與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記SIsv1223的製作方法
2023-11-01 16:57:12
專利名稱：與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記SIsv1223的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種分子標記，具體地，涉及一種與穀子抗除草 劑基因緊密連鎖的分子標記。本發明還涉及該分子標記的引物、該分子標記在穀子抗除草 劑基因定位或穀子遺傳育種中的用途、一種穀子抗除草劑基因定位方法、以及一種穀子育 種方法。
背景技術：
穀子(Setaria italica L. Beauv.)是起源於我國的重要糧食作物，主要在我國的 北方種植，在國家糧食生產和糧食安全中佔有較為重要的地位。穀子是二倍體自花授粉作 物，其基因組較小，約470Mb，這些特性使其很適合作為基因組研究的對象。利用除草劑除草己成為當今農田有效地控制雜草、提高農作物產量與質量的一項 重要措施。然而，由於谷田雜草種類多，數量大，目前生產上又缺乏抗除草劑的品種，谷田不 能施用廣譜除草劑除草，這成為障礙穀子生產的一大難題。目前，遺傳連鎖圖譜的構建已成為基因定位、圖位克隆以及基因組結構與功能研 究的重要基礎。而分子標記又是構建遺傳連鎖圖譜的基礎。因此，迫切需要發現與穀子抗 除草劑基因緊密連鎖的分子標記。
發明內容
本發明人依據全基因組序列，經過大量的實驗和不懈的努力，提供了一種與穀子 (Setaria italica L. Beauv.)抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記SIsvl223，並由此提供了 下述發明本發明的一個方面涉及一種與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記SIsvl223， 其核苷酸序列如seq id n0:1所示。其中加邊框部分為引物設計區段553bp|TCAGTTTGCAGACCTGGACT| gatattagcatcccttaatttcaatcctcatgttttcataacag
ttttcagcctttgctgactgagaattttttctgttctgtttagtttgtgcatattaaacttgaccaaattctatgcc atgatgtttaaccgctgcctttttaagattaccaaaatggattgacataatgttccatgttttgtggaatgtgatcc actccttcagttctatcatattaggagtccctctgtatctgtagaagaggtcctggattcgaagaaaacaaagataa tggcgcaggctcctggggatgccctttctgtattgcatacgaagcgggtcatagaacattacgggtcaaacttggaa agatataacaaaaacgtatatgaggtttggacatgtgccaagctaaccatgtattctttagaggcaacattaatctt tgctgtcccaatcagtctgacagatgagatcaagcatttgttctgttctgcttgtttgcaactgtcaaacttggctg
ccaagaa .[ACTGCCTTTGGTTCCTTCTG| (seq id no :i)在本發明中，術語「與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記」是指這樣的分子標 記，在遺傳連鎖圖譜中，該分子標記與穀子抗除草劑基因的遺傳連鎖距離小於2cM或者小 於3cM ；或者在穀子的大於400個樣本中，抗拿捕淨型或部分抗拿捕淨型的樣本中含有該分
3子標記。抗拿捕淨型或部分抗拿捕淨型的確定參見後文中的描述。在本發明中，具體地，所述除草劑為拿捕淨。拿捕淨是一種選擇性強的內吸傳導型 莖葉處理劑，能被禾本科雜草的莖葉迅速吸收，並傳導到頂端和節間分生組織，使其細胞分 裂遭到破壞。拿捕淨在禾本科與雙子葉植物間選擇性很高，對闊葉作物安全，廣泛應用於 除去稗草、野燕麥、狗尾草、馬唐、牛筋草、看麥娘、野黍、臂形草、黑麥草、稷屬、旱雀麥、狗牙 根、蘆葦、冰草、假高粱、白茅等禾本科雜草。本發明的還一方面涉及本發明的分子標記的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示SIsvl223F TCAGTTTGCAGACCTGGACT(SEQ ID NO 2)SIsvl223R CAGAAGGAACCAAAGGCAGT(SEQ ID NO 3)。本發明的分子標記也可以為含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段；該 DNA片段的長度為適當長度，但並不特別限定，例如，小於10，OOObp、小於5，OOObp、小於 2，OOObp、小於 1，500bp、小於 1，200bp、小於 1，OOObp、或者小於 800bp。