新四季網

免疫原性減弱的經修飾β幹擾素的製作方法

2023-12-02 23:19:56

專利名稱:免疫原性減弱的經修飾β幹擾素的製作方法
技術領域:
本發明涉及尤其是用於對人施用的、特別是用於治療的多肽。所述的多肽是經修飾的多肽,其中,所述的修飾使得上述多肽在施用於人體時引起免疫應答的傾向減弱。本發明特別涉及對人幹擾素,特別是人β幹擾素(IFNβ)進行修飾以產生IFNβ蛋白變體,該變體在體內使用時基本上無免疫原性,或比未經修飾的相應蛋白的免疫原性低。本發明還涉及來自上述未經修飾蛋白的T-細胞表位肽,由此可以構建免疫原性減弱的經修飾IFNβ變體。
背景技術:
有許多例子表明治療蛋白的效率受限於針對所述治療蛋白的幹擾性免疫反應。已有若干種小鼠單克隆抗體表現出治療多種人類疾病的前景,但在某些情況下由於誘導出相當程度的人抗小鼠抗體(HAMA)應答而未能成功應用[Schroff,R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885;Shawler,D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對於單克隆抗體,已發展了多種技術以試圖減弱HAMA應答[WO 89/09622;EP0239400;EP 0438310;WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常是減少最終的抗體構建體中小鼠的遺傳信息,同時增加最終構建體中人的遺傳信息。儘管如此,在許多個體中,所得的「人源化」抗體仍然引起患者的免疫應答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449,456;Rebello,P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體並不是唯一一類作為治療劑施用並可引起免疫應答的多肽分子。即使是來源於人且具有與人體內蛋白相同胺基酸序列的蛋白也可以在人體內誘導免疫應答。值得注意的例子包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子[Wadhwa,M.等(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和幹擾素α2[Russo,D.等(1996)Bri.J.Haem.94300-305;Stein,R.等(1988)New Engl.J.Med.3181409-1413]等的治療性應用。
誘導免疫應答的主要因素是在蛋白中存在可經由MHC II類分子的呈遞作用激活T-細胞活性的肽(即所謂的T-細胞表位)。這種潛在的T-細胞表位通常定義為任何具有與MHC II類分子結合能力的胺基酸序列。可測定此種T-細胞表位以建立MHC結合。隱含地,「T-細胞表位」是指當其與MHC分子結合時可被T-細胞受體(TCR)識別的表位,並且至少原則上,這種表位可以通過使TCR促進T-細胞應答而激活這些T-細胞。但可以理解,某些可與MHC II類分子結合的肽可能存留在蛋白序列中,因為這種肽在施用此最終蛋白的生物中被識別為「自身的」。
已知這些T-細胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白在細胞中降解的過程中釋放出來,隨後由主要組織相容性複合體(MHC)分子呈遞以便引發T-細胞激活作用。對於MHC II類分子呈遞的肽,這種T-細胞激活作用可,例如通過直接刺激B細胞產生抗體而引起抗體應答。
MHC II類分子是一組高度多態的蛋白,其對輔助T細胞篩選和激活起重要作用。人白細胞抗原群DR(HLA-DR)是這組蛋白的主要同種型也是本發明的焦點所在。鑑於同種型HLA-DQ和HLA-DP行使類似的功能,本發明對此兩者均適用。MHC II類DR分子由α和β鏈組成,其C-末端插入並穿越細胞膜。每一異源二聚體都具有可與長度在9到20個胺基酸範圍內變化的肽相結合的配體結合結構域,但是結合溝中最多容納11個胺基酸。配體結合結構域由α鏈的1-85位胺基酸和β鏈的1-94位胺基酸組成。最近的研究表明DQ分子具有同源的結構,預期DP家族蛋白也非常類似。在人中已發現了DR同種型的約70種不同同種異型,對於DQ有30種不同的同種異型,對於DP有47種不同的同種異型。每一個體帶有2到4個DR等位基因,兩個DQ及兩個DP等位基因。許多DR分子的結構已闡明,這種結構指向一種帶有許多疏水口袋的開口肽結合溝,所述的疏水口袋與肽的疏水殘基(口袋殘基)相互作用[Brown等,Nature(1993)36433;Stern等,(1994)Nature 368215]。確立不同II類分子同種異型的多態性有助於肽結合溝中的不同肽結合表面的廣泛多樣性,並且在群體水平保證有關識別外來蛋白和引發針對病原生物免疫應答的最大靈活性。在配體結合結構域內存在相當數量的多態性,並且在不同地域和種族群體存在著顯著不同的「家族」。這一多態性影響著肽結合結構域的結合特性,因此,不同的DR分子「家族」對不同序列屬性的肽具有特異性,但也可以有一些重疊。這種特異性決定了最終負責驅動針對B細胞表位的抗體應答的Th-細胞表位識別(II類T-細胞應答),所述的B細胞表位存在於衍生所述Th-細胞表位的相同蛋白上。因此,個體中針對蛋白的免疫應答在很大程度上受到T-細胞表位識別作用的影響,這種識別作用是個體中與HLA-DR同種異型的肽結合特異性的函數。因而,為對全球種群背景下的肽或蛋白中的T-細胞表位進行鑑定,需要考慮到儘可能多樣的HLA-DR同種異型組的結合特性,由此覆蓋儘可能高比例的世界上的種群。
針對治療性蛋白(如IFNβ)的免疫應答通過MHC II類肽呈遞途徑進行。其間外來蛋白經吞噬和加工後與DR、DQ或DP型MHC II類分子結合以進行呈遞。MHC II類分子由專門抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞、樹突狀細胞等表達。通過在T細胞表面的關聯性T-細胞受體與MHCII類肽複合物相互作用,加之與某些其他共同受體,如CD4分子交聯可誘導T-細胞進入激活狀態。上述激活作用可導致細胞因子釋放,進一步激活其他淋巴細胞如B細胞以產生抗體或激活T殺傷細胞形成完整的細胞免疫應答。
肽與給定的MHC II類分子結合以備在APC表面呈遞的能力依賴於多種因素,最主要的是肽的一級結構。這影響其蛋白酶剪切傾向及其在MHC II類分子的肽結合隙中的結合親和性。在APC表面的MHC II類/肽複合物向能識別決定簇的特定T-細胞受體(TCR)呈遞一個結合面,其中所述決定簇由肽和MHC II類分子的暴露殘基共同提供。
本領域中有鑑定能結合MHC II類分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。這種肽不是在所有情況下都行使T細胞表位的功能,特別是在體內會受加工途徑和其他現象的影響。T-細胞表位鑑定是表位清除的第一步。鑑定及從蛋白中去除潛在T-細胞表位先前已有公開。本領域中已有檢測T-細胞表位的方法,通常是通過計算機手段在經試驗確定的T-細胞表位中掃描公認的序列基元,或利用計算機技術預測MHC II類結合肽,特別是DR-結合肽。
WO98/52976和WO00/34317中公開了鑑定具有與人MHC II類DR同種異型亞群結合的潛在能力的多肽序列的計算機穿線方法(computational threading approaches)。這些教導中,通過在人源或非人源治療性抗體或非抗體蛋白一級序列中進行準確的胺基酸替換以去除預測的T-細胞表位。
此外,利用重組MHC分子與合成肽的可溶性複合物(該複合物能與來自於人或受試實驗動物外周血液樣品中的T-細胞克隆相結合)的技術也在本領域中有所應用[Kern,F.等(1998)Nature Medicine 4975-978;Kwok,W.W.等(2001)TRENDS in Immunology 22583-588]。這些及其他的方案,包括利用完整的IFNβ蛋白或IFNβ衍生的合成肽或其變體分子(這些分子可用於篩選具有改變的結合或刺激T-細胞能力的分子)的技術也可以用於表位鑑定策略中。
根據上述描述,由此可能期望鑑定、去除或至少減少給定的具有重要的治療價值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-細胞表位。
IFNβ是這些有治療價值的分子之一。該分子是166個胺基酸殘基的單鏈糖蛋白,具有重要的生物學和免疫學活性。該蛋白作為抗病毒、抗增殖和免疫調節劑在人體中具有重要的治療潛力。目前已有多種商業化的重組IFNβ,包括Biogen公司(Cambridge,MA,USA)生產的AVONEX;Serono Internationa(瑞士,日內瓦)生產的Rebif和Chiron公司(Emeryville,CA,USA)生產的Betaseron。AVONEX和Rebif的胺基酸序列與天然的人IFNβ的序列一致,其產物都是糖基化的。相反,Betaseron是由大腸桿菌表達宿主產生的IFNβ突變形式,其中第17位的半胱氨酸突變為絲氨酸殘基。這是一種具有165個胺基酸殘基、分子量為18500的非糖基化蛋白。
成熟的人IFNβ蛋白是具有166個胺基酸殘基的單鏈多肽,分子量為22500,其可由不同的細胞類型(包括成纖維細胞和巨噬細胞)產生。人IFNβ的胺基酸序列(以單字母密碼表示)如下MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN也有人公開了IFNβ分子,包括經修飾的IFNβ,如突變的和非糖基化的(aglycosylated)的形式,如Betaseron和Runkel等所述的一系列丙氨酸掃描突變體[Runkel,L.等(2000)Biochemistry 392538-2551]。其他的例子參見US4,588,585和US6,127,332,但這些教導並沒有認識到T-細胞表位對所述蛋白免疫原性的重要性,也不能據此聯想到按照本發明的方案以特異的、可控制的方式直接影響所述蛋白的性質。
但是,一直存在對具有改進的性質的IFNβ類似物的需要。所需要的改進包括用於表達和純化所述治療劑的可供選擇的方案和形式,以及尤其是所述蛋白生物學性質的改善。特別需要改進的是在施用於人體時在體內的特性。在這方面,非常需要提供對人體具有減弱的或沒有誘導免疫應答可能性的IFNβ。
發明概述及內容本發明提供了經修飾的人幹擾素β1a,在這裡稱作「IFNβ」,其中,通過減少或去除大量潛在的T-細胞表位的方式對該因子的免疫學特性進行修飾。
本發明公開了在IFNβ一級序列內鑑定的序列,由於它們具有與MHC II類分子結合的可能性,所以是潛在的T-細胞表位。這一內容特別涉及具有166個胺基酸殘基的人IFNβ蛋白。
本發明還公開了在基本上不影響生物學活性的前提下需要通過特定的胺基酸替代、添加或缺失進行改變的本發明分子的一級序列中的特定位點。在只有同時喪失生物學活性才能去掉免疫原性的情況下,可通過在所述蛋白的胺基酸序列中做進一步的改造以恢復所述的活性。
本發明還公開了生產這種經修飾的分子的方法,尤其是鑑定需要改變以減少或去除免疫原性位點的T-細胞表位的方法。
預期本發明的蛋白在人體中的循環時間會延長,因此對慢性或復發性疾病,如IFNβ的多種適應症特別有益。本發明提供經修飾的IFNβ蛋白,預期其在體內將表現出改進的性質。本發明公開了IFNβ一級序列中對人具有免疫原性的主要區域,並提供了用以去除或減弱這些位點的免疫原性作用的序列修飾。在一個實施方案中,包含所述免疫原性區域的合成肽可用於藥物組合物中以促進針對整個分子的耐受性應答。在另一個實施方案中,可將本發明的經修飾的IFNβ分子用於藥物組合物。
總之,本發明涉及下述內容●一種經修飾的分子,其具有IFNβ的生物學活性,且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子;●如上所述的分子,其中,所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位而實現的;●如上所述的分子,其中,所述的免疫原性喪失是通過減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量來實現的;●如上所述的分子,其中,去除了一個T-細胞表位;●如上所述的分子,其中,原本存在的T-細胞表位是MHC II類配體,或表現出經II類分子呈遞作用後有刺激或結合T-細胞的能力的肽序列;●如上所述的分子,其中,所述的肽序列選自如

