用於鼻咽癌診斷的miRNA的製作方法
2024-03-30 14:45:05
本發明涉及試劑的新應用，特別涉及檢測試劑作為鼻咽癌診斷試劑的應用。
背景技術：
鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,npc)是我國南方及東南亞地區常見的一種惡性腫瘤，其惡性程度較高，轉移較早，約30％-50％的鼻咽癌患者就診時已發生頸部淋巴結轉移和遠處轉移。隨著鼻咽癌診斷和治療方法的逐步提高，鼻咽癌患者的局部控制率得到顯著改善，但局部復發和遠處轉移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因。
轉移是導致腫瘤復發，預後差和死亡的主要原因。上皮間充質轉化(emt)，是指上皮細胞失去細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型。目前認為emt是使腫瘤細胞獲得轉移潛能得關鍵因素。越來越多的研究表明emt與上皮細胞惡性腫瘤的發生和發展關係密切，emt現象也在多種實體腫瘤中被報導，如乳腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、鼻咽癌等。細胞發生emt時，在形態上主要表現為多變形細胞向長梭形細胞轉化，同時伴隨著細胞表面分子的變化，e-鈣粘蛋白(e-cadherin)的減少是或丟失是emt最重要的標誌性變化，伴隨著一些emt轉錄因子，例如twist1，sip1，slug和snail等基因表達增高。了解emt發生的分子機制及過程，將會為以emt為主要治療靶標的鼻咽癌治療方法提供新的前景。
如何在早期對npc進行診斷，特別是在npc未發生轉移前診斷，具有非常重要的意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供ebv-mir-bart8檢測試劑在製備npc診斷試劑，特別是早期診斷試劑中的應用。
發明人通過實驗發現，檢測到ebv編碼的mir-bart8(ebv-mir-bart8)在鼻咽癌組織中明顯高表達，為非癌鼻咽組織的11倍。利用螢光定量pcr(realtimequantitativepcr，qpcr)實驗方法對晶片結果進行驗證，證實ebv-mir-bart8不僅在鼻咽癌組織中明顯高表達，且其表達量與鼻咽癌患者的tmn分期和臨床分期呈正相關，暗示ebv-mir-bart8有可能是鼻咽癌發生發展中的重要調控因子。
進一步的研究表明，與對照組細胞株相比，高表達ebv-mir-bart8的鼻咽癌細胞株具有更強的侵襲及轉移能力，沉默內源性ebv-mir-bart8表達後，hone1-ebv鼻咽癌細胞轉移能力減弱。ebv-mir-bart8有可能通過促進鼻咽癌細胞的emt而使鼻咽癌細胞具有更強的轉移及侵襲能力。
通過檢測患者ebv-mir-bart8的表達量，可以有效輔助npc的診斷。通過調降ebv-mir-bart8的表達量，有望輔助npc的治療。
附圖說明
圖1是ebv-mir-bart8與鼻咽癌tnm分期相關；
圖2是穩轉ebv-mir-bart8鼻咽癌細胞株的建立；
圖3是transwell和boyden小室實驗結果；
圖4是hone1-ebv鼻咽癌細胞中transwell和boyden小室實驗結果；
圖5是穩轉ebv-mir-bart8細胞株發生emt樣形態和蛋白表達變化情況；
圖6是ebv-mir-bart8調控靶基因foxo3的實驗結果。
具體實施方式
下面結合實驗，進一步說明本發明的技術方案。
1、mirna晶片顯示ebv-mir-bart8在鼻咽癌組織中表達上調
發明人利用nih的in-house高通量mirna晶片對鼻咽癌標本(經大體分割法處理後，收集鼻咽癌細胞含量佔整個組織的80％以上的標本)和非癌鼻咽上皮組織(慢性鼻咽炎)標本進行mirna差異表達譜分析，其中16例鼻咽癌組織和20例正常鼻咽組織，組織總rna的提取、mirna晶片分析的具體步驟和統計方法詳見參考文獻1。實驗如果如表1所示：
表1、晶片分析中差異表達的ebvmirnas
檢測到ebv編碼的mir-bart8(ebv-mir-bart8)在鼻咽癌組織中明顯高表達，為非癌鼻咽組織的11倍。
2、ebv-mir-bart8表達量與鼻咽癌組織的臨床分期呈正相關
結合前期研究結果，認為ebv-mir-bart8有可能參與調控鼻咽癌惡性進程。接下來發明人擴大臨床樣本量，利用螢光定量pcr(realtimequantitativepcr，qpcr)實驗方法分析62例鼻咽癌臨床標本(npc)中ebv-mir-bart8的表達情況，對晶片結果進行驗證，證實ebv-mir-bart8不僅在鼻咽癌組織中明顯高表達，且其表達量與鼻咽癌患者的臨床分期呈正相關(見圖2)，暗示ebv-mir-bart8有可能是鼻咽癌發生發展中的重要調控因子。細胞總rna的提取、qpcr實驗方法的具體步驟和統計方法詳見參考文獻2。
