B/e雙甲氧基水飛薊賓用於製備治療病毒性B肝藥物的用途的製作方法

2023-12-05 16:19:31 2

專利名稱：：B/e雙甲氧基水飛薊賓用於製備治療病毒性B肝藥物的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，具體而言，本發明涉及一種B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯或其可藥用鹽用於製備降低B肝病毒表面抗原HBsAg和B肝e抗原HBeAgJi制HBVDNA複製、治療B型肝炎病毒感染疾病藥物的用途。該黃酮木脂素具有強效的抑制HBsAg和HBeAg活性，在20微克/毫升濃度下其清除HBsAg和HBeAg的強度分別為43.9%和43.7%，分別是陽性對照藥物(10000單位/毫升的α-幹擾素)活性的2.7倍和2.6倍；在該濃度下其對HBVDNA顯示出68.6%的抑制率，抑制活性是α-幹擾素的1.8倍。以上表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽同時具有抑制HBsAg、HBeAg和HBVDNA的功效；可預期用於製備清除HBsAg和HBeAg、抑制HBVDNA複製、治療B型肝炎病毒感染疾病之非核苷類藥物的用途。
背景技術：
：B型肝炎(B肝)是由B型肝炎病毒HBV引起的傳染病。HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一員，其形狀為直徑42納米的球形顆粒。HBV是奇特的病毒，在其它動物中較少有傳染性，唯有在人體或者靈長類動物黑猩猩體內才能得以複製。該病毒通過B肝病毒攜帶者和B肝病人的血液、唾液、精液、陰道分泌物進行傳播，具有慢性攜帶狀態。B肝在我國廣泛流行，因其分為垂直傳播、水平傳播、家庭內傳播、醫源性傳播和性傳播等多種方式，對人群感染率高，在某些地區感染率達到35%以上。據有關資料，肝炎檢測陽性的患者已經達到1.89億，而應就診未就診人數(攜帶者)將近4億，是當前危害人民健康最嚴重的傳染病之一。B肝臨床表現多樣化，易發展為慢性B型肝炎(CHB)和肝硬化，少數病人可轉變為原發性肝癌。B肝表面抗原(HBsAg)是B肝病毒的外殼蛋白，HBsAg陽性是判斷HBV感染的金標準。HBsAg陽性、但無肝炎症狀出現者成為HBV病毒攜帶者。HBsAg滴度越大，其合併B肝核心抗原HBeAg、HBVDNA陽性和DNA多聚酶活性升高的機率就越大，因而傳染性越強。因此，抑制HBsAg的分泌和複製是研發抗B肝病毒藥物中的一個重要靶標和檢測標的。北京地壇醫院吳淑雲等報告B肝HBsAg清除和B肝閉環共價DNA(cccDNA)存在一定相關性，清除HBsAg是cccDNA水平顯著降低的標誌。2002年，在《新英格蘭醫學雜誌》發表研究結果之研究者認為對於CHB患者，如在肝硬化前獲HBsAg清除，則其肝硬化和肝細胞癌發生率將降低60倍。美國肝病研究協會AASLD、亞太肝臟研究協會APASL和歐洲肝臟研究協會EASL的指南中均將HBsAg血清清除作為治療終點判定標準之一。據2008年歐洲肝臟研究學會年會報導聚乙二醇幹擾素α-2a治療CHB患者48周後停藥，隨訪1、2、3、4年，其HBsAg清除率分別為3%、6%、8%和11%，而單獨用拉米夫定者對HBsAg清除率於停藥後1、2、3、4年僅為0%、0%、0%和3%，因而該幹擾素被認為是治療HBeAg陰性CHB患者最佳治療選擇。可見發現能夠高效清除HBsAg的藥物具有重大的社會和經濟效益。B肝e抗原HBeAg是B肝病毒HBV內核的結構蛋白，在B肝病毒繁殖時大量產生。B肝病毒HBV具有所有已知DNA病毒中最小的基因組(僅3.2kb)，其基因主要編碼五種蛋白(S、C、E、P、X)。C蛋白為病毒核心蛋白，而E蛋白是C蛋白的一部分，成為B肝e抗原(HBeAg)，其是已經編碼好但未組裝到病毒顆粒中的蛋白，在病毒複製時會分泌到患者血液中去。臨床上，通常將血清HBeAg作為HBV複製、傳染性、病情嚴重程度以及對其進行治療應答進行評價的重要標誌物。該抗原與HBVDNA密切相關，是臨床上表達病毒複製非常實用的血清標誌物。血清標誌物HBeAg陽性患者說明其體內有HBV複製，故而有較高的傳染性。患者HBeAg表達越高說明該患者傳染性越強。同理，抑制HBeAg的分泌和複製也是研發抗B肝病毒藥物中的一個重要靶標和檢測標的。HBeAg清除說明體內有著持續的HBV抑制，ALT正常，組織炎症壞死減輕，肝硬化發生的機率降低。因此，血清HBeAg被認為能夠反映更為穩定的治療效果，HBeAg血清清除標誌著患者免疫系統開始發揮作用。2002年，在《新英格蘭醫學雜誌》發表研究結果之研究者認為對於CHB患者，如在肝硬化前獲HBeAg清除，則其肝硬化和肝細胞癌發生率將降低10倍。美國肝病研究協會AASLD、亞太肝臟研究協會APASL和歐洲肝臟研究協會EASL的指南中均將HBeAg血清清除作為治療終點判定標準之一。所以，能夠抑制、降低HBeAg表達或活性的藥物也即屬於治療B肝病毒感染有效藥物。目前，對B肝患者的用藥主要分為保肝降酶、抗病毒、抗肝纖維化和調節免疫等數個大類。抗病毒是根本方法，而保肝降酶只是輔助治療，多治標而鮮見治本。近些年來取得進展的還是在於抗病毒藥物治療方面的研究。然而，目前對於病毒性B肝臨床上的治療方案只能達到抑制HBV複製和繼發感染，最主要藥物仍是核苷類藥物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韋、阿德福韋(ADV)、替比夫定等，還有處於臨床試驗期中的emtricitabine、tenofoviiNclevuding等。在我國，拉米呋啶已經成為醫保用藥，應用於大批HBV患者。核苷類藥物部分優點為生物利用度高，口服較安全。然而，它們雖然能有效地控制病情，但一則售價昂貴；二則長期使用均可出現耐藥性，以及停藥後出現HBVDNA、ALT及肝組織學的不同程度的反彈；三是長期使用核苷類藥物出現的較為明顯的眾所周知的不良作用，例如腎臟損傷、嬰兒致畸等。