圖1所示的組;●如上所述的分子,其中,任何原本存在的T-細胞表位中的1-9個胺基酸殘基,優選1個胺基酸殘基發生了改變;
●如上所述的分子,其中,所述胺基酸殘基的改變是用其他的胺基酸殘基在特定的位置替代、添加或缺失原本存在的胺基酸殘基;●如上所述的分子,其中,按圖2所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代;●如上所述的分子,其中,另外還按圖3所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代以減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量;●如上所述的分子,其中,按圖4所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代;●如上所述的分子,其中,在需要時常通過替代,添加或缺失特定的胺基酸作進一步改變以恢復所述分子的生物學活性;●如上所述的分子,其中,所述的改變在一串連續的殘基序列中的一個或多個殘基上進行,所述序列為(a)QFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQ(R1)和/或(b)RYYGRILHYLKAKEYSHCAWT(R2),其中,所述序列來自野生型IFNβ序列;●包含來自上述序列(a)或(b)中的13-15個連續殘基的肽分子;●包含來自上述序列(a)或(b)中的至少9個連續殘基的肽分子;●如上所述的肽分子,其與來自上述(a)或(b)的肽序列具有90%以上的胺基酸同一性;●如上所述的肽分子,其與來自上述(a)或(b)的肽序列具有80%以上的胺基酸同一性;●如上所述的肽序列,其能與MHC II結合;●如上所述的IFNβ分子,其中,在相應於上述序列(a)中指定的任意胺基酸的位置處進行一個或多個胺基酸替代;●如上所述的IFNβ分子,其中,在相應於上述序列(b)中指定的任意胺基酸的位置處進行一個或多個胺基酸替代;●如上所述的IFNβ分子,其中,在相應於上述序列(a)或(b)中指定的任意胺基酸的位置處進行一個或多個胺基酸替代;●由下述序列組成的免疫原性減弱的經修飾人幹擾素β(IFNβ)MSYNLLGFLQRSSNFQX0QKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQX1QKEDAAX2TX3X4EX5X6QNX7X8AX9X10RQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN其中,X0是C、S;X1是F、A;X2是L、A;X3是I、A;X4是Y、N;X5是M、A;X6是L、A;X7是I、T;X8是F、H;X9是I、A且X10是F、A;而且排除X1=F,X2=L,X3=I,X4=Y,X5=M,X6=L,X7=I,X8=F,X9=I和X10=F同時成立的情況(這些被排除的情況描述的是已知的未經免疫遺傳修飾的IFNβ變體);●由下述序列組成的免疫原性減弱的經修飾人幹擾素β(IFNβ)MSYNLLGFLQRSSNFQX0QKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRX1X2GRX3X4HX5X6KAKEX7SHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN其中,X0是C、S;X1是Y、A;X2是Y、A;X3是I、A;X4是L、A;X5是Y、S;X6是L、A且X7是Y、H、A;而且排除X1=Y,X2=Y,X3=I,X4=L,X5=Y,X6=L和X7=Y同時成立的情況(這些被排除的情況描述的是已知的未經免疫遺傳修飾的IFNβ變體);●由9-15個連續的胺基酸殘基組成的IFNβ分子,該分子由未經修飾的IFNβ一級序列構建、具有潛在的MHC II結合活性,其在細胞增殖生物學試驗中的刺激指數至少為1.8,優選1.8-2,更優選>2,其中所述的指數通過將經肽刺激後的細胞增殖得分值除以未接受肽刺激的對照細胞的增殖得分值而得到,其中的細胞增殖可通過任何適宜的方法測定;●含有任何上述具有MHC II結合活性的肽或經修飾肽的藥物組合物;●編碼任何上述和下述經修飾分子的DNA序列或分子;●藥物組合物,其包含具有IFNβ的生物學活性的經修飾分子;●如上述和/或權利要求中定義的藥物組合物,其還任選地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑;
●製造如上引用的任何權利要求中所定義的具有IFNβ的生物學活性的經修飾分子的方法,該方法包括下述步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的胺基酸序列;(ii)通過任意方法,包括利用體外或計算機(insilico)技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合,由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位;(iii)設計新的序列變體,其中,經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾,由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性,這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定;(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變體,並檢測所述的變體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變體;和(v)任選地重複步驟(ii)-(iv);●如上所述的方法,其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細胞表位中替代、添加或缺失1-9個胺基酸殘基來進行的;●如上所述的方法,其中,所述的改變是參照同源蛋白質序列和/或計算機模擬技術進行的;●如上所述的方法,其中步驟(ii)是通過下述步驟進行的(a)在所述的肽中選擇一個具有已知胺基酸序列的區域;(b)然後由所選擇的區域中順序抽取預定統一大小且至少由3個胺基酸殘基組成的重疊胺基酸殘基片段;(c)通過對存在於抽樣胺基酸殘基片段中的每個疏水胺基酸殘基側鏈賦值求和,計算每一抽樣片段的MHC II類分子結合分值;和(d)根據計算出的該片段的MHC II類分子結合分值鑑定至少一個適於修飾的片段,以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變整體的MHC II結合分值;步驟(c)優選地通過下述步驟利用經改進而包含了12-6範德華配體-蛋白能量排斥項和配體構象能量項的Bhm評分函數(scoring function)進行,所述步驟為(1)提供MHC II類分子模型第一資料庫;(2)提供所述MHC II類分子模型的容許肽主鏈(allowed peptide backbone)的第二資料庫;(3)從第一資料庫中篩選模型;(4)從第二資料庫中篩選容許肽主鏈;(5)鑑定在每個抽樣片段中存在的胺基酸殘基側鏈;(6)確定存在於每個抽樣片段中的所有側鏈的結合親和性值;以及對每一模型和每一所述的主鏈重複步驟(1)到(5);●選自圖1的具有潛在的MHC II類結合活性且由未經修飾的IFNβ構建的13肽T-細胞表位肽,及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同生物學活性的任何未經修飾的分子的IFNβ中的用途;●由上述的13肽T-細胞表位肽中的至少9個連續的胺基酸殘基組成的肽序列,及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有人幹擾素β的生物學活性的任何未經修飾的分子的IFNβ中的用途。
●選自上述序列(a)或(b)的具有潛在的MHC II類結合活性且由未經修飾的IFNβ構建的13肽T-細胞表位肽,及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有人幹擾素β的生物學活性的任何未經修飾的分子的IFNβ中的用途;●由得自上述序列(a)或(b)的13肽T-細胞表位肽中至少9個連續的胺基酸殘基組成的肽序列,及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有人幹擾素β的生物學活性的任何未經修飾的分子的IFNβ中的用途。
根據對本發明的理解,術語「T-細胞表位」是指具有下述能力的胺基酸序列,即能結合MCH II、能刺激T-細胞和/或以與MHC II的複合物的形式結合(但不一定可測量地激活)T-細胞。此處及後附權利要求中所用的術語「多肽」是指包含兩個或多個胺基酸的化合物。胺基酸之間通過肽鍵相連(定義見下)。肽的生物生產中涉及20種不同的天然胺基酸,任意數量的所述胺基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環。用於生物生產肽中的天然胺基酸全部具有L-構型。可應用常規的合成方法利用L-胺基酸、D-胺基酸或兩種不同構型的胺基酸的各種組合製備合成肽。一些肽僅包含少量的胺基酸單元。例如含有不到10個胺基酸的短肽有時被稱作「寡肽」。其他的包含大量胺基酸殘基,例如達100個或更多個胺基酸殘基的肽稱作「多肽」。習慣上將含有3個或3個以上胺基酸的任何肽鏈多看作「多肽」,而將「寡肽」視為特定類型的「短」多肽。因而本文所提到的「多肽」也包括寡肽。而且,所用到的「肽」包括多肽、寡肽和蛋白。不同的胺基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此,多肽的數量以及可形成的蛋白的數量實際上是無限的。
「α碳(Cα)」是肽鏈中碳-氫(CH)組分中的碳原子。「側鏈」是Cα的側基,其可包含簡單的或複雜的基團或部分,且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發明可應用於與此處公開的IFNβ具有基本上相同的一級胺基酸序列的任何IFNβ分子,因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可能包含多於或少於166個胺基酸殘基的IFNβ。
IFNβ蛋白,如從其他哺乳動物來源中鑑定出的相關蛋白與本發明中公開的肽序列之間存在大量共有序列,且與列表中公開的肽序列間存在大量基本上相同的共有序列。因此這樣的蛋白序列也落入本發明的保護範圍。
