植物的一個dreb轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法

2024-01-28 09:05:15 3

專利名稱：植物的一個dreb轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物轉錄因子及其編碼基因與應用，特別是涉及一個來源於鹽生植物畢氏海蓬子的DREB轉錄因子及其編碼基因，以及其在培育耐鹽性提高的轉基因植物中的應用。屬於分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
土壤鹽漬化是嚴重影響農業生產和生態環境的非生物脅迫因素之一。因此，提高作物耐鹽性從而培育耐鹽新品種，對鹽鹼地的充分利用及提高農業產量具有重要意義。乾旱應答元件結合蛋白(DREB)類轉錄因子屬於乙烯應答元件結合蛋白(AP2/EREBP)家族的一類成員，特異存在於植物中，它能特異結合啟動子中含有DRE/CRT的順式作用元件並激活其下遊基因的表達。DRE/CRT順式作用元件普遍存在於脅迫應答相關基因的啟動子中， 因此DREB轉錄因子可以通過參與調控許多脅迫相關基因的表達及功能行使，對乾旱、高鹽和低溫等非生物脅迫產生響應，因而導入或改良一個轉錄因子是提高作物耐鹽性更為有效的方法和途徑。畢氏海蓬子(fe/icoraia bigelovii Tbrr.)是世界上最耐鹽的高等植物之一， 其嫩尖可作為蔬菜，其種子可榨油。作為典型的鹽生植物，畢氏海蓬子抗鹽能力超過海水鹽度的20% 40%，耐鹽極限達到5% NaCl濃度，其最適生長環境的NaCl鹽分高達200 mmol / LCGlenn et al.，1998)。對畢氏海蓬子的研究表明，它不具備鹽腺等特化結構，也不顯著積累有機滲透調節劑，因此是研究植物耐鹽機制的極好的基因庫。從真鹽生植物畢氏海蓬子中克隆DREB同源基因並研究其功能，將為抗鹽脅迫的遺傳改良提供新的材料和方法。畢氏海蓬子DREB轉錄因子基因的分離和鑑定工作為利用基因工程技術將獲得的外源基因導入植物，從而獲得抗鹽基因超表達的轉基因植物奠定基礎，這些植物應用到高鹽鹼的極端環境中，可以改良土壤、改善環境、擴大植被面積，具有重要的理論研究價值和廣泛的應用前景。

發明內容
本發明的目的在於提供一個來源於畢氏海蓬子的DREB類轉錄因子及其編碼基因。本發明提供的一個DREB類轉錄因子，名稱為fe/icoraia bi gel ovii Torr. DRE biding protein (簡稱 5),來源於畢氏海蓬子(feh'coraia bi gel ovii Torr.)，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質
a)序列表中的SEQID Ne=I ；
b)將序列表中SEQID N2=I的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有轉錄激活功能的調控植物抗逆性的胺基酸殘基序列。其中，序列表中的SEQ ID Nq :1由284個胺基酸殘基組成，自氨基端(N端)第100 位至第158位胺基酸殘基為保守的AP2/EREBP結構域。
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所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。在畢氏海蓬子的一個DREB轉錄因子中所述蛋白質具有序列表中SEQ ID N2=I的
胺基酸殘基序列。一種上述畢氏海蓬子的一個DREB轉錄因子的編碼基因，其特徵在於
a)序列表中SEQID N2 2的DNA序列；
b)編碼序列表中SEQID N2=I蛋白質序列的多核苷酸序列；
c)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為在0. IX SSPEO^O. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C條件下雜交並洗膜。列表中的SEQ ID N2 2由1206脫氧核苷酸組成，其編碼序列為自5』端第192位至1043位脫氧核苷酸，編碼具有序列表中SEQ ID N2 1的胺基酸殘基序列的蛋白質。含有本發明基因的表達載體、細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。擴增 5 任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。本發明的另一目的是提供一種將本發明中的DREB類轉錄因子5 在調控植物耐鹽性的應用。本發明所提供的調控植物耐鹽性的應用，是將所述編碼鹽地鹼蓬DREB類轉錄因子的基因SbDREB導入植物組織或細胞，植物耐鹽性獲得調控。