在本發明的一個實施方案中，所述分子標記(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)為穀子基因組中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO 1的5』端和/或3』端以外的核苷酸序列也是穀子基因組中的序列，優選地，為谷 子基因組中SEQID NO :1的5』端和/或3』端的上下遊序列。本領域技術人員可以理解， 只要擴增或者檢測穀子基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增得到含有SEQ ID N0:1所示的序列。SEQ ID NO :1的5，端和/或3，端的上下遊序列的長度為適當長度，並 不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小於10，OOObp、小於5，OOObp、小於2，OOObp、小於 1，500bp、小於 1，200bp、小於 1，OOObp、或者小於 800bp。在本發明的一個實施方案中，所述分子標記(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)所包含的SEQ ID NO 1的5，端和/或3，端可操作地連接有人工序列和/或 控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術語「可操作地」 在本發明中定義為一種如下構象，在該構象中，控制序列例如啟動子被適當地置於SEQ ID NO 1的一個位置上，以致該控制序列指導SEQ ID NO 1編碼的多肽的產生。本發明的另一方面涉及一種重組載體，其含有本發明的分子標記。所述重組載體 可以是插入有本發明的分子標記的表達載體或者克隆載體。本發明的還一方面涉及一種重 組細胞，其含有該重組載體。本發明的還一方面涉及本發明的分子標記的製備方法，包括下述步驟使用抗拿 捕淨型或部分抗拿捕淨型的穀子的基因組DNA作為模板，以上述引物進行PCR擴增，得到的 擴增產物即含有所述分子標記；優選地，還包括將PCR擴增產物進行純化的步驟。對本領域技術人員而言，可以理解，也可以DNA化學合成的方法得到本發明的分 子標記。本發明的還一方面涉及所述分子標記的檢測方法，包括下述步驟(1)根據本發明的分子標記的核苷酸序列設計引物；(2)以被檢測穀子的基因組DNA作為模板進行擴增；(3)判斷擴增產物中是否存在該分子標記。例如，可以以被檢測穀子的基因組DNA為模板，以上述引物(SEQID NO :2和SEQ IDNO 3)進行PCR擴增，得到擴增產物。可以將得到的擴增產物進行測序或者凝膠電泳。本發明的還一方面涉及本發明的分子標記在穀子抗除草劑基因定位或檢測中的 用途。本發明的還一方面涉及一種穀子抗除草劑基因定位的方法，包括使用本發明的分 子標記的步驟。本發明的還一方面涉及本發明的分子標記在穀子輔助育種中的用途。本發明的還一方面涉及一種穀子輔助育種方法，包括檢測本發明的分子標記的步
馬聚ο本發明的分子標記可用於今後的分子標記輔助育種中，本領域技術人員可以理 解，比如通過檢測是否存在本發明的分子標記來篩選穀子是否抗除草劑(例如，可以參考， DNA分子標記在小麥抗病育種中的用途，隴東學院學報(自然科學版)，2006年4月第16卷 第1期，P65-69)。檢測出具有本發明的分子標記的為抗拿捕淨型或部分抗拿捕淨型，不具 有該分子標記的為不抗拿捕淨型。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述 的本發明的分子標記引物。所述檢測還可以通過測序方法進行。該穀子輔助育種方法具有 簡便、快速、高通量的優點。在本發明中，具體地，所述穀子可以為張谷1號、穀子A2不育系、張雜谷3號、或張 雜谷3號自交產生的F2代。其中，張谷1號、或張雜谷3號自交產生的部分F2代(芽苗葉 片正常)為抗拿捕淨型；張雜谷3號、或張雜谷3號自交產生的部分F2代(芽苗葉片褪色) 為部分抗拿捕淨型；穀子A2不育系、張雜谷3號自交產生的部分F2代(芽苗葉片枯死)， 為不抗拿捕淨型。上述抗拿捕淨型、部分抗拿捕淨型、不抗拿捕淨型是通過下述方法確定的配置4L 15g/L的Agar powder (瓊脂粉)培養基水溶液，滅菌鍋滅菌溶化。待 其溫度冷卻至50°C左右加入6ml的拿捕淨(購自阿拉丁試劑(中國)有限公司，貨號 1113709)，倒平皿，培養基厚度約0.8cm左右。培養基冷卻後，撒F2代種子於培養基中，置 於光培室中培養3天，統計芽苗葉片情況是正常，褪色，還是枯死。其中，芽苗葉片正常的為 抗拿捕淨型，褪色的為部分抗拿捕淨型，枯死的為不抗拿捕淨型。發明的有益效果本發明提供了與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記，並將穀子基因組DNA與 穀子抗除草劑基因聯繫起來，更有利於穀子分子標記輔助育種體系的建立；所述分子標記 與抗除草劑基因的遺傳緊密連鎖距離為0. 5cM。本發明的分子標記可以簡便、快速、高通量 地應用於穀子輔助育種。