本發明是為了克服實際應用中存在的下述問題,即將可溶性蛋白引入自體生物中可引發免疫應答,產生可與所述可溶性蛋白相結合的宿主抗體。其中的一個突出的例子是幹擾素α2(IFNα2)的臨床用途。儘管這一蛋白是內源產生的,但許多用IFNα2治療的病人都會產生針對它的抗體[Russo,D.等(1996)出處同上;Stein,R.等(1988)出處同上]。已知在臨床上使用IFNβ進行治療時也導致針對IFNβ的免疫應答,儘管可在人體中內源性地產生至少一級結構相同的IFNβ分子[Kivisakk,P.等(2000)Eur.J.Neurol.727-34;Myhr,K.M.等(2000)Neurology 551569-1572]。本發明試圖通過提供在施用於人體時引發免疫應答的傾向發生改變的IFNβ蛋白來解決上述問題。依照本發明的方法,本發明人發現並公開了IFNβ分子中包含關鍵T-細胞表位的區域,所述的表位可驅動針對這一自體蛋白的免疫應答。
本發明中形成經修飾的IFNβ的總的方法包括下述步驟(a)確定多肽或其中一部分的胺基酸序列;(b)通過任意方法,包括利用體外或計算機技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合,由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位;(c)設計新的序列變體,其中,經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾,由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性,這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定。構建此序列變體並避免由所述的序列變體產生新的潛在T-細胞表位,否則所述的新的潛在T細胞表位又通過此種方式進行修飾以基本上減弱或消除T-細胞表位的活性;和(d)通過重組DNA技術構建所述序列變體,並檢測所述的變體以便根據已知的重組技術鑑定一個或多個具有所需特性的變體。
對於步驟(b)中對潛在T-細胞表位的鑑定可依照本領域已公知的方法進行。在WO 98/59244;WO 98/52976;WO 00/34317中也公開了適當的方法,並優選用於鑑定IFNβ-衍生的肽對MHC II類分子的結合傾向。
在實施例1中公開了另一種非常有效的通過計算鑑定T-細胞表位的方法,它是本發明的優選實施方案。
實踐中,將製備許多IFNβ蛋白變體並檢測所需的免疫和功能特性。最優選通過重組DNA技術生產所述的變體蛋白,同時也可以利用其他的方法,包括化學合成IFNβ片段。化學合成特別優選用於合成短的IFNβ片段,如本文公開的R1或R2序列單元,其包含於本發明的具體實施方案中。
涉及166個胺基酸殘基的IFNβ蛋白序列的根據上述方案中步驟(b)的分析結果列於圖1。涉及本發明的經修飾分子的根據上述方案中步驟(c)和(d)所得的設計結果和構建體列於圖2和3。
本發明涉及IFNβ類似物,其中,在可以導致所述蛋白中潛在的T細胞表位的活性明顯減弱或從所述蛋白中去除一個或多個潛在的T-細胞表位活性的位點替代了至少一個胺基酸殘基。圖1中鑑定的任何潛在的MHC II類配體中特定位點的一個或多個胺基酸的替代,可產生當作為治療劑施用於人體時具有減弱的潛在免疫原性的IFNβ分子。
最優選提供在其母體分子中免疫原性最強的區域進行胺基酸修飾(如替代)的IFNβ分子。本發明人發現,在人IFNβ分子中免疫原性最強的區域可限定在R1和R2兩個區域,其分別包含的胺基酸序列為QFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQ和RYYGRILHYLKAKEYSHCAWT。本發明主要優選的實施方案包括這樣的IFNβ分子,對該IFNβ分子而言,圖1中的MHC II配體以及與上述R1或R2序列單元完全或至少有9個胺基酸殘基相對應的序列發生了改變從而消除了結合或減少了可與所述肽結合的MHC同種異型的數量。
本發明的優選實施方案包括圖4中所示的特定替代。特別優選提供包含圖4中所示的多個替代的組合的經修飾IFNβ分子。特別優選的組合是包括在免疫原性區域R1和R2的每一個中都進行多重(多於1)修飾的組合,以及包括對同一分子內的R1和R2的多重修飾的組合,但該優選並非意在限定可選的適當的替代組合的範圍。
為去除T細胞表位,優選地,在預計可以實現基本上減弱或去除T-細胞表位活性的肽序列中的適當位點進行胺基酸替代。實踐中,合適的位點優選等同於在MHC II類結合溝內提供的疏水口袋之一中結合的胺基酸殘基。
最優選是在所述肽中稱作P1或P1錨的位置改變在裂縫的第一口袋內的結合。公認地,肽的P1錨殘基和MHC II類結合溝第一口袋之間的結合相互作用的質量是對整個肽的總結合親和性的主要決定因素。在所述肽這一位置的適當替代應當是替換為不易容納到所述口袋中的殘基,例如替換為更親水的殘基。所述肽中相應於與MHC結合裂縫內其他口袋區域結合的位置處的胺基酸殘基也被認為是落入本發明的範圍內。
可以理解,由給定的潛在T-細胞表位內的單一胺基酸替代導致該表位去除的路線是最優選的。也可以進行單一表位內的組合替代,例如,這對於單獨定義的表位間彼此重疊的情況特別適宜。此外,在給定的表位內一個一個地進行或在一個表位內組合進行的胺基酸替代也可以發生在非對應於MHC II類結合溝的「口袋殘基」的位置,而是在所述肽內的任意位點進行。替代可參照同源結構或由本領域已知的計算機技術產生的結構方法,也可以根據本發明分子的已知結構特徵進行。所有此類替代均落入本發明的範圍內。
也可以考慮在上面所鑑定的肽之外進行胺基酸替代,特別是與在所列肽內進行的替代相結合的情況下。例如可以考慮利用某種改變恢復變體分子的結構或生物學活性。這種補償性的改變和由IFNβ多肽中缺失或添加特定的胺基酸殘基得到具有所需活性的變體的改變,以及任何本發明公開的肽中的改變均落入本發明的範圍內。
本發明的範圍涉及經修飾的IFNβ,含有上述經修飾的IFNβ蛋白或經修飾的IFNβ蛋白片段的組合物以及相關的組合物均應認為是落入本發明的範圍內。另一方面,本發明涉及編碼經修飾的IFNβ實體的核酸。另一方面本發明涉及利用經修飾的IFNβ蛋白對人進行治療的方法。另一方面,本發明還涉及利用包含具有與本文所公開的R1或R2序列相同或部分相同的序列的肽或其衍生物的藥物製劑進行治療的方法。
以下通過下述非限定性的實施例對本發明進行闡述。所述實施例涉及下述附圖圖1提供了人IFNβ中具有潛在人MHC II類結合活性的肽序列的列表。肽為13肽,胺基酸以單字母代碼表示。
圖2提供了導致人IFNβ的T-細胞表位消除的胺基酸替代的詳細列表。WT=野生型殘基。
圖3提供了導致相應於一個或多個MHC同種異型的潛在T-細胞表位去除的額外替代的詳細列表。
圖4提供了人IFNβ中的優選替代的列表。WT=野生型殘基;#=位置;MUT=所需的殘基。該表顯示每一替代所位於的表位區(R1或R2)。
圖5提供了用實施例2所述的體外人幼稚T-細胞試驗分析的IFNβ15肽肽序列的列表。表中示出了肽ID#和IFNβ序列中N-末端肽殘基的位置。
圖6顯示了來自6個對IFNβ肽的刺激產生應答的個體的累積刺激指數。圖6a顯示用1μM濃度的肽刺激後的結果。圖6b顯示用10μM濃度的肽刺激後的結果。由對來自IFNβ序列的一種或多種肽的刺激產生應答的20個供體中篩選出6個。對單個肽產生的應答分成兩個不同的區域R1和R2。對照肽C32(DRB1-限制性的)和C49(DP-限制性的)用作比較。每一棒形條中的交叉影線表示單個供體的貢獻。SI=刺激指數。
圖7顯示了對IFNβ合成肽的供體特異性刺激應答。圖7a-7f顯示了單個供體對終濃度為1μM(淺色棒)和10μM(深色棒)的肽的應答。每個圖中均包括對照肽C32(DRB1-限制性的)和C49(DP-限制性的)的數據作為比較。陽性刺激指數的閾值=2。
圖8顯示了IFNβ中的免疫原性區域並詳細描述了這些區域中能刺激人幼稚T細胞的肽序列。
圖9提供了能促進人幼稚T細胞體外增殖的IFNβ肽的列表。對於其中的兩個供體,記錄了對來自表位區R1或R2的多重重疊肽的應答。由6個供體評分對相應於表位區R1或R2的單個合成肽的應答。
圖10提供了兩種經修飾IFNβ分子的抗增殖作用的代表性數據。按實施例4的方法進行試驗。在圖a)和b)中記錄了對照治療的抗增殖效果。對照包括未經修飾的IFNβ-Fc融合體=WT-FcIFNb;標準IFNβ製劑=RD IFNb和不含IFN的培養基=Media Con。圖a)顯示經Leu57Ala(IFNβ-BIOV7)修飾的IFNβ的數據。圖b)顯示經Phe67His(IFNβ-BIOV12)修飾的IFNβ的數據。
實施例1有多種因素對決定蛋白或多肽的總體結構起重要作用。首先是肽鍵,即將胺基酸連接在一起形成鏈的鍵,它是一種共價鍵。這種鍵是平面結構的,實質上是一種取代的醯胺。「醯胺」指含-CONH-基團的一組有機化合物中的任何一個化合物。
連接相鄰胺基酸的Cα的平面肽鍵如下所示 由於O=C和C-N原子位於一個相對剛性的平面中,所以不會發生沿這些軸的自由旋轉。因此,圖中虛線所示的平面有時被稱作「醯胺」平面或「肽平面」,肽主鏈中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氫(H)原子位於其中。Cα原子位於醯胺平面中相對的角上。由於肽或醯胺平面中的O=C和C-N原子基本上不發生旋轉,所以多肽鏈包含一系列連接Cα原子的平面肽鍵。
第二個對決定多肽或蛋白的整體結構或構象起重要作用的因素是繞共有Cα的每一醯胺平面的轉角。此後術語"轉角"和"扭轉角"是等同的術語。假定O、C、N和H原子保留在醯胺平面中(這通常是一種正確的假設,儘管在一些構象中這些原子會輕微的偏移平面),這些轉角確定了N和R多肽主鏈構象,即相鄰殘基之間的結構。這兩個轉角稱為φ和ψ。因此,一套φi和ψi角(其中,腳標i代表多肽鏈中的特定殘基)有效地規定了多肽鏈的二級結構。在文獻中定義了用於確定φ和ψ角的慣例,即在給定的多肽中醯胺平面形成0度角的參考點,以及哪個角是φ角,哪個角是ψ角的定義。參見Ramachandran等,Adv.Prot.Chem.23283-437(1968),285-94頁,這些頁中的內容在此引入作為參考。
本發明的方法可應用於任何蛋白,並部分基於下述發現,即人MHCII類分子結合溝的初級口袋1錨定位點可以具有設計好的對特定胺基酸側鏈的特異性。這一口袋的特異性由MHC II類分子β鏈第86位的胺基酸的身份來確定。這一位點位於口袋1的底部並決定可容納於這一口袋中的胺基酸側鏈的大小。Marshall,K.W.,J.Immunol.,1524946-4956(1994)。如果這一殘基是甘氨酸,則所有的疏水性脂肪族和芳香族胺基酸(疏水性脂肪族胺基酸是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸,芳香族胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容納於所述的口袋中,優選芳香族側鏈。如果這一口袋殘基是纈氨酸,則該胺基酸的側鏈伸到口袋中並限制了可容納的肽側鏈的大小,所以只有疏水性脂肪族側鏈可容納進去。因此在胺基酸殘基序列中,無論哪裡發現了帶有疏水性脂肪族或芳香族側鏈的胺基酸,即有存在MHC II類限制性T-細胞表位的可能性。但是,如果所述的側鏈是疏水性脂肪族側鏈,其與T-細胞表位結合的可能性約是芳香族側鏈的兩倍(假定1型口袋近似平均地分布於全球種群中)。