最為頭痛的是病毒耐藥的出現大大降低了治癒率，因為核苷類藥物對病毒複製是可逆的，所以對大部分患者若欲達到最大療效，療程必須在一年以上，如此其耐藥性隨之出現，就達不到預期之效果。核苷類藥物還有難以清除cccDNA、治療一年後HBsAg難以陰轉等不足之處。幹擾素(α、β_幹擾素)以及重組幹擾素類等來源於人白細胞的生物工程類抗病毒藥物近期成為研究和治療CHB熱點藥物，其具有抗病毒和免疫調節雙重作用。其既可通過抗病毒作用抑制病毒複製從而減輕肝臟細胞炎症反應，減少肝細胞損害，延緩病情發展從而起到改善病人臨床症狀和肝臟生理功能；又可以增強免疫作用，通過加強體內自然殺傷細胞和輔助性T細胞的作用，尤其是可以促進殺傷T細胞去殺傷被病毒感染細胞，因此間接起到抗病毒作用。幹擾素治療CHB患者獲得的HBsAg血清學轉換比拉米呋啶更為持久，2003年《消化道》雜誌上一項研究顯示幹擾素治療組HBsAg的3年復發率顯著低於拉米呋啶組；且長效幹擾素可以每周使用一次，較為方便。因此，幹擾素日漸成為臨床上用於治療慢性B肝病毒的首選藥物之一，但其副作用和不良反應報導較多，總有效率不高，價格昂貴，患者經濟負擔大，因而造成臨床上難以廣泛使用，且對失代償肝硬化患者不適宜應用。近幾年隨著肝病的研究，發展了標準化的HBVDNA的分析，大大推進了對B肝患者病情的了解。HBVDNA的定量分析能預測B肝的嚴重性及其預後，因為HBVDNA持續陽性(即持續病毒血症)容易使B肝病情進展和加重；高B肝病毒(HBVDNA)含量容易促進肝硬化的形成；HBVDNA持續存在是肝細胞癌(HCC)發生的高危因素，特別是病毒含量較高、病程較長、年齡較大或合併其它肝病者；持續高濃度的HBVDNA存在，可導致失償常性肝硬化及原發性肝重症的死亡率明顯增加。同時必須認識到，HBVDNA水平與肝臟組織學的關係極其密切文獻報導經抗病毒治療，肝臟纖維化的改善和消除明顯；近期國際肝病會議報導，強效和低耐藥性的抗病毒治療，隨著HBVDNA的降低和轉陰，而觀察到肝硬化可出現不同程度的逆轉，因此現在主張肝硬化也應進行抗病毒治療。因此，HBVDNA指標在抗病毒治療中的應用也起著舉足輕重的作用HBVDNA的水平是決定慢性B型肝炎是否需要抗病毒治療的重要指標；根據HBVDNA的不同情況分別制定出HBeAg陽性或HBeAg陰性的不同治療標準和要求；在抗病毒治療中，根據HBVDNA的治療反應，判斷是否病毒學早期應答進而決定長期用藥的策略以取得持續性的病毒學應答，達到持續病毒抑制的目的；根據HBVDNA的病毒學的應答情況，創造HBeAg血清學的轉換基礎和條件，以達到其良好的中間治療目標；根據HBVDNA持續抑制情況爭取病毒持續陰性，以爭取達到抗病毒最終治療目標；根據HBVDNA持續完全受到抑制，也顯示出了cccDNA的不同程度好轉和消失；在抗病毒治療中，以HBVDNA的變化來評估和預防抗病毒藥物所引起的病毒變異及耐藥發生的風險；一旦發生病毒變異或耐藥時，HBVDNA的變化是唯一的最先的信號和診斷依據，也是治療耐藥和改變治療策略的指導和依據。綜上所述，對HBVDNA的抑制程度在B肝的進一步診斷和治療上有著新的重大意義，對療效的觀察，對評估B肝預後及耐藥危險性均有較大的指導作用。由上述因素可知抑制B肝病毒在體內增殖的另外一個根本環節在於抑制HBVDNA的複製。HBVDNA水平的降低或者低於檢測水平是檢驗抗病毒藥物的另外一把金鑰匙。所以，亞太肝臟研究學會和歐洲肝臟研究學會均將HBVDNA檢測不到作為B型肝炎病毒患者治療終點之一。我國新藥開發指南中也將受測化合物對於HBVDNA的抑制強度視為必須完成的測試項目之一。拉米呋啶之所以能夠成為首選核苷類藥物便是因為其具有強效的抑制HBVDNA複製之活性。因此既能抑制HBVDNA複製又能抑制HBsAg的化合物將更有希望成為治療B肝患者的創新性藥物。必須說明的是目前使用的抗病毒藥物其實只是病毒複製的抑制劑，並不能直接殺滅病毒和破壞病毒體，否則就會損傷宿主細胞。這些抗病毒藥物(多為核苷類藥物)還存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥後易反跳等缺點，因此開發新型抗病毒藥物是當今藥物研發領域的當務之急。其對於治療我國大量的B肝患者和病毒攜帶者、控制傳染源等都有著極其重要的社會意義和經濟意義。所以，從民族民間長期使用的天然藥物中發現新的非核苷類B肝病毒抑制劑及此類能夠降低HBsAg、HBeAg或抑制HBVDNA複製的先導化合物有著很大的指導性意義，並有著遼闊的發展前景。基於此目的，發明人以前曾完成多項抗B肝病毒天然產物及其結構改造衍生物的專利和文章，發現了多種抑制B肝病毒表面抗原HBsAg或B肝病毒e抗原HBeAg活性或抑制HBVDNA複製的化合物，從而說明從天然產物及其合成衍生物中篩選出能夠降低HBsAg或HBeAg、防治B肝病毒感染的創新性藥物是可行的[參見「一類對映桉烷醇類倍半萜抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、劉光明、於榮敏、李海波等；ZL200610053827.4)；「2β-羥基冬青酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(李校堃、趙昱、黃可新、李海波等；ZL200610053749.8)；「2α，3β-二羥基_5，11(13)-二烯桉烷-12-酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、張禮和、孫漢董、李海波等；ZL200610053601.4)；「艾裡莫芬烷內酯抑制B肝病毒的用途及其藥物組合物」(趙昱、李海波、楊雷香、周長新等；ZL03153691.3)；「一種艾裡莫芬內酯酸天然產物及其應用」(趙昱、周長新、施樹雲、王曉雨等；ZL200610053575.5)；「一種桉烷型倍半萜酸及其用途」(趙昱、劉光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579.3)；「六稜菊屬植物提取物抑制單純皰疹病毒及B肝病毒的用途」(趙昱、周長新、於榮敏、白驊；CN1989989Α)；「1β-氧代_5，11(13)-二烯桉烷-12-酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