一種人腫瘤壞死因子TNF－α突變體的生產方法
2023-12-05 17:58:21 3
專利名稱：一種人腫瘤壞死因子TNF－α突變體的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明提供了一種人腫瘤壞死因子TNF-α突變體序列，及其生產方法，以及有關的表達載體與工程細胞的構建、重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的表達和純化工藝。
背景技術：
人腫瘤壞死因子α(human tumornecrosis factor-α，hTNF-α)，又稱惡液質素，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，是殺傷腫瘤細胞活性最強的一種細胞因子。
人的TNF-α基因長約2.76kb，由4個外顯子和3個內含子組成，人TNF-α前體由233個胺基酸殘基組成，含76個胺基酸殘基的信號肽，切除信號肽後成熟型TNF-α為157胺基酸殘基，分子量為17kDa，非糖基化蛋白，第69位和101位兩個半胱氨酸形成分子內二硫鍵。TNE-α發揮生物學效應的天然形式是同源的三聚體。
TNF-α在免疫和非免疫系統中發揮著重要的作用，具有抗感染、抗腫瘤、調節睡眠和促進發育等作用，其中最引人注目的是，它能特異性的殺死腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞增殖，而不損傷正常細胞，可能是至今所知抗癌劑中作用最強的。尤其是在和幹擾素等其它抗腫瘤細胞因子合用時，能發揮出更好的效果，因此，TNF-α是有希望的天然抗癌因子之一。而且它還可刺激其他細胞因子合成。
然而目前國內外普遍使用的是用大腸桿菌生產的基因工程重組產品，由於大腸桿菌含有內毒素，而且重組蛋白往往形成包涵體，下遊工藝複雜，成本較高而其活性往往偏低。
本發明系統提供了一種高效生產重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的方法。通過優化編碼重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的核苷酸序列，採用新型畢赤酵母表達體系胞內表達人腫瘤壞死因子TNF-α突變體，通過優化改進發酵工藝，提高重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的表達水平，同時簡便純化工藝，獲得高表達、高得率、高活性、極具產業化價值的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體。
發明內容
本發明的目的就是提供一種高效簡便的生產重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的方法。
本發明的另一目的就是提供重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的編碼序列以及用於該方法的表達載體及工程細胞。
在本發明的第一方面，就是提供了一種優化的編碼重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列編碼SEQ IDNO2所示的胺基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種表達載體，含有權利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優選例中，所述的表達載體是pPIC9K/nhTNF-α。
在本發明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特徵在於，整合有權利要求3所述的表達載體。
在另一優選例中，所述的工程細胞是畢赤酵母(Pichia Pastoris)。
在本發明的另一優選例中，所述的畢赤酵母宿主細胞的基因組中整合有2-30拷貝的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體基因編碼序列。
在本發明的另一優選例中，所述的畢赤酵母工程細胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在本發明的第四方面，提供了一種生產重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達條件下，培養如權利要求3所述的宿主細胞，從而胞內表達出人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白；較佳地，所述的宿主細胞是畢赤酵母。
b)分離純化出表達的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白。在本發明的另一優選例中，所述的步驟(a)的培養條件包括培養分為培養階段和誘導階段，培養階段培養菌液濃度達到OD600為40-200，誘導時間為12-100hr，發酵及誘導溫度保持在25-32℃，微量元素的量為0.1-2ml/L，誘導期的pH值為3-10，誘導期甲醇濃度控制在0.1-5％。
在本發明的另一優選例中，誘導過程還可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白腖(peptone)、胰蛋白腖(Tryptone)、精氨酸等作為保護劑。
在本發明的另一優選例中，所述的步驟(b)包括步驟(i)對發酵菌體超聲或高壓破碎後，離心獲得上清；(ii)通過鹽析和/或超濾進行初步純化後，或直接層析純化，所述的層析選自陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、及其組合。
在本發明的另一優選例中，菌體破碎後上清經SP Sepharose陽離子交換柱以及Q Sepharose陰離子交換柱以後得到純度大於95％、得率在50％以上的純品。
圖1是pPIC9k/nhTNF-α表達質粒的構建路線圖。
具體實施例方式
本發明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優化設計，將優化後的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體編碼序列(SEQ ID NO1)轉入甲醇利用型畢赤酵母(P.pastoris)，從而實現了人腫瘤壞死因子TNF-α突變體高效表達，並且優化了發酵與純化工藝。在此基礎上完成了本發明。