將本發明具體化的計算機方法描繪出肽區域包含T-細胞表位的可能性,該方法如下(1)掃描預定長度肽片段的一級序列,並鑑定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族側鏈。(2)對疏水性脂肪族側鏈賦予比芳香族側鏈高的值;優選兩倍於賦予芳香族側鏈的值,例如,給疏水性脂肪族側鏈賦值為2,給芳香族側鏈賦值為1。(3)將所述肽中的預定統一長度的每一重疊胺基酸殘基片段(窗口)中確定存在的值總和起來,再將某一特定片段(窗口)的總值賦予該片段(窗口)中間位置的某個單個胺基酸殘基,優選賦予處於抽樣片段(窗口)中間點的胺基酸。將這一過程對每一抽樣的重疊胺基酸殘基片段(窗口)重複進行。因此,所述肽的每一胺基酸殘基均被賦予了一個值,該值與T-細胞表位存在於此特定片段(窗口)中的可能性相關。(4)用按照上述步驟3中的描述計算、賦予的值對被評估的整個胺基酸殘基序列的胺基酸坐標作圖。(5)序列中具有預定值(例如該值為1)的所有部分均被認為可能包含T細胞表位,並且在需要時可進行修飾。在這一方面本發明提供了通用的方法,由此可描述可能包含T-細胞表位的肽區域。在這些區域中對所述的肽進行修飾有可能改變MHC II類的結合特性。
依照本發明的另一方面,可利用更複雜的計算方法更精確地預測T-細胞表位,該方法考慮了肽與MHC II等位基因模型之間的相互作用。根據這一方面,計算機預測存在於所述肽中的T-細胞表位包括,根據所有已知的MHC II類分子結構構建至少42個MHC II類等位基因模型,將這些模型應用於T-細胞表位計算機鑑定的方法,構建每一模型的肽主鏈文庫以便允許在相關肽主鏈α碳(Cα)位置具有已知的變異性,對於在肽和MHC II類分子相互作用的關鍵位置上的20種可供選擇的胺基酸中的每一種,構建與每個模型對接的每一主鏈的胺基酸側鏈構象文庫,利用這些主鏈和側鏈構象文庫並結合評分函數選擇對與特定MHC II類分子結合的特定肽而言最佳的主鏈和側鏈構象,並從這一相互作用推導出結合分數。
MHC II類分子模型可從Brookhaven蛋白資料庫("PDB")中的許多類似的結構出發通過同源建模推導得出。它們可通過使用引入了模擬退火算法的半自動同源建模軟體(Modeller,Sali A. Blundell TL.,1993.J.Mol Biol 234779-815)並結合用於能量最小化的CHARMm力場(購自Molecular Simulations Inc.,San Diego,Ca.)來製備。也可以應用其他的建模方法。
本發明的方法與下述的其他計算方法有著顯著的不同,這些方法為利用從實驗中得來的關於一小組MHC II類分子結合溝中每一位點的每一種胺基酸選項的結合數據文庫的方法(Marshall,K.W.等,Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids,1(3)157-162)(1995);或利用類似的實驗結合數據以定義所述的溝中特定結合口袋類型的結合特性(同樣利用相對小的MHC II類分子亞組)然後將這一口袋文庫中的口袋類型進行『混合和匹配』以人工構建更「實際的」MHC II類分子的方法(Sturniolo T.等,Nat.Biotech,17(6)555-561(1999)。這兩種現有方法的主要缺陷在於實驗的複雜性和需要合成大量的肽變體造成僅有少量的MHC II類分子可通過實驗掃描。因此第一種已知的方法僅能預測少量的MHC II類分子。第二種已知的方法還假設在不同II類等位基因的背景下在一個分子中襯有類似胺基酸的口袋將具有相同的結合特性,並且其另外的缺陷在於,僅僅可「實際地」地構建出那些包含口袋文庫中所包含的口袋的MHC II類分子。利用本發明的建模方法可推導出任意數量和類型的MHC II類分子的結構,因此可特異性地選擇等位基因以代表全球種群的特徵。此外,掃描的MHC II類分子的數量可通過構建更多的模型而增加而無需通過複雜的實驗獲得額外的數據。利用主鏈文庫使得被掃描的各種肽在與特定的MHC II類分子結合時其Cα原子位置處可進行變化。這也與上述現有技術中的計算機方法不同,在那些方法中依賴於利用簡化的肽主鏈來掃描結合在特定口袋中的胺基酸。這些簡化的主鏈不可能代表在「真正的」肽中的主鏈文庫構象,導致對肽結合的預測不準確。本發明的主鏈文庫是通過疊加蛋白資料庫中所有與MHC II類分子結合的肽的主鏈,並考慮到位於結合溝內的11個胺基酸的每個胺基酸的Cα原子之間的均方根(RMS)差而構建的。儘管該文庫可來自少量合適的可獲得的小鼠和人的結構(當前為13種),為了允許存在甚至更大變異的可能性,將每一C"-α位點的RMS數字提高50%。然後確定每一胺基酸的平均Cα位置,圍繞這一點劃一個球,其半徑等於在該位置的RMS差加50%。該球體代表所有可允許的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中胺基酸殘基的Cα,等同於結合溝中11個殘基的位置2)起運作,將所述的球三維網格化,網格內的每個頂點作為該胺基酸Cα的可能位置。將後續的醯胺平面(相應於與後續胺基酸的肽鍵)移動到這些Cα的每一個上面,將φ和ψ角以設定的間隔逐步地轉動以便於安置後續的Cα。如果後續的Cα落入對這一Cα而言『可被允許的位置球』中,則此二肽的方向即可被接受,如果其落入所述球之外則所得的二肽不能被接受。對每一後續Cα位置均重複這一過程,使肽從所述的口袋1Cα『種子』開始生長,直到全部9個後續的Cα的位置均根據之前Cα的所有可能排列確定下來。然後對口袋1前的單個Cα重複上述步驟1次以上以構建定位於結合溝內的主鏈Cα位置文庫。
生成的主鏈數目取決於幾種因素『可被允許的位置球』的大小;對口袋1位點處′最初的球′網格化的細度;用於定位後續Cα的φ和ψ角逐步旋轉的細度。利用這一程序可以構建大的主鏈文庫。主鏈文庫越大越可能發現對MHC II類分子結合溝內特定肽的最適主鏈。鑑於和結合結構域的胺基酸可能存在衝突,所以不是所有的主鏈均適合於與所有MHC II類分子模型『對接』(docking),故對每個等位基因建立包含適合於該等位基因的主鏈的亞文庫。
利用所述的主鏈文庫並結合MHC II類分子模型可以構建出由與每一容許主鏈對接的每一MHC II類分子結合溝的每一位點中的每一胺基酸的容許側鏈構象所組成的詳盡資料庫。可以利用簡單的立體重疊函數構建這一數據組,其中,主鏈與MHC II類分子對接,胺基酸側鏈在所需位置被嫁接到主鏈上。將側鏈上可旋轉的鍵以設定的間隔逐步旋轉,記錄下依賴於該鍵的原子的最終定位。將所述原子與結合溝側鏈原子間的相互作用記錄下來,根據下述的標準確定是否接受這些位置如此定位的所有原子的重疊總量不能超過預定值。因此,構象搜索的嚴謹度是在鍵的逐步旋轉中所用間隔及對總重疊的預定限度的函數。如果已知特定的口袋是剛性的,則後一值可較小,但若已知口袋側鏈位置相對靈活則嚴謹度可放鬆。這樣便可以模擬結合溝口袋內靈活性的變化。針對與每一MHC II類分子對接後每一主鏈的所有位點上的所有胺基酸重複這種構象搜索以建立詳盡的側鏈構象資料庫。
用適當的數學表達式評價MHC II類分子模型與肽配體構象的結合能量,所述的肽配體構象需通過掃描上述的主鏈/側鏈大資料庫根據經驗獲得。這樣,通過對每一長度在9-20個胺基酸範圍內變化(儘管對於每一次掃描長度是一定的)的可能肽進行下述計算,掃描蛋白以搜索潛在的T-細胞表位選擇MHC II類分子及適合於該分子的肽主鏈,將相應於所需肽序列的側鏈移植到其上。對於胺基酸的每一容許構象(由上述資料庫獲得),收集與主鏈上特定位點的特定側鏈相關的原子身份和原子間距數據。對沿主鏈的每一側鏈重複此過程,利用評分函數推導肽得分。保留該主鏈的最佳得分,對所選模型的每一容許主鏈重複該過程。比較所有容許主鏈的得分,最高的得分被認為是該MHC II類模型中所需肽的得分。對每一模型用從掃描的蛋白得到的所有可能肽重複上述過程,列出肽相對於模型的得分。
在本發明中,用於結合親和力計算的每種配體都是選自上述肽或蛋白的胺基酸片段。因此所述配體為來自已知序列的肽、多肽或蛋白的長度為約9到20個胺基酸的選定胺基酸鏈。此後術語「胺基酸」和「殘基」視為等同的術語。
將移植到選自上述主鏈文庫的主鏈上的待檢測肽中的連續胺基酸形式的配體,通過肽主鏈上C"-α原子坐標定位到來自MHC II類分子模型庫的MHC II類分子的結合裂縫中,並從所允許的構象數據選擇每一側鏈的允許構象。相關的原子身份和原子間距也來自這一資料庫並用於計算肽結合分數。將對MHC II類結合口袋具有高親和力的配體作為侯選標記出來用於定點誘變。在標記的配體中(也由此在目的蛋白中)進行胺基酸替代,然後用評分函數重新測定以確定使結合親和力降低到預定的閾值以下的變化。這些變化即可引入到目的蛋白中以去除T-細胞表位。
肽配體與MHC II類分子結合溝的結合涉及非共價鍵相互作用,其包括但不限於氫鍵、靜電相互作用、疏水(親脂)相互作用和範德華相互作用。它們包括在下面將詳細描述的肽評分函數中。
應當理解,氫鍵是非共價鍵,其可在極性或帶電的基團之間形成,由被兩個其他原子共享的氫原子構成。氫供體中的氫帶正電荷,而氫受體帶有部分負電荷。為肽/蛋白相互作用的目的,氫鍵供體可以是連接氫的氮,或連接在氧或氮上的氫。氫鍵受體原子可以是沒有連接氫的氧、沒有連接氫並具有一或兩個連接的氮或僅有一個連接的硫。某些原子,如連接了氫的氧或亞胺氮(如C=NH),既可以是氫受體也可以是氫供體。氫鍵的能量在3-7Kcal/mol,大大強於範德化鍵,但弱於共價鍵。氫鍵具有高度的方向性,且當供體原子、氫原子和受體原子共線時最強。
靜電鍵是在帶有相反電荷的離子對間形成的,根據庫侖定律這種相互作用的強度與原子間距離的平方成反比。離子對間的最佳距離是約2.8。在肽/蛋白相互作用中,可在精氨酸、組氨酸或賴氨酸和天冬氨酸或穀氨酸之間形成靜電鍵。該鍵的強度依賴於電離基團的pKa和介質的介電常數,儘管其與氫鍵的強度類似。
親脂相互作用是蛋白和肽配體之間發生的有利疏水-疏水相互作用。這種相互作用通常出現在埋於結合溝口袋中的肽的疏水性胺基酸側鏈間,以使它們不暴露在溶劑中。將疏水殘基暴露於溶劑中是非常不利的,因為周圍的溶劑分子被迫在彼此間形成氫鍵而形成籠狀結構。所致的熵值降低是非常不利的。親脂性原子可以是既非極性又不是氫受體的硫和非極性的碳原子。
範德華鍵是相距3-4的原子間的非特異性的力。它比氫鍵和靜電鍵弱、特異性低。原子周圍的電荷分布隨時間變化,並且在任何瞬間電荷分布均是不對稱的。這種瞬間的電荷不對稱性誘導臨近原子中的類似不對稱性。在範德華接觸距離所導致的原子之間的吸引力達到最大,而在約1到2處迅速消失。相反,當原子間隔的距離小於此接觸距離時,由於原子外部的電子云重疊使不斷增強的斥力成為主導。儘管與靜電和氫鍵相比,此吸引力相對較弱(約0.6Kcai/mol),但所述斥力對於決定肽配體是否能與蛋白成功結合可能非常重要。
在一個實施方案中,利用Bhm評分函數(SCORE1方法)評估結合常數(Bhm,H.J.,J.Comput Aided Mol.Des.,8(3)243-256(1994),該文獻在此全文引入作為參考)。在另一個實施方案中,用評分函數(SCORE2方法)評估結合親和力作為含有T-細胞表位的配體的指示物(Bhm,H.J.,J.Comput Aided Mol.Des.,12(4)309-323(1998),該文獻在此全文引入作為參考)。但是上述文獻中描述的Bhm評分函數是用於評估下述情況中配體對蛋白的結合親和力的,即已知所述的配體可成功地與所述蛋白結合,且蛋白/配體複合物的結構已解析,這一結構已列於蛋白資料庫("PDB")中。因此,利用已知的陽性結合數據對評分函數作了發展。為了區分陽性和陰性的結合體,需向方程中加入排斥項。此外,可通過以成對的方式計算親脂相互作用,而非利用上述Bhm函數中基於面積的能量項來進行更理想的結合能量評估。