、李校堃、黃可新、李海波等；CN1927197Α)；「1β-羥基冬青酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、李校堃、黃可新、巫秀美等；CN1935131Α)；「對映艾裡莫芬烷酸及其抑制B肝表面抗原的醫藥用途」(黃可新、李校堃、王曉雨、趙昱等；CN101239054)；「1-氧-取代苯甲醯奎尼酸化合物及其抑制B肝病毒用途」(李校堃、胡利紅、巫秀美、趙昱等；CN101293836)；發明人已發表之抑制HBsAg、HBeAg以及HBVDNA等活性文章參見「InVitroAntiviralActivityofThreeEnantiomericSesquiterpeneLactonesfromSenecioSpeciesAgainstHepatitisBVirus，，,HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(M長新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(趙昱)等，AntiviralChemistry&Chemotherapy,2005,16,277-282；"EvaluationofAntiviralActivityofCompoundsIsolatedfromRanunculussieboldiiMiq.andRanunculussceleratusL，，，HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周長新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(趙昱)等，PlantaMedica，2005，71(12),1128-1133；"Applicationofhigh-speedcounter-currentchromatographyfortheisolationofantiviraleremophiIenolidesfromLigulariaatroviolacea",Shi,Shu-Yun(施樹雲)，Hai-Bo(李海波)，Zhao，Yu(趙昱)等，BiomedicalChromatography,2008,22(9),985-991；"PurificationandidentificationofantiviralcomponentsfromLaggerapterodontabyhigh-speedcounter-currentchromatography",ShuyunShi(施樹雲)，YuZhao(MS)等，JournalofChromatographyB，2007，859，119-124]。毋庸置疑，繼續從天然產物及其結構改造衍生物中尋找能夠清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製的先導化合物是非常有必要性和緊迫性的，也因此被國家科技部列為新藥研製重大專項之一。在上述治療CHB藥物中，還有一類是保肝類藥物，其臨床大量使用之典型為存在於菊科植物水飛薊的種子中的水飛薊素。水飛薊已在臨床上廣泛應用，在市場上其商品名為Legalon利肝隆或Flavobion，其代表性化合物當屬黃酮木脂素水飛薊賓。黃酮木質素化合物屬於雜木質素類，是由一分子苯丙素和一分子黃酮結合而成的一類天然產物。水飛薊中水飛薊賓含量最多，活性也最高。該藥作用主要有以下幾點(一)抗自由基活性水飛薊素對於由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護作用。1990年Lotteron等人報導了在小鼠肝微粒體內，水飛薊素能減少由四氯化碳代謝引起的體外脂質過氧化及由還原型輔酶單獨引起的過氧化作用，這些都表明水飛薊素為鏈中斷抗氧化劑或為自由基清除劑。(二)保護肝細胞膜通過抗脂質過氧化反應維持細胞膜的流動性，保護肝細胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環肽和α-鵝膏蕈鹼等與肝細胞上特異受體的結合，抑制其對肝細胞的攻擊及跨膜轉運，中斷其肝腸循環，從而增強肝細胞膜對於多種損害因素的抵抗力。(三)促進肝細胞的修復和再生水飛薊賓進入細胞後可以與雌二醇受體結合，並使之激活，活化的受體可以增強肝細胞核內RNA聚合酶1的活性，使RNA轉錄增強，促進酶及蛋白質的合成，並間接促進DNA的合成，有利於肝細胞的修復和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個有效的抗自由基物質也顯示了預防和治療腫瘤的作用。三十多年的臨床實驗證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱Flora，K.等，Am.J.Gastroenterol,1998,93,139-143；Sailer,R.等，Drugs,2001,61(14)，2035-2063；GazalcjR.等，Curr.Med.Chem.2007，14，315-338；Svagera,Z.等，Phytother.Res.2003，17，524-530；Gazak5R.等，Bioorg.Med.Chem.2004，12，5677-5687；Varga,Z.等；Phytothe.Res.2001，15，608-612.Singh，R.P.等，Curr.CancerDrugTar.2004,4,1-11)。