所述編碼畢氏海蓬子DREB類轉錄因子的基因SbDREB可通過含有SbDREB的植物表達載體導入外植體；用於構建所述植物表達載體的出發載體可為任意一種雙元農桿菌載體或可用於植物微彈轟擊的載體等，如pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pAHC25或其他衍生植物表達載體；使用本發明的SbDREB構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型、組織特異型、誘導型或增強型啟動子；為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入具有抗性的抗生素標記(卡那黴素、潮黴素等)或抗化學試劑標記基因(如抗除草劑bar基因等)及可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或蛋白等(GUS基因、GFP基因等)。攜帶有SbDREB的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接 DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物細胞或組織培育成植株。上述通過轉基因調控植物耐鹽性的方法對所有植物均適用，既可適用於單子葉植物(小麥、水稻、玉米等)，也可以適用雙子葉植物(菸草、棉花等)。本發明提供的5 基因來自畢氏海蓬子，實時定量PCR檢測結果表明在鹽和乾旱脅迫下，5 在畢氏海蓬子葉片中的表達量明顯提高，表明其受高鹽和乾旱的的強烈誘導，它與畢氏海蓬子的耐鹽、抗旱性有關。轉基因菸草實驗證明該基因的超量表達提高了菸草的耐鹽性。因此，5^5/可作為目的基因導入植物(包括單子葉和雙子葉植物)，提高植物耐鹽性，具有較高的實際應用價值。


圖1為SbDREB與其他植物DREB AP2/EREBP結構域胺基酸序列的多重比對結果； 圖2為SbDREB的系統進化樹；圖3為不同脅迫對5 mRNA表達影響的實時定量PCR檢測結果； 圖4為mpCAMBIA2301載體物理圖譜； 圖5為mpCAMBIA2301: SbDREB植物表達載體物理圖譜； 圖6為mpCAMBIA2301 SbDREB轉基因菸草的PCR驗證照片； 圖7為mpCAMBIA2301 SbDREB轉基因菸草的RT-PCR驗證照片； 圖8為mpCAMBIA2301 SbDREB轉基因菸草的耐鹽實驗結果。具體發明實施方式
下述實施例中的方法如無特別說明，均為常規方法。實施例1 畢氏海蓬子SbDREB的克隆
利用生物信息學和常規聚合酶鏈式反應(PCR)相結合的方法克隆畢氏海蓬子DREB類轉錄因子編碼基因SbDREB的DNA序列，具體方法為 (1)5 基因片段的擴增
選用畢氏海蓬子的葉片作為實驗材料，用植物基因組提取試劑盒(Takara)提取畢氏海蓬子基因組DNA。根據DREB類轉錄因子保守區的胺基酸序列WGKWVAEI和YKPLHSSV，設計一對簡併引物(引物由上海生物工程公司合成) 正向引物SEQ ID N2 3
5，-TGGGGG(T)AAG(A)TGGGTC(T)GCC(A/T)GAA(G)ATC(T)CG-3，， 反向引物SEQ ID N2 4
5，-ACG (A/T)GAG (A/T)GAG(A)TGG(A/T/C)AGA(T)GGC(T)TTG(A)TA-3，。採用Takara的LA-Taq酶，以畢氏海蓬子的基因組為模板進行常規聚合酶鏈式反應(PCR)。25 μ 1 PCR 反應體系2. 5μ 1 含MgCl2 的 10 X PCR緩衝液，取 10μ M 的引物 SEQ ID N2 3 和 SEQ ID 4 各 1. 0 μ 1，1. 0 μ 1 IOmM 的 dNTP(脫氧核苷酸混合物)，1. 0 μ 1 DNA 樣品，0. 25μ ILA-Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)，18. 5μ 1雙蒸水。PCR反應條件95°C 預變性5分鐘，95 0C變性30秒，55 0C復性45秒，72 °C延伸1分鐘，35個循環後，72 °C延伸10 分鐘。將擴增得到的約200bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司) 按試劑盒提供的方案回收該片段，用PGEM - T vector系統(Promega公司，美國)按試劑盒說明克隆該片段，測序(上海生物工程公司)。序列分析表明該序列編碼的胺基酸序列與 DREB類蛋白的保守區片段高度同源，因此確定獲得了 SbDREB基因片段。(2 ) SbDREB基因cDNA全長的克隆