因此,在一個優選實施方案中,用經修飾的Bhm評分函數評估結合能。在經修飾的Bhm評分函數中,在評估蛋白和配體之間的結合能(ΔGbind)時考慮了下述參數由於配體的平移和轉動熵的整體損失造成的結合能減低(ΔG0);理想氫鍵的貢獻(ΔGhb),其中至少一個配對物是中性的;無擾離子相互作用的貢獻(ΔGionic);親脂配體原子和親脂受體原子之間的親脂相互作用(ΔGlipo);由於配體中內在自由度的凍結,即繞每一C-C鍵的旋轉自由度降低造成的結合能損失(ΔGrot);蛋白和配體之間相互作用的能量(EVdW)。考慮到這些項給出等式1(ΔGbind)=(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)其中N是對於特定項限定的相互作用數目,在一個實施方案中,ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常數,其值分別為5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb項依照等式2計算Nhb=∑h-bondf(ΔR,Δα)×f(Nneighb)×fpcsf(ΔR,Δα)是罰函數,其解決氫鍵自理想情況的巨大偏離,其依照等式3計算f(ΔR,Δ-α)=f1(ΔR)×f2(Δα)其中如果ΔR<=TOL則f1(ΔR)=1,或者如果ΔR<=0.4+TOL則f1(ΔR)=1-(ΔR-TOL)/0.4,或者如果ΔR>0.4+TOL 則f1(ΔR)=0並且如果Δα<30°則f2(Δα)=1,或者如果Δα<=80° 則f2(Δα)=1-(Δα-30)/50,或者如果Δα>80°則f2(Δα)=0TOL=0.25,它是氫鍵鍵長中所能允許的偏差ΔR是H-O/N氫鍵鍵長與理想值=1.9的偏差
Δα是氫鍵鍵角∠N/O-H..O/N與180°理想值的偏差f(Nneighb)區分蛋白表面的凹凸部分,並因此賦予口袋中而非蛋白表面的極性相互作用更高的權重。這一函數根據下述等式4計算f(Nneighb)=(Nneighb/Nneighb,0)α,其中α=0.5Nneighb為蛋白中與任意給定蛋白原子之間的距離小於5的非氫原子的數量。
Nneighb,0是常數=25fpcs是用於估計每氫鍵的極性接觸表面面積的函數,由此區分強和弱的氫鍵,其值由下述的標準確定當Apolar/NHB<102時fpcs=β當Apolar/NHB>102時 fpcs=1Apolar是極性蛋白-配體接觸面的大小NHB是氫鍵的數目β是常數=1.2由於假定了相同的幾何相關性,在實施經修飾的Bhm評分函數時,離子相互作用的貢獻ΔGionic用與上述有關氫鍵的類似方式計算。Nlipo項按下述的等式5計算Nlipo=∑ILf(rIL)根據下述標準,對於所有親脂配體原子1和所有親脂蛋白原子L,計算f(rIL)當rIL<=R1時 f(rIL)=1當R2<rIL>R1時f(rIL)=(rIL-R1)/(R2-R1)當rIL>=R2時 f(rIL)=0其中R1=r1vdw+rLvdw+0.5R2=R1+3.0r1vdw是原子1的範德華半徑rLvdw是原子L的範德華半徑Nrot項是胺基酸側鏈中可旋轉的鍵的數目,其被視為無環的sp3-sp3及sp3-sp2鍵的數目。末端-CH3或-NH3的旋轉未考慮進去。
最後一項Evdw依照如下等式6計算Evdw=ε1ε2((r1vdw+r2vdw)12/r12-(r1vdw+r2vdw)6/r6),其中ε1和ε2是取決於原子身份的常數r1vdw+r2vdw是範德華原子半徑r是原子對間的距離。
關於式6,在一個實施方案中,ε1和ε2常數被賦予如下原子值,分別為C0.245,N0.283,O0.316,S0.316(即分別對於碳、氮、氧和硫原子)。對於式5和6,給予範德華半徑如下原子值,分別為C1.85,N1.75,O1.60,S2.00。
應當理解上述等式中所有預定的值和給定的常數都是在現有的對蛋白配體相互作用的理解局限內具體相對於此處所用的計算類型確定的。因此,隨著這種評分函數的進一步精練,這些值和常數也會因此而改變,任何能在蛋白和配體結合能的評估方面給出所需結果的適宜數值均可使用,而且,其也落入本發明的保護範圍。
如上所述,所述的評分函數應用於由上述側鏈構象、原子身份和原子間距資料庫中提取的數據。為本說明書的目的,該資料庫中包含的MHC II類分子數是42個模型加上4個已解析的結構。從上述描述中可清楚地了解到,本發明的計算機構建方法的模塊性質意味著,可簡單地添加新的模型,並利用肽主鏈文庫和側鏈構象搜索功能進行掃描以創建其它的可通過上述的肽評分函數處理的數據集。這使得經掃描的MHCII類分子庫可以很容易地增加,或者如果可以獲得相關數據,則可以替換結構和相關數據以創建現有等位基因的更精確的模型。
本發明的預測方法可以相對於包含大量已通過實驗確定了其對不同MHC II類分子的親和力的肽的數據集進行校準。將計算值與實驗數據相比較,可確定一截斷值,已知該值之上所有經實驗確定的T-細胞表位都得以正確的預測。
應當理解,儘管上述評分函數與現有的一些複雜方法相比相對簡單,但計算進行得非常迅速。還應當理解的是,其目的並不在於計算出對接到所選擇的MHC II類蛋白結合溝內的每種肽的真正結合能本身。根本的目的在於獲得相對的結合能數據以助於根據所選蛋白的一級結構(即胺基酸序列)預測T-細胞表位的定位。相對高的結合能或結合能高於選定的閾值意味著在配體中存在T-細胞表位。然後可以將所述配體進行至少一輪胺基酸替代,並再次計算結合能。由於計算可迅速進行,對肽序列的這些操作可在現有成本划算的計算機硬體上於程序用戶界面中互動進行。由此不需要對計算機硬體進行大量投資。
本領域的技術人員應當了解,也可使用其他軟體達到相同的目的。特別是可以使用能將配體對接入蛋白結合位點的更複雜的軟體,並與能量最小化相結合。對接軟體的例子包括DOCK(Kuntz等,J.Mol.Biol.,161269-288(1982)),LUDI(Bhm,H.J.,J.Comput Aided Mol.Des.,8623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等,ISMB,3300-308(1995))。分子建模和操作軟體的例子包括AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用這些計算機方法將嚴重限制本發明方法的信息吞吐量,這是由於進行必要的計算所需的處理時間導致的。但是可行的方式為,將這些方法作為『二級篩選』以獲得關於通過本發明的方法發現為『陽性結合體』的肽的更精確的肽結合能計算值。
用於複雜的分子機械或分子動力學計算的處理時間的限制是由進行所述計算的軟體設計和目前計算機硬體技術限制共同確定的。可以預期在將來,隨著編寫更高效的代碼和計算機處理器速度的不斷提高,在更易控制的時間框架內進行上述計算是可行的。
有關用於大分子的能量函數的其他信息和有關在摺疊蛋白結構內發生的多種相互作用的考慮可參考下述文獻Brooks,B.R.,等.,J.Comput.Chem.,4187-217(1983),有關蛋白-配體一般相互作用的信息參見Dauber-Osguthorpe等,Proteins 4(1)31-47(1988),這些文獻均全文引入作為參考。其他有用的背景資料也可參見Fasman,G.D.編,Prediction of Protein Structure and the Principles of ProteinConformation,Plenum Press,New York,ISBN0-306 4313-9。
實施例2MHC、肽和T細胞受體(TCR)間的相互作用為T細胞識別的抗原特異性提供了結構基礎。T細胞增殖試驗測試肽與MHC的結合以及TCR對MHC/肽複合體的識別。本發明的體外T細胞增殖試驗涉及刺激外周血單核細胞(PBMC),所述PBMC包含抗原呈遞細胞(APC)和T細胞。應用合成肽抗原(在一些實驗中應用全蛋白質抗原)在體外進行刺激。刺激引起的T細胞增殖應用3H-胸苷(3H-Thy)進行測定,且通過閃爍計數洗滌後的固定細胞來估定摻入的3H-Thy。
從National Blood Service(Addenbrooks醫院,Cambridge,UK)獲得來自存儲時間小於12小時的人血液的棕黃血沉層。Ficoll-paque從AmershamPharmacia Biotech(Amersham,UK)獲得。用於培養原代人淋巴細胞且含L-穀氨醯胺、50μg/ml鏈黴素、10μg/ml慶大黴素和0.1%人血清白蛋白的無血清AIM V培養基來自Gibco-BRL(Paisley,UK)。合成肽來自Eurosequence(Groningen,The Netherlands)和Babraham Technix(Cambridge,UK)。
對棕黃血沉層輕度離心從血漿和血小板中分離出紅細胞和白細胞。移除並棄去最上層(含血漿和血小板)。紅細胞和白細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中稀釋(1∶1),而後鋪到15ml ficoll-paque(Amersham Pharmacia,Amersham UK)上。按照生產商推薦的條件離心,從血清+PBS/ficoll paque界面收穫PBMC。將PBMC與PBS混合(1∶1)且通過離心收集。移除並棄去上清,將PBMC沉澱重懸於50ml PBS中。再次離心使細胞沉積,並棄去PBS上清。細胞用50ml AIM V培養基重懸,在此時進行記數並利用臺盼藍染料排除法評估細胞活力。再次離心收集細胞並棄去上清。將細胞以每毫升3×107個的密度重懸並低溫保存。儲存培養基為90%(v/v)熱滅活AB人血清(Sigma,Poole,UK)和10%(v/v)DMSO(Sigma,Poole,UK)。將細胞轉移到可調式冷凍容器(Sigma)中並置於-70℃過夜。需要使用時,在37℃的水浴中快速融解細胞,然後轉移到10ml預溫熱的AIM V培養基中。
將PBMC以2×105每孔的密度置於96孔平底板中,並用蛋白質和肽抗原進行刺激。在加入3H-Thy(Amersham-Phamacia,Amersham,UK)之前將PBMC在37℃下溫育7天。對於本研究,通過3aa增長方式製備重疊的合成肽(15肽)以覆蓋IFNβ的完整序列。肽標識號(ID#)和序列在圖5中給出。每種肽均單獨用分離自20個初次用於實驗的供體的PBMC進行篩選。在每一供體試驗中均使用兩種已證實具有免疫原性的對照肽和強效的非回憶性抗原KLH。
本研究中應用的對照抗原如下