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木質素類化合物引起了越來越多的關注，如發明人於2006-2009年間製備並報導的多個系列水飛薊賓類衍生物也具有顯著的抗氧化活性(楊雷香、趙星等，"Design，synthesisandexaminationofneuronprotectivepropertiesofalkenylatedandamidateddehydro-silybinderivatives",JournalofMedicinalChemistry，2009，52(23)，7732-7752；汪峰，趙昱等，「PreparationofC-23esterifiedsilybinderivativesandevaluaionoftheir1ipidperoxidationinhibitoryandDNAprotectiveproperties",Bioorganic&MedicinalChemistry,2009,17(17)，6380-6389；楊雷香，等，"Synthesisandantioxidantpropertiesevaluationofnovelsilybinanalogues，，，JournalofEnzymeInhibitionandMedicinalChemistry,2006，21(4),399-404；等等)。在發明人報導的上述文章中，經發明人設計併合成出的多個系列之A環、B環、E環、23位取代的黃酮木脂素類化合物都顯示出強效捕獲DPffl自由基和超氧陰離子自由基的活性、抗氧化活性、以及保護PC12細胞的活性。但是顯而易見上述研究僅集中於研究水飛薊賓類黃酮木脂素的抗氧化作用和細胞保護作用。近期(2006年)，謝軍報導了聯合應用具有抗病毒和免疫調節雙重作用的幹擾素和保肝護肝的水飛薊賓磷脂複合物治療慢性B肝的結果，發現聯合用藥對患者體內ALT、AST值降低比單獨用幹擾素效果明顯，說明水飛薊賓磷脂複合物能加強幹擾素的治療慢性B肝之作用。但是，類似的治療方案仍是將水飛薊賓等黃酮木脂素作為輔助用藥，且主要是用於保護肝細胞膜而非直接用其實施抗病毒作用。左國營等(左國營，劉樹玲，徐貴麗，世界華人消化雜誌，2006年14卷13期，1241-1246頁)綜述了近20年來藥用植物成分體外抗HBV活性的研究進展，文中論及多種天然產物，其中並沒有報導任何黃酮木脂素類化合物具有抗氧化活性的相關記錄，尤其是水飛薊賓類天然產物及其衍生物，國內幾乎無人涉及，僅由發明人團隊對其進行了前人未加注意的結構改造和抗HBV活性研究。以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素化合物雖然具有以上所述之抗氧化療效，然而其見報於抗病毒治療方面之文獻相對較少，黃酮木脂素類化合物治療DNA類病毒感染尤其是其用於抗B肝病毒方面(包括抑制HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製)的新用途尚未得到有效開發，故此從黃酮木脂素中尋找抗B肝病毒領域的活性化合物，亦即將黃酮木脂素結構改造使其具有抗DNA類病毒活性是一個嶄新的領域。從其中發現清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製的先導化合物更是前人所未嘗試過的挑戰。為了探索這個領域，我們設計並製備了與水飛薊賓結構有所差異的一種新的黃酮木脂素衍生物，也即將原水飛薊賓之B環和E環均引入一個甲氧基，從而改變整個分子共軛強度，同時引入新的氫鍵受體或給體，如此設計可以生成新型空間結構不同於水飛薊賓的一類新型木質素二氫黃酮醇類化合物(也是一類新型黃酮木脂素化合物)。以期發現超乎尋常的清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製的活性乃至先導化合物，從而將其進一步開發成具有能清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製、治療CHB的創新性藥物，據此完成本發明。
發明內容本發明的目的是提供式(1)所示的B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用於製備清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製、治療乙型病毒性肝炎藥物中之新用途。formulaseeoriginaldocumentpage8式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮。本發明的另一目的是提供了式(1)化合物的全合成方法，該方法的合成工藝路線特徵是以化合物2，4，6-三甲氧甲氧基苯乙酮(1-1)和3-甲氧基-4，5-甲氧甲氧基苯甲醛(1-2)為起始物，在有機溶劑中以及鹼水作用下縮合成查耳酮(1-3)，該查耳酮在鹼性過氧化氫作用下經環氧化得到環氧查耳酮(1-4)，該環氧查耳酮在酸性有機溶劑中環合得到二氫黃酮醇(1-5)，再於催化劑作用下，二氫黃酮醇與芥子醇(1-6)進行自由基偶聯反應生成化合物(1)。其具體流程如下所示formulaseeoriginaldocumentpage9其中R1為甲基，R2,R3均為甲氧基。本發明的另一個目的是提供了一種用於清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製、治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，其特徵為由含有治療有效量的作為活性成分的式(1)化合物或者它的可藥用鹽和可藥用輔料組成的混合物。其藥物劑型可以是片劑、膠囊劑、注射齊、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以採用現代製藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米製劑。本發明的B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯化合物(1)與天然黃酮木脂素類化合物水飛薊賓相比較，具有諸多結構和物化性質上差異化的特徵，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氫鍵受體、電性、分子間範德華力、以及3D構象、伸展方向、分子重心、共軛程度、電性分布中心等特質均與水飛薊賓有著明顯不同；且化合物(1)分子量比水飛薊賓增大了60個質量單位。