圖1 分子標記引物(SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3)對F2代480個單株擴增的部
分結果。其中泳道1-12為F2代中12株抗拿捕淨型和部分抗拿捕淨型的單株的PCR擴增產 物；泳道14-25為F2代中12株不抗拿捕淨型的單株的PCR擴增產物。泳道13為marker， 其為 200bp DNA Ladder ；其分子量包括:4000bp、3000bp、2500bp、2000bp、1800bp、1600bp、 1400bp、1200bp、IOOObp、800bp、600bp、400bp、以及 200bp。結果顯示抗拿捕淨型和部分抗
5拿捕淨型的植株中條帶大小為553bp，不抗拿捕淨型的植株中條帶大小小於553bp。關於生物材料保藏的說明本發明涉及以下生物材料1.張谷1號種子，其於2010年9月6日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)， 保藏編號為CCTCC NO :P201012，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心， 430072。2.穀子A2不育系種子，其於2010年9月6日保藏於中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201013，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保 藏中心，430072。3.張雜谷3號種子，其於2010年9月6日保藏於中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201010，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保 藏中心，430072。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體 條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規產品。實施例1 穀子F2代分離群體的構建父本為張谷1號抗拿捕淨型(株型高，株高為150cm左右)，旗葉長而窄，剛毛紅 色，穎殼紅色，可育，葉色偏綠。母本為A2不育系不抗拿捕淨型(株型矮，株高為IOOcm左右)，旗葉短而寬，剛 毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃。父本和母本雜交得到Fl (張雜谷3號，部分抗拿捕淨型，株高為130cm左右)。Fl代自交產生F2代群體，共得到480個單株。對480個F2代個體按照前述確定 抗拿捕淨類型的方法進行抗拿捕淨性狀分析，發現抗拿捕淨型和部分抗拿捕淨型共360株 (其中抗拿捕淨型120株，部分抗拿捕淨型240株)，不抗拿捕淨型120株。實施例2 父母本以及Fl代、F2代個體基因組DNA的提取用CTAB法分別提取實施例1中的父母本、Fl代、以及480個F2代個體的基因組 DNA,具體方法如下(1)稱取1. Og新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨後加入3mll. 5XCTAB，研磨成 勻漿轉入15ml的離心管中，然後往研缽中加入Iml 1. 5 X CTAB衝洗再轉入離心管中。混勻 後於65°C水浴30分鐘，期間不時緩慢搖勻。其中1. 5XCTAB 配方如下(IL)CTAB15gIM Tris. Cl (pH 為 8. 0)75ml0. 5M EDTA30mlNaCl61. 4g 加去離子水定容至1L，使用前加入終濃度為0. 2% (2ml)的巰基乙醇。
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(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24 1)，輕輕混勻，至下層液變為 深綠色。(3) 4200rpm離心10分鐘，將上層水相移到新的15ml離心管，加2倍體積預冷的無 水乙醇，混合靜止5分鐘。於-20°C放置30分鐘沉澱DNA。(4) 4200rpm離心10分鐘，棄掉上清，加入Iml 75%乙醇洗滌沉澱1次，倒置離心 管幹燥DNA，加入200 μ 1 TE溶解DNA。(5)用0. 8%的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA。(6)將得到的父母本以及Fl代、F2代個體的基因組DNA存於_20°C備用。實施例3 分子標記的製備以實施例2中提取的父本、Fl代、或F2代中的抗拿捕淨型或部分抗拿捕淨型的基 因組DNA為模板，以分子標記引物(SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3)進行PCR擴增。PCR反應體系如下無菌水20. 2 μ 1IO^Buffer (含 Mg2+)2. 5 μ 1dNTPs (25mM)0. 15μ 1Taq 酶(5υ/μ1)0. 15 μ 1正向引物0·5μ1反向引物0·5μ1模板Ι.ΟμΙ總體積25 μ 1PCR反應程序如下94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72延伸40秒，運行35個循 環；最後72°C延伸3分鐘。PCR擴增產物可以在4°C保存。將擴增產物純化，得到分子標記。純化後進行測序，結果如SEQ IDNO :1所示。對本領域技術人員而言，可以理解，也可以通過DNA化學合成的方法得到該分子 標記。實施例4 分子標記引物的初步篩選對父本進行de novo 測序(60X contig N50 :22K, scaffold N50 :320K ；Total size :400Mb)，母本重測序(10X)。根據父母本測序數據，利用SOAP軟體(例如S0AP2. 20，可以從http://SOap. genomics, org. cn/下載，也可以使用其它的序列比對軟體)比較父母本之間的序列差異， 然後基於差異的序列，在父本5』端和3』端外側約50bp位置，隨機選取20bp左右的長度， 用primerpremier軟體隨機設計引物，一共設計了 1105對引物，下面的表1中示出了其中 的部分引物的序列(SEQ ID N0:2-41)。表1 :1105對隨機引物中的部分引物
引物序號引物序列SEQ ID NO:1TCAGTTTGCAGACCTGGACT2
權利要求
一種與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；或者其為含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段。
2.一種重組載體，其含有權利要求1所述的分子標記。
3.—種重組細胞，其含有權利要求2所述的重組載體。
4.權利要求1所述的分子標記的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO :2和SEQ ID NO 3 所示。
5.權利要求1所述的分子標記的製備方法，包括下述步驟使用抗拿捕淨型或部分抗拿捕淨型的穀子的基因組DNA作為模板，以權利要求4所述 的引物進行PCR擴增；優選地，還包括將PCR擴增的產物進行純化的步驟；具體地，所述抗 拿捕淨型的穀子為張谷1號或張雜谷3號自交產生的F2代中的抗拿捕淨型；所述部分抗拿 捕淨型的穀子為張雜谷3號或張雜谷3號自交產生的F2代中的部分抗拿捕淨型。
6.權利要求1所述的分子標記的檢測方法，包括下述步驟(1)根據權利要求1的分子標記的核苷酸序列設計引物；(2)以被檢測穀子的基因組DNA作為模板進行擴增；(3)判斷擴增產物中是否存在該分子標記。
7.權利要求1所述的分子標記在穀子抗除草劑基因定位或檢測中的用途。
8.一種穀子抗除草劑基因定位的方法，包括使用權利要求1所述的分子標記的步驟。
9.權利要求1所述的分子標記在穀子輔助育種中的用途。
10.一種穀子輔助育種方法，包括檢測權利要求1所述的分子標記的步驟。
全文摘要
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種分子標記，具體地，涉及一種與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記，其核苷酸序列如SEQID NO1所示，或者其為穀子基因組中含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段。本發明還涉及該分子標記的引物、該分子標記在穀子抗除草劑基因定位或穀子遺傳育種中的用途、一種穀子抗除草劑基因定位方法、以及一種穀子育種方法。本發明發現了與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記SIsv1223，將穀子基因組DNA序列與穀子抗除草劑基因聯繫起來，更有利於穀子分子標記輔助育種體系的建立。
文檔編號C12N15/10GK101985620SQ201010553359
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月22日 優先權日2010年11月22日
發明者倪雪梅, 全志武, 夏秋菊, 張耕耘 申請人:深圳華大基因科技有限公司