將肽溶解在DMSO中,終濃度為10mM,然後將這些儲備液以1/500在AIM V培養基中稀釋(終濃度為20μM)。將肽加入到96孔平底板中,在100μl中得到2和20μM的終濃度。融解的PBMC的活力用臺盼藍染料排除法確定,然後以2×106個細胞/ml的密度重懸細胞,並將100μl(2×105PBMC/孔)轉移到每個含肽的孔內。對於每個肽濃度重複測試三個孔的培養物。將平板在含5%CO2的潮溼空氣中於37℃溫育7天。將細胞用1μCi3H-Thy/孔脈衝18-21小時,然後收穫到過濾墊上。用Wallac微平板β頂部計數器(Perkin Elmer)測定CPM數值。將結果表示為刺激指數,所述指數用以下公式確定
利用T細胞增殖試驗繪製IFNβ序列中的T細胞表位圖,結果鑑定出兩個免疫原性區R1和R2。這是由6個對一個或多個這些區域中的肽產生應答的供體中的T細胞增殖確定的。區域1和2在某些個體中誘導T-細胞增殖。應答個體的累積應答數據如圖6所示,單個應答個體的數據如圖7所示。在圖8和9中描述了IFNβ的表位數據並顯示了R1和R2及單獨的肽/供體應答。
實施例3利用常規的重組DNA技術製備大量的經修飾IFNβ分子。用野生型IFNβ基因作為對照試劑及模板,由此通過定點誘變衍生出經修飾的基因。將野生型和經修飾的基因插入到真核表達載體中,重組IFNβ蛋白與人免疫球蛋白恆定區結構域作為融合蛋白表達。從瞬間轉染的人胚腎細胞製備重組蛋白,並按照實施例4的描述進行分析。
為獲得人胚腎細胞的表達,由ATTCC獲得野生型人IFNβ基因(ATCC登錄號#31902)並PCR克隆到載體pd-Cs[Lo等(1998),ProteinEngineering 11495]中。載體pd-Cs指導含人免疫球蛋白恆定區結構域的融合蛋白的表達。含野生型IFNβ基因的pd-Cs載體稱作pdCsIFNβWT。
以pdCs IFNβWT作為模板通過突變PCR進行單個或多個密碼子突變以形成經修飾的IFNβ基因。利用重疊PCR將兩個突變幹擾素半序列結合起來。用XmaI和BamHI消化503bp的PCR產物,然後用Qiagen凝膠提取試劑盒純化並轉移到已事先用XmaI和BamHI去除了IFNβ序列的pd-Cs中。篩選陽性克隆,通過序列分析確定IFNβ序列。
在另外的反應中用側翼引物OL575和OL576並結合特異誘變(錯配)引物和pdCs IFNβWT模板DNA進行誘變。OL575(XmaI)5′CTCCCTGTCCCCGGGTATGAG 3′OL576(XhoI/BamHI)5′-CTTATCATGTCTGGATCCCTCGAG-3′反應用Expand HI Fidelity PCR試劑(Roche,GmbH)進行,反應條件如下94℃/2′+25個循環×94℃/30",60℃/30",72℃/30"+72℃/10′。
通過PCR在由引物OL575和OL576驅動的反應中用15個上述的PCR循環將各反應的產物連接起來。
利用可商購的試劑盒系統(Qiagen凝膠提取試劑盒)將PCR產物通過凝膠純化。用BamHI和XmaI消化所需的克隆並將純化的產物連接到製備好的pd-Cs載體中。按照製造商建議的條件用大腸桿菌XL1-Blue細胞(Strategene Europe)進行克隆。用OL575和OL576作為測序引物對所有最終載體製備物進行序列確認。
用HEK293人胚腎細胞系作為表達宿主來表達經修飾的IFNβ-1a人IgFc融合蛋白。所有用於轉染的DNA均用高純度的QIAGEN midi-prep系統並按照供應商(QIAGEN,Crawley,UK)提供的使用說明來製備。DNA在使用前通過過濾除菌,並通過測定A260進行定量。將濃度調節到0.5-1.0μg/μl。
為進行瞬間轉染,用添加了10%FBS和250μg/ml遺傳黴素的DMEM L-Glutamax培養基(Invitrogen,Paisley,UK)培養HEK293細胞。轉染前,通過用胰蛋白酶處理收集細胞並用PBS洗滌。清洗兩輪後,將細胞以4×105細胞/ml的密度置於新鮮培養基中,然後加入預先用聚-l-賴氨酸處理過(以保證細胞貼壁良好)的多孔皿中。一般地,向48孔平板的各個孔內加入2×105個細胞,將平板於37℃/5%CO2條件下溫育過夜。
轉染前,更換各孔中的培養基並加入轉染混合物。用供應商(Invitrogen,Paisley,UK)提供的脂質體轉染試劑Lipofectamine和使用說明進行轉染。簡言之,對於每一表達載體構建體,製備每孔含Lipofectamine、OPTI-MEM(Invitrogen,Paisley,UK)和0.8μg DNA的轉染混合物。將轉染混合物添加到細胞中後,使細胞溫育4-6個小時。培養基用0.5ml新鮮培養基更換,並且將細胞在37℃/5%CO2條件下溫育。48小時後取樣進行抗-Fc ELISA和Daudi細胞增殖試驗。7天後收穫培養基並於4℃保存,用於按如上所述作進一步的分析。
通過用ELISA檢測IFNβ-融合蛋白中的人免疫球蛋白恆定區結構域來檢測培養基中IFNβ的存在。該試驗使用小鼠抗人IgG Fc製劑(Sigma,Poole,UK)作為捕獲試劑。IFNβ-HuFc融合蛋白參照標準曲線定量,所述標準曲線用人IgG參考製劑(Sigma)的系列稀釋物製成。結合的IFNβ-Fc融合蛋白或參考蛋白用抗-人IgG過氧化物酶結合物(Sigma)和SigmaOPD比色底物進行測定。
在評估出HEK.293條件培養基中的IFNβ的量後,通過實施例4所述的抗增殖試驗,將條件培養基直接用於測定經修飾IFNβ的功能活性。
實施例4測試本發明的經修飾幹擾素分子抑制人B細胞淋巴瘤細胞系Daudi生長的能力。該方法在文獻[Mark,D.F.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666]中有大致地描述,包括將Daudi細胞與待測試的幹擾素一起溫育。所測試分子的抗增殖效果利用可溶性染料物質(其在增殖細胞存在時會發生顏色的變化)進行測定。所引起的顏色變化在分光光度計上測定,抗增殖效果參照在未經處理的對照細胞和用標準幹擾素製劑處理的細胞中記錄的顏色變化進行計算。
簡要地說,將Daudi細胞(ATCC#;CCL-213)用添加了100單位/ml青黴素/100μg/ml鏈黴素和2mM L-穀氨醯胺及20%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基培養。所有的培養基和添加物購自Gibco(Paisley,UK)。試驗前一天,將細胞以0.9×106/ml的密度換入新鮮的培養基中,第二天換入除含10%(v/v)FBS外其它與以上所述的培養基相同的新鮮培養基中。將細胞密度調整為2×105細胞/ml。
將試驗和對照幹擾素製劑用含10%FBS的RPMI稀釋。將稀釋液加入96孔平底板中,每孔100μl,所有樣品均設有三個重複試驗。一般每一平板橫向排列成倍系列稀釋物。陽性對照孔也同樣地設置三份,其中幹擾素標準物(RD Systems,Abingdon,UK)的起始濃度為20000pg/ml。還包括僅含100μl培養基(無幹擾素)的對照孔。每孔添加100μl細胞,將平板於37℃,5%CO2條件下溫育72小時。
用Aqueous One試劑系統和供應商推薦的方案(Promega,Southampton,UK)對增殖進行評估。簡言之,向各孔添加40μl AqueousOne試劑並將底物混合。將平板於37℃下溫育1小時,然後轉移到平板讀數器上測定吸光度。在490nm下讀數。以490nm下的平均吸光度作為Y軸,以添加的幹擾素標準物的濃度作為X軸繪圖。幹擾素的濃度按實施例3中所述的方法利用ELISA技術測定。對於每種突變體,實現使50%的細胞生長受到抑制所需的IFNβ-1a的濃度(EC50)通過吸光度-濃度曲線來確定。
根據以上方法對多種經修飾的IFNβ-1a分子進行分析,結果如圖10所示。該結果表明,在IFNβ序列中存在胺基酸替代的情況下保留了抗增殖特性。
權利要求
1.一種經修飾的分子,其具有人幹擾素β(IFNβ)的生物學活性,且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子。
2.如權利要求1所述的分子,其中,所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位和/或減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量而實現的。
3.如權利要求2所述的分子,其中,去除了一個T-細胞表位。
4.如權利要求2-4中任意一項所述的分子,其中,原本存在的T-細胞表位是MHC II類配體,或表現出經MHC II類分子呈遞作用後有刺激或結合T-細胞的能力的肽序列。
5.如權利要求4所述的分子,其中,所述的配體或肽序列是13肽或15肽。
6.如權利要求5所述的分子,其中,所述的肽序列選自如圖1所示的組。
7.如權利要求2-6中任意一項所述的分子,其中,任何原本存在的T-細胞表位中的1-9個胺基酸殘基發生了改變。
8.如權利要求7所述的分子,其中,有一個胺基酸殘基發生了改變。
9.如權利要求7或8所述的分子,其中,所述胺基酸殘基的改變是用其他的胺基酸殘基在特定的位置替代原本存在的胺基酸殘基。
10.如權利要求9所述的分子,其中,按圖2所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代。
11.如權利要求10所述的分子,其中,另外還按圖3所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代以減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量。
12.如權利要求9所述的分子,其中,按圖3所示進行一個或多個胺基酸的替代。
13.如權利要求7或8所述的分子,其中,所述胺基酸殘基的改變是在特定的位置缺失原本存在的胺基酸殘基。
14.如權利要求7或8所述的分子,其中,所述胺基酸殘基的改變是在特定的位置向原始序列中添加胺基酸殘基。
15.如權利要求7-14中任意一項所述的分子,其中,進行進一步的改變以恢復所述分子的生物學活性。
16.如權利要求15所述的分子,其中,進一步的改變是替代、添加或缺失特定的胺基酸。
17.如權利要求7-16中任意一項所述的經修飾的分子,其中,所述胺基酸的改變是參照同源蛋白序列進行的。
18.如權利要求7-16中任意一項所述的經修飾的分子,其中,所述胺基酸的改變是參照計算機模擬技術進行的。
19.如權利要求7-16中任意一項所述的經修飾的分子,其中,所述的胺基酸改變是參照IFNβ衍生肽或IFNβ蛋白對T細胞的刺激或結合而進行的。
20.一種經修飾的分子,該分子具有人幹擾素β(IFNβ)的生物學活性,且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子,該分子可通過下述步驟在一級序列內改變一個或多個胺基酸而獲得(i)除去源自原始的未修飾分子且為MHC II類配體或表現出經MHC II類分子呈遞後有刺激或結合T-細胞能力的肽序列的一個或多個T細胞表位,和/或(ii)減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量,其中,所述經修飾的分子包括在如下源自野生型IFNβ的一級序列的連續胺基酸殘基鏈中的一個或多個位點進行的改變(a)QFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQ(R1),(b)RYYGRILHYLKAKEYSHCAWT(R2)。