上述特徵都決定了式(1)所示化合物之三維構象與HBsAg或或HBeAg乃至HBVDNA之3D空間結構相結合之配體-受體結合複合物形態和結合方式都可能產生較大的差別，其結合位點和結合模式、其結合自由能等均會產生較大的改變，因而可能在清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製方面有著意想不到的效果。我們測試了該化合物對H印G2.2.15細胞的生長抑制作用，同時測試了其對H印G2.2.15細胞分泌的乙型HBsAg、HBeAg及對HBVDNA複製的抑制活性。試驗結果發現本發明中合成得到的B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯即(士)_2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮對H印G2.2.15細胞分泌的HBsAg和HBeAg具有強效的抑制活性，在20微克/毫升濃度下其清除HBsAg和HBeAg的強度分別為43.9%和43.7%，分別是陽性對照藥物(10000單位/毫升的α_幹擾素)活性的2.7倍和2.6倍；在該濃度下其對HBVDNA顯示出68.6%的抑制率，抑制活性是α-幹擾素的1.8倍。以上均說明式(1)化合物有著意想不到的抗HBV效果，從而可以預期其可以作為清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製、治療乙型病毒性肝炎之活性化合物(hit)繼續開發。經本發明人詳細的文獻查閱，到目前為止，尚無有關該化合物治療B肝病毒感染性疾病和製備抗B肝病毒藥物的報導。黃酮木脂素式⑴化合物對於HBsAg、HBeAg和HBVDNA強效抑制均屬於意想不到的發現，有著確切的原創性。綜上所述，我們合成的該水飛薊賓酯類黃酮木脂素既有結構上的獨特性，又有抗病毒作用方面研究的新穎性，並在抗B肝病毒活性測試中既發現了不尋常的抑制HBsAg的活性，又發現了顯著的抑制HBeAg之活性，還發現其具有極強效的抑制HBVDNA複製活性；有望成為強效清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製及治療CHB之非核苷類藥物之先導化合物。本發明有益之處在於首次發現式(1)所示之B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素具有強效清除HBsAg或HBeAg、顯著抑制HBVDNA複製的功效，並在防治B肝病毒感染疾病方面的成藥潛力。為開發成為治療B肝病毒創新藥物、開發清除B型肝炎表面抗原HBsAg或B肝e抗原HBeAg、抑制HBVDNA複製之非核苷類創新藥物提供了新的物質基礎。具有潛在巨大的社會效益和經濟效益。本發明再一特點為本發明之合成起始物來源方便，合成方便。其製備方法簡單易行，原料來源方便易得，成本低，汙染小，利於節能減排條件下的大規模生產。產業化前景十分明確。具體實施例方式本發明人通過化學合成，並通過多種層析手段純化得到該既能強效抑制B肝HBsAg和HBeAg的分泌又能有效抑制HBVDNA複製活性的一個B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素類活性化合物，又經質譜和核磁共振波譜等綜合解析推導出其化學結構。本發明人發現，式(1)化合物對H印G2.2.15細胞的生長無明顯抑制作用，而對H印G2.2.15細胞分泌的B肝HBsAg和HBeAg的分泌以及HBVDNA的複製具有強效的抑制作用，提示該化合物具有用藥安全、強效清除HBsAg或HBeAg及強效抑制HBVDNA複製的特點。因此，根據本發明人的研究，發明人所設計併合成的式(1)所示之黃酮木脂素化合物可以用於製備治療B肝病毒感染性疾病的非核苷類藥物和用於治療B肝病毒感染性疾病。為了更好地理解本發明的實質，下面分別用式(1)化合物的製備及其對H印G2.2.15細胞生長抑制作用以及對H印G2.2.15細胞分泌的HBsAg、HBeAg及HBVDNA複製之抑制作用試驗的結果，說明其在製藥領域中的新用途。實施例給出了式(1)化合物的部分合成、結構鑑定、和活性數據，其中OMe是指甲氧基、OMOM是指甲氧甲氧基。必須說明，本發明的實施例是用於說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。實施例1式(1)化合物(士)-2-[2，3_二氫-3-(4_羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮的製備1.1儀器與試劑紫外光譜用ShimadzuUV-240紫外分光光度計測定；核磁共振氫譜1H-NMR由INOVA型超導核磁共振波譜儀(VARIANIN0VA-400MHz)測定(四甲基矽醚TMS為內標)；電噴霧質譜ESI-MS由BrukerEsquire3000+質譜儀測定，柱層析用矽膠(100-200，200-300和300-400目)以及薄層層析用矽膠GF254(10-40目)均由青島海洋化工廠生產；所用試劑均為分析純，薄層製備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔矽膠板；柱色譜用葡聚糖凝膠SephadexLH-20採用瑞典AmershamPharmaciaBiotechAB公司產品；反相矽膠RP-18採用日本FujiSilysiaChemical公司的Chromatorex產品；MCI為日本三菱化工公司產品，薄板(TLC)檢測用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇以及磷鉬酸溶液。1.2中間體1-(2，4，6-三甲氧甲氧基苯基)-3-(3，4-二甲氧甲氧基-5-甲氧基苯基)丙烯酮的製備formulaseeoriginaldocumentpage113.O克3-甲氧基-4，5-二甲氧甲氧基苯甲醛和3.5克2，4，6_三甲氧甲氧基苯乙酮溶解在40毫升乙醇中，加入溶解有10克氫氧化鉀的20毫升水溶液，於室溫下攪拌15小時。