNA重複序列自身增強放大信號的DNA電化學傳感器，通過所檢測目標鏈的重複序列片段設計信號探針，使得結合到目標序列上的信號探針的量發生擴增，形成複合物，當電極表面的捕獲探針與目標序列雜交時，擴增的信號探針則被結合到電極表面，信號探針末端標記的生物素與辣根過氧化物酶上修飾的親和素的親和作用，使多個酶結合到「三明治」結構上，最後通過酶的高效催化作用，催化H2O2氧化TMB，氧化產物在電極上產生放大了的還原電流信號，由電流信號大小判斷所檢測目標DNA的濃度。本實驗利用重複序列目標鏈自身增強放大信號的特點，實驗對含有兩段重複序列的目標鏈進行檢測，該方法具有較高的靈敏度。
文檔編號G01N27/26GK103175873SQ20131003133
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月27日 優先權日2013年1月27日
發明者洪國粦, 劉銀環, 陳偉, 林新華, 章濤 申請人:福州市第二醫院, 洪國粦