本發明根據人腫瘤壞死因子TNF-α天然成熟肽序列，對其進行改造，N端缺失7個胺基酸，將Pro8Ser9Asp10換成ArgLysArg，將C末端157位的Leu換成Phe，突變後胺基酸序列見SEQ ID NO2，然後按密碼子偏愛性，在不改變胺基酸序列的條件下，全基因合成重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的編碼序列，將該基因克隆到pUC19中測序驗證後，用分子克隆的常規方法，克隆入表達載體pPIC9K，轉化、整合入P.pastoris宿主細胞染色體，通過施加抗生素篩選出多拷貝整合的轉化細胞，進而篩選出高表達工程細胞。搖瓶試驗表明，誘導24小時後，表達蛋白佔總蛋白30％以上，表達水平1g/L以上。根據其消耗甲醇的速度，判斷此工程細胞株為Mut+。
在獲得工程細胞後，便可在適合的條件下培養工程細胞。在本發明中，工程菌表達的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體發酵條件沒有特別限制。可以採用本領域常規的發酵條件。例如，合適的培養基包括(但不限於)以下組成(1)氮源含有機氮源和無機氮源，其中有機氮源如蛋白腖、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(2)無機鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩衝體系濃度20-200mM，pH5-10；Mg2+鹽0-5mM。
(3)在培養基中添加維生素B1作為補充維生素，濃度1～1000PPM。
(4)根據M9培養基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(5)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是單一碳源，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
為大規模獲得重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體，需要在發酵罐中進行表達培養。本發明研究了中試發酵工藝，優化後的表達水平達到10g/L在發酵表達後，對表達的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白進行分離。通常，發酵樣品先以離心方式獲得菌體。然後超聲破碎，離心獲得上清，然後進行初步純化和層析包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
經不同層析過程比較，優化的純化方法包括1.對發酵菌體通過超聲和/或高壓方式破菌後，離心獲得上清；2.通過超濾進行初步純化後，或直接通過陰陽離子交換層析方法，從而得到純度達到95％的純品。
純品純度95％以上，得率約4g/L發酵液。
用MTT法對純品的細胞毒活性進行了檢測，以50％細胞死亡為1IU，其比活性約6.8X107IU/mg。
純化後重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體可用常規技術製成各種劑型。
在本發明的一個實例中，構建了生產重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的P.pastoris酵母表達工程細胞，甲醇誘導，胞內高水平表達。
在本發明的另一個實例中，經過發酵工藝的優化，進一步提高了重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的表達量。
在本發明的另一個實例中，通過優化純化工藝，純化後可得到純品4g/L。
純化後原液加入適當輔料，製成重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的注射用粉針劑。初步穩定性試驗表明，該粉針劑穩定。
中試研究表明，產品製造工藝穩定，操作簡單，周期短，成本低，每升發酵液可獲得重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體純品4g，比活約5×107IU/mg。適合產業化生產。
本發明的優點在於(1)優化後的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白基因非常適合在畢赤酵母中表達，具有高表達、高穩定的特點。
(2)通過控制關鍵的發酵工藝條件，使表達水平達到10g/L。
(3)優化了純化工藝，回收率高。由於簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使得大規模生產重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體成為可能。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1表達質粒的構建和高表達工程菌株的獲得根據人腫瘤壞死因子TNF-α天然成熟肽胺基酸序列，對其進行改造，N端缺失7個胺基酸，將Pro8Ser9Asp10換成ArgLysArg，將C末端157位的Leu換成Phe，突變後胺基酸序列見SEQ ID NO2，按密碼子偏愛性，在不改變胺基酸序列的條件下，全基因合成編碼人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的目的基因序列，將該基因序列克隆到pUC19中並測序驗證。
表達載體構建方法見圖1。通過PCR擴增得到目的人腫瘤壞死因子TNF-α基因，用BamHI+EcoRI雙酶切(MBI，2*TangoTM，37℃)PCR產物及pPIC9k質粒(購自Invitrogen公司)。將兩個片段用T4DNA連接酶進行連接，連接產物轉化進入大腸桿菌DH5α(購自Promega公司)，在含有氨苄青黴素的LB平板上挑選克隆，小量製備質粒，通過雙酶切/PCR鑑定篩選出陽性克隆，再經測序驗證。獲得含有人腫瘤壞死因子TNF-α的重組質粒pPIC9K/hTNF-α(人腫瘤壞死因子α)。
表達質粒pPIC9K/hTNF-α經測序驗證後，用Sal I酶切線性化，電穿孔法轉化進入畢赤酵母GS115(購自Promega公司)，塗於MD平板上於30℃培養至有轉化子長出，再用點種法鑑定酵母轉化子的G418抗性。依次用含G418濃度為1、2、3、4mg/mL的平板篩選高G418抗性轉化子，並進行小搖表達篩選得到TNF-α高表達的工程酵母菌株。根據其消耗甲醇的速度，判斷此工程細胞株為Mut+。
實施例2不同誘導時間對表達水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養17-20hr；按1∶10的比例二級接種於50ml培養基的500ml三角燒瓶中(每個條件有副管)，培養24hr左右，1％甲醇誘導，每隔12小時取樣，同時測定OD。共誘導120hr。誘導前、誘導不同時間樣品檢測SDS-PAGE。
實驗結果表明在搖瓶水平表達TNF-α的最佳誘導時間在24-96hr之間，最佳誘導時間在36-72hr。