減壓蒸出乙醇，加入30毫升水，醋酸乙酯萃取三次，每次20毫升。合併有機相後，依次用飽和亞硫酸鈉(40毫升)和飽和食鹽水(40毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾濃縮，經矽膠柱層析得到中間體化合物4.4克，收率70%。Rf(石油醚/醋酸乙酯=21)0.36；紫外(甲醇)λ·=208，321nm;核磁共振氫譜1HNMR(400MHz，氘代氯仿)δ:3.34(單峰，6Η,OCH3)，3.43(單峰，3Η,OCH3)，3.46(單峰，3Η,OCH3)，3.56(單峰，3Η,OCH3)，3.90(單峰，3Η,OCH3)，5.06(單峰，4Η,OCH2O)，5.11(單峰，4Η,OCH2O)，5.14(單峰，2Η,OCH2O)，6.51(單峰，2Η，Η-3'，5'),6.74(雙峰，J=L6Hz,1Η,Η_2)，6·80(雙峰，J=16.OHz,1Η,H-α)，6.91(雙峰，J=1.6Hz，1Η，Η-6)，7.17(雙峰，J=16.ΟΗζ,ΙΗ,Η-β)；電噴霧質譜ESI-MSm/z539[M+H]+。1.3中間體化合物1-(2,4,6_三甲氧甲氧基苯基)-3-(3-甲氧基-4，5_二甲氧甲氧基苯基)環氧丙酮的製備formulaseeoriginaldocumentpage113克1.2中製備得到的化合物1-(2，4，6_三甲氧甲氧基苯基)-3-(3，4_二甲氧甲氧基-5-甲氧基苯基)丙烯酮溶解於50毫升甲醇中，於攪拌狀態下加入2Ν氫氧化鈉4毫升，30%過氧化氫4毫升，於室溫攪拌10小時，減壓蒸去溶劑，加入50毫升水，乙酸乙酯提取(3X30毫升)。合併有機相後用飽和食鹽水(40毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濃縮得黃色油狀物2.6克，可直接用於下一步反應。Rf(石油醚/醋酸乙酯=21)0.37；UV(甲醇)λmax=205,278nm；核磁共振氫譜1HnmRGOOMHz,氘代氯仿)δ:3·34(單峰，6Η，OCH3)，3.43(單峰，3Η,OCH3)，3.46(單峰，3Η,OCH3)，3.56(單峰，3Η,OCH3)，3.87(單峰，3Η,OCH3)，3.89(雙峰，J=L6Hz,1Η,H-β),3.93(雙峰，J=L6Hz,1Η,H-α)，5·06(單峰，4Η,OCH2O),5.11(單峰，4Η，OCH2O)，5.14(單峰，2Η，OCH2O)，6.51(單峰，2Η，Η-3『，5')，6.74(雙峰，J=1.6Ηζ,1Η，Η-2)，6.91(雙峰，J=1.6Hz,1H，H_6)；電噴霧質譜ESI-MS:m/ζ555[M+H]+。1.4化合物5'-甲氧基-3，5，7，3',4'-五羥基二氫黃酮的製備formulaseeoriginaldocumentpage122.6克1.3中製備得到的1-(2，4，6_三甲氧甲氧基苯基)-3-(3_甲氧基_4，5_二甲氧甲氧基苯基)環氧丙酮化合物溶解於35毫升甲醇和15毫升四氫呋喃中，向其中滴加5毫升濃鹽酸，於50-55°C攪拌30分鐘，減壓蒸去溶劑，乙酸乙酯提取(3X30毫升)，合併有機相後用飽和食鹽水(40毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濃縮，經柱層析得黃色粉末0.73克。Rf(氯仿/甲醇=io1)0.14；核磁共振氫譜1HNMRGOOMHz,氘代丙酮)δ3.98(單峰，3Η，OCH3),4.62(雙雙峰，J=12.0,4.OHz,1Η，Η_3),4.69(雙峰，J=4.OHz,1Η,3-0Η),4.98(雙峰，J=12.OHz,1Η，Η_2)，5·92(雙峰，J=2.OHz,1Η，Η_6)，5·95(雙峰，J=2.0Hz,1Η,Η-8),6.72(雙峰，J=2.OHz,1Η,Η-2')，6·73(雙峰，J=2.OHz,1Η,Η-6')，11.71(單峰，1Η，5-0Η)；電噴霧質譜ESI-MS:m/z335[M+H]+。1.5化合物(1)的製備formulaseeoriginaldocumentpage12在乾燥氮氣保護的反應瓶中加入0.65克5'-甲氧基_3，5，7，3'，4'-五羥基二氫黃酮和0.85克芥子醇，用無水丙酮40毫升和無水苯120毫升溶解，再加入1.5克碳酸銀，於55-60°C攪拌20分鐘，過濾，母液濃縮，經柱層析得淺黃色粉末0.30克。Rf(氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/甲酸=110.5110.1)0.27；核磁共振氫譜1HNMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.51(多重峰，1Η,H-23a)，3.85(單峰，6H,OCH3)，3.99(單峰，3H,OCH3)，4.06(多重峰，1H,H-23b)，4.17(多重峰，1H,H-10)，4.63(雙峰，J=12.OHz,1H,H-3)，4.94(雙峰，J=8.0Ηζ，1Η，Η-11)，5·01(雙峰，J=12.0Hz，1Η，Η-2)，5.90(雙峰，J=2.0Ηζ，1Η，Η_6)，5.97(雙峰，J=2.OHz，1Η，Η-8)，6·756.89(多重峰，4Η，Ar-H)，11.67(單峰，1Η，5-0Η)；電噴霧質譜ESI-MS:m/z543[M+H]+。實施例2化合物(1)對H印G2.2.15細胞分泌的B型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用2.1細胞培養將H印G2.2.15細胞培養於含10%滅活胎牛血清，100U/毫升青黴素和100U/毫升鏈黴素，100微克/毫升G418的DMEM培養基中，置37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養。