21.如權利要求20所述的分子,其中所述的改變是1-9個胺基酸殘基的替代。
22.如權利要求21所述的分子,其中所述的替代是在鏈R1和R2的一個或多個胺基酸殘基處進行的。
23.如權利要求21所述的分子,其中所述的替代是在鏈R1的一個或多個胺基酸殘基處進行的。
24.如權利要求21所述的分子,其中所述的替代是在鏈R2的一個或多個胺基酸殘基處進行的。
25.如權利要求20-24中任意一項所述的分子,其中,在鏈R1或R2的序列之外,還額外進行了一個或多個胺基酸殘基的替代。
26.如權利要求20-25中任意一項所述的分子,其中包含在野生型分子中的一個或多個下述位點進行的胺基酸殘基替代50、57、59、60、62、63、66、67、69、70、125、126、129、130、132、133、138。
27.如權利要求26所述的分子,其中,所述的替代在選自下列的一個或多個位點進行50、57、59、60、62、63、66、67、69或70。
28.如權利要求26所述的分子,其中,所述的替代在選自下列的一個或多個位點進行125、126、129、130、132、133或138。
29.如權利要求26所述的分子,其中,所述的替代在57和67位進行。
30.如權利要求29所述的分子,其中,所述的替代是L57A和F67H。
31.如權利要求30所述的分子,其中所述的額外替代是在選自下列的一個或多個位點進行的50、59、60、62、63、66、69、70、125、126、129、130、132、133、138。
32.如權利要求27所述的分子,其中,所述的替代選自F50A、L57A、I59A、Y60N、M62A、L63A、I66T、F67H、I69A、F70A。
33.如權利要求28所述的分子,其中,所述的替代選自Y125A、Y126A、I129A、L130A、Y132S、L133A、Y138H、Y138A。
34.如權利要求31所述的分子,其中,所述的額外替代選自F50A、I59A、Y60N、M62A、L63A、I66T、I69A、F70A、Y125A、Y126A、I129A、L130A、Y132S、L133A、Y138H、Y138A。
35.一種經修飾的分子,該分子具有人幹擾素β(IFNβ)的生物學活性,且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子,該分子可通過下述步驟在一級序列內替代一個或多個胺基酸而獲得(i)除去源自原始的未修飾分子且為MHC II類配體或表現出經MHC II類分子呈遞後有刺激或結合T-細胞能力的肽序列的一個或多個T細胞表位,和/或(ii)減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量,其中,所述的替代在野生型IFNβ分子的一個或多個位置處進行,對應於選自下列的組中的至少一個(i)L57A、F67H,(ii)F50A、L57A、I59A、Y60N、M62A、L63A、I66T、F67H、I69A、F70A,和(iii)Y125A、Y126A、I129A、L130A、Y132S、L133A、Y138H、Y138A(iv)序列R1中的任何位點,和(v)序列R2中的任何位點。
36.如權利要求35所述的分子,其中,在序列R1中進行一個或多個選自下列的替代F50A、L57A、I59A、Y60N、M62A、L63A、I66T、F67H、I69A、F70A。
37.如權利要求35所述的分子,其中,在序列R2中進行一個或多個選自下列的替代Y125A、Y126A、I129A、L130A、Y132S、L133A、Y138H、Y138A。
38.具有減弱的免疫原性的經修飾人幹擾素β(IFNβ),其由下述序列組成MSYNLLGFLQRSSNFQX0QKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQX1QKEDAAX2TX3X4EX5X6QNX7X8AX9X10RQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN其中X0是C、S;X1是F、A;X2是L、A;X3是I、A;X4是Y、N;X5是M、A;X6是L、A;X7是I、T;X8是F、H;X9是I、A;且X10是F、A;其中不包括X1=F,X2=L,X3=I,X4=Y,X5=M,X6=L,X7=I,X8=F,X9=I且X10=F同時成立的情況。
39.具有減弱的免疫原性的經修飾人幹擾素β(IFNβ),其由下述序列組成MSYNLLGFLQRSSNFQX0QKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRX1X2GRX3X4HX5X6KAKEX7SHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN其中X0是C、S;X1是Y、A;X2是Y、A;X3是I、A;X4是L、A;X5是Y、S;X6是L、A;且X7是Y、H、A;其中不包括X1=Y,X2=Y,X3=I,X4=L,X5=Y,X6=L且X7=Y同時成立的情況。
40.如權利要求38所述的經修飾IFNβ序列,其包含如權利要求39所述的額外替代。
41.如權利要求38-40中任意一項所述的經修飾IFNβ序列,其中進行了額外替代。
42.如權利要求41所述的經修飾IFNβ序列,其中,在R1和/或R2部分序列中的一個或多個位點進行額外替代,其中R1和R2如權利要求20所定義。
43.編碼權利要求1-42中任意一項所述的經修飾IFNβ的DNA序列。
44.一種藥物組合物,其包含上述任意一項權利要求中所定義的具有IFNβ的生物學活性的經修飾分子,並可任選地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
45.生產上述任意一項權利要求中所定義的具有IFNβ的生物學活性的經修飾分子的方法,該方法包括下述步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的胺基酸序列;(ii)通過任意方法,包括利用體外或計算機技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合,由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位;(iii)設計新的序列變體,其中,經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾,由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性,這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定,或通過肽-MHC複合物與T-細胞的結合來確定;(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變體,並檢測所述的變體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變體;和(v)任選地重複步驟(ii)-(iv)。
46.如權利要求45所述的方法,其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細胞表位中替代、添加或缺失1-9個胺基酸殘基來進行的。
47.如權利要求45所述的方法,其中,所述的改變是參照同源蛋白序列和/或計算機模擬技術進行的。
48.如權利要求45-47中任意一項所述的方法,其中,步驟(ii)是通過下述步驟進行的(a)在所述的肽中選擇一個具有已知胺基酸序列的區域;(b)然後由所選擇的區域中順序抽取預定統一大小且至少由3個胺基酸殘基組成的重疊胺基酸殘基片段;(c)通過對存在於抽樣胺基酸殘基片段中的每個疏水胺基酸殘基側鏈賦值求和,計算每一抽樣片段的MHC II類分子結合值;和(d)根據計算出的該片段的MHC II類分子結合分值鑑定至少一個適於修飾的片段,以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變整體的MHC II類的結合分值。
49.如權利要求48所述的方法,其中,步驟(c)通過下述步驟利用經改進而包含了12-6範德華配體-蛋白能量排斥項和配體構象能量項的Bhm評分函數進行,所述步驟為(1)提供MHC II類分子模型第一資料庫;(2)提供所述MHC II類分子模型的容許肽主鏈的第二資料庫;(3)從所述的第一資料庫中篩選模型;(4)從所述的第二資料庫中篩選容許肽主鏈;(5)鑑定在每個抽樣片段中存在的胺基酸殘基側鏈;(6)確定存在於每個抽樣片段中的所有側鏈的結合親和性值;以及對每一模型和每一所述的主鏈重複步驟(1)到(5)。
50.一種由13個連續的胺基酸殘基組成的肽分子,其具有潛在的MHC II類結合活性且由未經修飾的IFNβ的一級序列構建,並且選自圖1所示的組。
51.一種由12個或更多個連續的胺基酸殘基組成的肽分子,其具有潛在的MHC II類結合活性且由未經修飾的IFNβ的一級序列構建,並且選自權利要求20所定義的R1和R2部分序列中的任意一個。
52.選自圖8的如權利要求51所述的肽分子。
53.由至少9個連續的胺基酸殘基組成的肽序列,其選自如權利要求50-52中所述的T細胞表位肽。
54.由9-15個連續的胺基酸殘基組成的肽分子,其具有潛在的MHC II類結合活性且由未經修飾的IFNβ的一級序列構建,其中所述分子在細胞增殖生物學試驗中的刺激指數為至少1.8並且優選為2或更大,其中所述的指數通過將經肽刺激後的細胞增殖得分值除以未接受肽刺激的對照細胞的增殖得分值而得到,其中的細胞增殖可通過任何適宜的方法測定。
55.如權利要求50-54中任意一項所述的肽用於生產在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同或可接受程度降低的生物學活性的任何未修飾分子的IFNβ的用途。
56.由權利要求20所定義的序列R1或R2衍生的肽或肽序列用於給病人接種疫苗以降低體內針對IFNβ的免疫應答的用途。
57.一種藥物組合物,其包含由權利要求20所定義的R1或R2衍生的合成肽序列,並任選地含有藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
全文摘要
本發明涉及尤其是用於對人施用的、特別是用於治療的多肽。所述的多肽是經修飾的多肽,其中,所述的修飾使得上述多肽在施用於人體時引起免疫應答的傾向減弱。本發明特別涉及對人幹擾素β進行修飾以產生在體內使用時基本上無免疫原性,或比未經修飾的相應蛋白的免疫原性低的蛋白。
文檔編號A61P37/02GK1496369SQ02806597
公開日2004年5月12日 申請日期2002年3月15日 優先權日2001年3月15日
發明者F·J·卡爾, G·卡特, T·瓊斯, J·沃特金斯, M·貝克爾, F J 卡爾, 亟鷀, 碩 申請人:默克專利有限公司