3、建立穩轉高表達ebv-mir-bart8及對照組鼻咽癌細胞株
為了驗證假說及進一步探究ebv-mir-bart8在鼻咽癌中的生物學功能，發明人通過構建ebv-mir-bart8的慢病毒表達載體，利用病毒感染的方法建立2對穩轉細胞株(cne2-bart8、5-8f-bart8、cne2-nc、5-8f-nc，qpcr檢測發現cne2-bart8、5-8f-bart8中ebv-mir-bart8的表達量與npc組織中相當，建立了穩定高表達ebv-mir-bart8的鼻咽癌細胞株(以下簡稱：bart8(+)鼻咽癌細胞)和及對照組細胞株(以下簡稱：nc(+)鼻咽癌細胞)(見圖2)。慢病毒表達載體購自吉瑪基因，病毒感染的具體方法詳見參考文獻1。
4、體外實驗初步明確ebv-mir-bart8促進鼻咽癌細胞轉移
有趣的是，發明人在研究ebv-mir-bart8與鼻咽癌關係的過程中，通過一系列體外(transwell、boyden)實驗檢測ebv-mir-bart8對鼻咽癌細胞轉移、侵襲的影響，發現bart8(+)鼻咽癌細胞與對照組細胞株相比具有更強的侵襲及轉移能力(見圖3)。transwell、boyden實驗的具體步驟及分析方法詳見參考文獻1。
5、沉默內源性ebv-mir-bart8表達鼻咽癌細胞轉移能力減弱
在ebv陽性的鼻咽癌細胞(hone1-ebv)中行transwell、boyden小室轉移實驗，結果顯示：沉默內源性ebv-mir-bart8表達後，hone1-ebv鼻咽癌細胞轉移能力減弱(圖4)。
6、初步明確ebv-mir-bart8促進鼻咽癌細胞emt
通過對穩轉細胞株形態學的觀察及emt相關標誌物的檢測，發現bart8(+)鼻咽癌細胞發生形態改變，即細胞間隙變寬，細胞極性逐漸消失，細胞由類圓形或橢圓形變為長梭形。同時分別在mrna水平和蛋白水平檢測emt相關標誌物的表達，發現bart8(+)鼻咽癌細胞中上皮細胞標誌物e-ca表達下調，而間充質標誌物vimentin、n-ca表達上調(見圖5)。
以上實驗結果提示發明人：ebv-mir-bart8有可能通過促進鼻咽癌細胞的emt而使鼻咽癌細胞具有更強的轉移及侵襲能力。細胞總蛋白的提取、westernblot實驗的具體方法詳見參考文獻2。
7、ebv-mir-bart8調控的潛在宿主靶基因為foxo3
生物信息學預測腫瘤抑制基因foxo3可能是ebv-mir-bart8調控的宿主靶基因。雙螢光素酶報告基因實驗證實ebv-mir-bart8能與ebv-mir-bart8的3』utr結合而直接抑制foxo3的表達；同時westernblot、qpcr證實foxo3在ebv-mir-bart8過表達實驗組的表達明顯下調(圖6)。雙螢光素酶報告基因實驗的具體步驟及分析方法詳見參考文獻3。
總結：
ebv編碼的mir-bart8(ebv-mir-bart8)在鼻咽癌組織中明顯高表達，為非癌鼻咽組織的11倍。利用螢光定量pcr(realtimequantitativepcr，qpcr)實驗方法對晶片結果進行驗證，證實ebv-mir-bart8不僅在鼻咽癌組織中明顯高表達，且其表達量與鼻咽癌患者的tmn分期和臨床分期呈正相關，暗示ebv-mir-bart8有可能是鼻咽癌發生發展中的重要調控因子。
與對照組細胞株相比，高表達ebv-mir-bart8的鼻咽癌細胞株具有更強的侵襲及轉移能力，沉默內源性ebv-mir-bart8表達後，hone1-ebv鼻咽癌細胞轉移能力減弱。ebv-mir-bart8有可能通過促進鼻咽癌細胞的emt而使鼻咽癌細胞具有更強的轉移及侵襲能力。
通過檢測患者ebv-mir-bart8的表達量，可以有效輔助npc的診斷。通過調降ebv-mir-bart8的表達量，有望輔助npc的治療。
可見，通過檢測ebv-mir-bart8的表達量，可以很好地對npc進行診斷和預後。
檢測ebv-mir-bart8的表達量可以使用其他公知的方法和試劑進行。
參考文獻：
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⑵hongpeng#,yuxiangchen#,pingguigong#,longmeicai#,xiaominglyu,qiangjiang,jianguowang,juanlu,kaitaiyao,kunpingliu,jinbangli*,xinli*，highermethylationintensityinducedbyebvlmp1vianf-κb/dnmt3bsignalingcontributestosilencingofptengene,oncotarget.2016may19.doi:10.18632.
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