2.2採用MTT法測定式(1)化合物對H印G2.2.15細胞生長的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成1XIO5個/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的化合物(1)，濃度分別為1000、200、40和8微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養，培養72小時後，每孔加入MTT試劑10微升，繼續培養4小時，棄去培養基，每孔加入DMSO200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標儀測定OD值。以只加培養基的培養孔為對照孔。抑制率(％)=(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值X100%。測定化合物1對B型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成IXIO5/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100毫升，在37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的樣品，濃度分別為20、4和0.8微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養，每4天換含相同濃度樣品的培養基，將同一樣品同一濃度的換出的培養基等體積混勻，作為待測樣品。用ELISA試劑盒測定培養基中HBsAg濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1(測試濃度為100、20和4微克/毫升)；以α-幹擾素為陽性對照2(測試濃度為10000、5000和1000單位/毫升)。實驗重複三次。2.3實驗結果實驗結果如表1所示，式(1)化合物有確切的抑制B型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其對H印G2.2.15細胞的生長無明顯抑制作用，但對H印G2.2.15細胞分泌的HBsAg在第八天時高劑量下抑制活性高於拉米呋啶和α-幹擾素。表1.樣品第八天時對H印G2.2.15分泌的B型肝炎表面抗原抑制率樣品__HBsAg■律(%)「『…20微克/毫升43.9式(1)化合物4微克/毫升0__0.8微克/毫升__0_100微克/毫升11.4拉米呋啶(3-TC)20微克/毫升0.2Γη_4微克/毫升_/-10000單位/毫升16.1Ot-幹擾素5000單位/亳升10.9__1000單位/亳升__12,6_2.4結果說明式(1)所示之黃酮木脂素化合物(士)-2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮對H印G2.2.15細胞分泌的HBsAg具有強效的抑制作用，其在20微克/毫升濃度下清除HBsAg的強度為43.9%，是陽性對照藥物2(10000單位/毫升的α-幹擾素)活性的2.7倍；更是陽性對照1拉米呋啶相應抑制活性的3.9倍。可見該黃酮木脂素有極其顯著的強效抑制病毒分泌表面抗原活性。HBsAg清除是臨床上最接近治癒的狀態，對於B肝患者，其HBsAg清除成為非常有價值的CHB治療終點。因而式(1)所示之黃酮木脂素化合物可預期發展為降低B型肝炎表面抗原、控制病毒性B型肝炎症狀的非核苷類創新藥物。實施例3化合物(1)對H印G2.2.15細胞分泌的B型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用3.1細胞培養方法同實施例2。3.2採用MTT法測定式(1)化合物對H印G2.2.15細胞生長的抑制作用方法同實施例2。3.3測定化合物對B型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成IXIO5/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100毫升，在37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的樣品，濃度分別為20微克/毫升，4微克/毫升和0.84微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養，每4天換含相同濃度樣品的培養基，將同一樣品同一濃度的換出的培養基等體積混勻，作為待測樣品。用ELISA試劑盒測定培養基中HBeAg濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1(測試濃度為100、20和4微克/毫升)；以α-幹擾素為陽性對照2(測試濃度為10000單位/毫升，5000單位/毫升和1000單位/毫升)。3.4實驗結果實驗結果如表2所示。式(1)化合物顯示出極為顯著的抑制B型肝炎e抗原(HBeAg)的作用。在20微克/毫升濃度下其清除HBeAg的強度為43.7%，是陽性對照藥物2(10000單位/毫升的α-幹擾素)活性的2.6倍；而陽性對照1拉米呋啶在最高濃度(100微克/毫升)時對HBeAg抑制活性為零。表2.樣品第八天時對H印G2.2.15分泌的B型肝炎e抗原抑制率tableseeoriginaldocumentpage153.5結果說明式(1)所示之黃酮木脂素化合物其於40微克/毫升濃度下對H印G2.2.15細胞的生長無明顯抑制作用，但在20微克/毫升濃度下其清除HBeAg的強度為43.7%，是陽性對照藥物2(10000單位/毫升的α-幹擾素)活性的2.6倍；而陽性對照1拉米呋啶對HBeAg抑制活性為零。可見該B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素有確切的抑制HBeAg活性，因而可預期發展為降低B型肝炎e抗原、控制病毒性B型肝炎症狀的藥物。實施例4:式(1)化合物對H印G2.2.15細胞分泌的B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)複製的抑制作用4.1細胞培養方法同實施例2。