同类文章

一種新型多功能組合攝影箱的製作方法

一種新型多功能組合攝影箱的製作方法【專利摘要】本實用新型公開了一種新型多功能組合攝影箱,包括敞開式箱體和前攝影蓋,在箱體頂部設有移動式光源盒,在箱體底部設有LED脫影板,LED脫影板放置在底板上;移動式光源盒包括上蓋,上蓋內設有光源,上蓋部設有磨沙透光片,磨沙透光片將光源封閉在上蓋內;所述LED脫影

壓縮模式圖樣重疊檢測方法與裝置與流程

本發明涉及通信領域,特別涉及一種壓縮模式圖樣重疊檢測方法與裝置。背景技術:在寬帶碼分多址(WCDMA,WidebandCodeDivisionMultipleAccess)系統頻分復用(FDD,FrequencyDivisionDuplex)模式下,為了進行異頻硬切換、FDD到時分復用(TDD,Ti

個性化檯曆的製作方法

專利名稱::個性化檯曆的製作方法技術領域::本實用新型涉及一種檯曆,尤其涉及一種既顯示月曆、又能插入照片的個性化檯曆,屬於生活文化藝術用品領域。背景技術::公知的立式檯曆每頁皆由月曆和畫面兩部分構成,這兩部分都是事先印刷好,固定而不能更換的。畫面或為風景,或為模特、明星。功能單一局限性較大。特別是畫

一種實現縮放的視頻解碼方法

專利名稱:一種實現縮放的視頻解碼方法技術領域:本發明涉及視頻信號處理領域,特別是一種實現縮放的視頻解碼方法。背景技術: Mpeg標準是由運動圖像專家組(Moving Picture Expert Group,MPEG)開發的用於視頻和音頻壓縮的一系列演進的標準。按照Mpeg標準,視頻圖像壓縮編碼後包

基於加熱模壓的纖維增強PBT複合材料成型工藝的製作方法

本發明涉及一種基於加熱模壓的纖維增強pbt複合材料成型工藝。背景技術:熱塑性複合材料與傳統熱固性複合材料相比其具有較好的韌性和抗衝擊性能,此外其還具有可回收利用等優點。熱塑性塑料在液態時流動能力差,使得其與纖維結合浸潤困難。環狀對苯二甲酸丁二醇酯(cbt)是一種環狀預聚物,該材料力學性能差不適合做纖

一種pe滾塑儲槽的製作方法

專利名稱:一種pe滾塑儲槽的製作方法技術領域:一種PE滾塑儲槽一、 技術領域 本實用新型涉及一種PE滾塑儲槽,主要用於化工、染料、醫藥、農藥、冶金、稀土、機械、電子、電力、環保、紡織、釀造、釀造、食品、給水、排水等行業儲存液體使用。二、 背景技術 目前,化工液體耐腐蝕貯運設備,普遍使用傳統的玻璃鋼容

釘的製作方法

專利名稱:釘的製作方法技術領域:本實用新型涉及一種釘,尤其涉及一種可提供方便拔除的鐵(鋼)釘。背景技術:考慮到廢木材回收後再加工利用作業的方便性與安全性,根據環保規定,廢木材的回收是必須將釘於廢木材上的鐵(鋼)釘拔除。如圖1、圖2所示,目前用以釘入木材的鐵(鋼)釘10主要是在一釘體11的一端形成一尖

直流氧噴裝置的製作方法

專利名稱:直流氧噴裝置的製作方法技術領域:本實用新型涉及ー種醫療器械,具體地說是ー種直流氧噴裝置。背景技術:臨床上的放療過程極易造成患者的局部皮膚損傷和炎症,被稱為「放射性皮炎」。目前對於放射性皮炎的主要治療措施是塗抹藥膏,而放射性皮炎患者多伴有局部疼痛,對於止痛,多是通過ロ服或靜脈注射進行止痛治療

新型熱網閥門操作手輪的製作方法

專利名稱:新型熱網閥門操作手輪的製作方法技術領域:新型熱網閥門操作手輪技術領域:本實用新型涉及一種新型熱網閥門操作手輪,屬於機械領域。背景技術::閥門作為流體控制裝置應用廣泛,手輪傳動的閥門使用比例佔90%以上。國家標準中提及手輪所起作用為傳動功能,不作為閥門的運輸、起吊裝置,不承受軸向力。現有閥門

用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法

專利名稱:用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法背景技術:1-本發明所屬領域本發明涉及一種用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置,其中的管狀容器被放在循環於配送鏈上的文檔匣或託架裝置中。本發明特別適用於,然而並非僅僅專用於,對引入自動分析系統的血液樣本試管之類的自動識別。本發明還涉及專為實現讀