實施例3誘導階段添加不同蛋白保護劑對表達水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養17-20hr；按1∶10的比例二級接種於250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養4~8hr左右，上罐發酵，pH 5.0、溫度20℃、D0＞35％，待溶氧上升後以10~15轉度流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升後用100％甲醇以轉速1開始誘導，逐漸提速。誘導階段將濃度為10％的CA、Peptone和Tryptone各300ml流加入罐(5L發酵罐，發酵上清3L)，誘導48hr結束。樣品檢測SDS-PAGE和蛋白含量以確定誘導階段的最佳蛋白保護劑。
實施例4重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體純化將高表達菌株擴大體積進行培養並誘導48h，4℃下5000rpm離心10分鐘，獲得發酵菌體，對菌體超聲破碎，離心所得含有表達產物的上清液先經過SPSepharose FF陽離子交換柱，然後再上Q Sepharose FF陰離子交換柱，以鹽濃度梯度的緩衝液洗脫，收集目的蛋白的洗脫峰。
經過以上純化工藝，最後可得蛋白純品4g/L，純度95％以上。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海新生源醫藥研究有限公司120一種人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的生產方法16022101211453212DNA213人工序列221misc_feature222(1)…(453)223優化的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體基因4001atgagaaaaa gaaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc 60cagtggctga accgccgggc caatgccctc ctggccaatg gcgtggagct gagagataac120cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc180caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc240taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca300gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag cccatctatc tgggaggggt cttccagctg360gagaagggtg accgactcag cgctgagatc aatcggcccg actatctcga ctttgccgag420tctgggcagg tctactttgg tatcattgcc ttc 4532102211151212PRT213智人
4002Met Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro15 10Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn15 20 25Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu30 35 40Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val45 50 55Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu60 65 70Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys7 80Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu85 90 95Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile100 105 110Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu115 120 125Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu130 135 140Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe145 150 15權利要求
1.一種人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一種表達載體，其特徵在於，所述的表達載體含有權利要求1所述的核苷酸序列。
3.一種工程細胞，其特徵在於，它整合有權利要求2所述的表達載體。
4.如權利要求3所述的工程細胞，其特徵在於，它是畢赤酵母。
5.一種生產人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的方法，其特徵在於，該方法包括步驟(a)在適合的表達條件下，培養如權利要求3所述的工程細胞，從而表達出人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白；(b)分離純化出表達的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟(a)所示的表達條件為誘導時間為12-120小時，較佳的為24-100小時；誘導pH為3-10，較佳的為5-7。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟(b)所示的表達條件為(1).發酵菌體超聲破碎或壓榨後離心，獲得含有目的蛋白的上清液；(2).通過簡單的離子交換層析等簡單步驟，即可獲得純度在95％以上的純品。
全文摘要
本發明提供了一種人腫瘤壞死因子TNF－α突變體的生產方法，以及有關的表達載體與工程細胞構建、表達和純化的工藝。優化後的人腫瘤壞死因子TNF－α突變體蛋白基因非常適合在畢赤酵母中表達，同時通過發酵與純化工藝優化，提高了表達量和純化得率，具有表達高、穩定性好，生產工藝簡便的優點。本發明可高效、簡便、低成本的獲得人腫瘤壞死因子TNF－α突變體。
文檔編號C07K14/525GK1876817SQ20051002665
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月10日 優先權日2005年6月10日
發明者孫九如, 任軍, 黃陽濱, 豐濤, 蔣劍 申請人:上海新生源醫藥研究有限公司