4.2採用MTT法測定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對H印G2.2.15細胞生長的抑制作用方法同實施例2。4.3測定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)複製的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成1XIO5個/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的式(1)所示之黃酮木脂素化合物，濃度分別為20微克/毫升，4微克/毫升和0.8微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養，每4天換含相同濃度樣品的培養基，將同一樣品同一濃度的換出的培養基等體積混勻，作為待測樣品。第8天時用HBVDNA定量PCR試劑盒測定培養基中HBVDNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1(測試濃度為100、20和4微克/毫升)，以α-幹擾素為陽性對照2(測試濃度為10000、500和1000單位/毫升)。4.4實驗結果實驗結果舉例說明如表3所示，黃酮木脂素式(1)化合物具有相當強效的抑制HBVDNA複製的作用。表3樣品第8天時對H印G2.2.15細胞的HBVDNA複製的抑制率tableseeoriginaldocumentpage164.5結果說明式⑴所示之黃酮木脂素化合物(士)-2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮對B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的複製具有相當強效的抑制作用，在20微克/毫升濃度下其對HBVDNA顯示出68.6%的抑制率，抑制活性是α「幹擾素的1.8倍。在極低濃度4微克/毫升下，化合物1仍顯示出對HBVDNA有55.6%的高抑制率，顯示出其強效抑制HBVDNA複製的活性，因此該B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素化合物屬於有顯著效果的非核苷類抑制B肝病毒天然產物，值得進一步關注和深入研究，並可預期進一步優化發展為抑制HBVDNA複製的非核苷類創新藥物。在上述說明書闡述本發明時，同時提供了實施例的目的是舉例說明本發明的實際操作過程和本發明的意義。在進入本發明權利要求和其等同物範圍內時，本發明的實際應用包括所有一般變化、配合，或改進。權利要求具有式(1)所示結構的B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用於製備治療乙型病毒性肝炎藥物之用途；式(1)化合物的名稱為(±)-2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮。FSA00000134463000011.tif2.具有式(1)所示結構的B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用於製備降低B型肝炎病毒表面抗原HBsAg藥物之用途；formulaseeoriginaldocumentpage2式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2_羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮。3.具有式(1)所示結構的B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用於製備清除B肝e抗原HBeAg藥物之用途；formulaseeoriginaldocumentpage2式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2_羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮。4.具有式(1)所示結構的B環和E環雙甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用於製備抑制B型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBVDNA複製藥物之用途；formulaseeoriginaldocumentpage2式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2_羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯並二氧六環-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮。全文摘要本發明涉及B/E雙甲氧基水飛薊賓用於製備治療病毒性B肝藥物的用途，具體涉及一種B環和E環上甲氧基取代的水飛薊賓酯或其可藥用鹽用於製備清除HBsAg和HBeAg藥物、抑制HBVDNA複製藥物的用途，其具有強效的抑制HBsAg和抑制HBeAg活性，在20微克/毫升濃度下其清除HBsAg和HBeAg的強度分別為43.9％和43.7％，是陽性對照藥物α-幹擾素的2.7倍和2.6倍；在該濃度下其對HBVDNA顯示出68.6％的抑制率，抑制活性是α-幹擾素的1.8倍。以上表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽同時具有強效抑制HBsAg、HBeAg和HBVDNA的功效；可預期用於製備治療B型肝炎病毒感染疾病之非核苷類藥物的用途。文檔編號A61P31/20GK101829088SQ201010181499公開日2010年9月15日申請日期2010年5月25日優先權日2010年5月25日發明者馮玉冰,巫秀美,戴志明,王彥廣,王玲,申元英,趙昱,高曉忠申請人:大理學院