取經鹽誘導後畢氏海蓬子葉片作為實驗材料，採用SV Total RNA lysis試劑盒 (Promega公司，美國)提取總RNA。根據已經獲得的5 基因片段，我們設計了兩條特異性引物(由上海生物工程公司合成)做為3』 RACE的5』端引物 SbD3，GSPl :SEQ ID N2 :5 5' - CTCGTCTATGGCTCGGAACATTCC - 3' SbD3，GSP2 :SEQ ID Nq :6 : 5』 -GATCTCATGTCACCACCCAATTTG- 3，，
3』端引物由3』 RACE試劑盒(invitrogen公司(美國))提供。取Iyg總RNA進行 3』 RACE, RACE程序按照invitrogen公司提供的3』 RACE試劑盒說明書進行。
用SEQ ID Nq :5與3』端引物進行第一輪PCR擴增，所得PCR產物經稀釋100倍後取1 ul做為模板，用SEQ ID N2 :6與3』端引物進行第二輪PCR擴增，獲得該基因的cDNA 的3，端。第一輪與第二輪PCR反應條件均為95°C預變性3 min後，94°C 45s，55°C 45s， 72°C 1 min，共；35個循環；然後72°C延伸10 min。根據已經獲得的5 基因片段，我們設計了 5』 RACE的兩條3』端特異引物(由上海生物工程公司合成)，分別為
SbD5，GSPl :SEQ ID N2 :7 5』 -AGAGACCAAATTGGGTGGTGACAT- 3』 SbD5，GSP2 :SEQ ID Nq :8 : 5』 -GACGAGTTCGATTCTTAGGCAATC- 3』， 試劑盒提供的5』端通用引物AAP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG- 3' 試劑盒提供的 5，sites Adaptor Primer AUAP 5' -GGCCACGCG TCGACTAGTAC- 3'
取1 μ g總RNA進行5，RACE, RACE程序按照invitrogen公司(美國)提供的5，RACE試劑盒說明書進行。SEQ ID 7與試劑盒提供的5』端通用引物ΑΑΡ:進行第一輪PCR擴增，所得PCR 產物經稀釋100倍後取1 ul做為模板，用SEQ ID 乂:8與試劑盒提供的5』 sites Adaptor Primer AUAP引物進行第二輪PCR擴增，獲得該基因cDNA的5』端。兩輪PCR反應條件均為95°C預變性 3 min 後，94°C 45s，58°C 45s，72°C 1 minlOs，共；35 個循環；然後 72°C延伸 10 min。所得5，-RACE產物經克隆測序後，與3 』 -RACE產物測序結果進行拼接(採用DNAMAN 生物學軟體進行序列拼接)，獲得5 全長cDNA序列。用Iyg畢氏海蓬子葉片總RNA經反轉錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉錄得到的cDNA為模板， 根據SbDREB全長cDNA序列設計一對引物如下(引物由上海生物工程公司合成)
SbDREB-F: SEQ ID N29 5' - CTCCTGGGCGGGGCCACCGCCCTC -3 ，, SbDREB-R: SEQ ID N2 10 5， - GACACAATATATAGTAATATTAAC -3 ， 通過 SEQ ID N2 9 和 SEQ ID N2 10 來克隆 SbDREB 的 cDNA 全長。25 μ 1 PCR 反應體系含 2. 5μ 1含MgCl2W 10XPCR緩衝液、取 10μ M 的引物 SEQ ID N2 9 和 SEQ ID 10 各 1. 0 μ 1、1. 0 μ 1 IOmM 的 dNTP (脫氧核苷酸混合物)、1. 0 μ 1 cDNA 模板和18. 5μ 1雙蒸水，以及0. 25 μ ILA-Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。PCR反應條件為95°C預變性 3 min後，94°C1 min, 58°C 45s, 72°C 1 min 20s，共；35 個循環；然後 72°C 延伸10 min。將擴增得到的約1200bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用pGEM - T vector系統(Promega公司，美國) 按試劑盒說明克隆該片段，測序(上海生物工程公司)。測序結果表明該序列就是目的序列， 將該基因命名為 fe/icoraia bigelovii Torr. DRE biding protein (簡稱5)，其編碼蛋白命名為SdDREB。
實施例2 ,SbDREB的序列信息分析與SbDREB的同源性進化分析
本發明的SbDREB基因全長cDNA為1206bp，包括起始密碼子和多聚A尾。開放閱讀框部分為85^p，位於192-1043bp處。DNASTAR軟體分析表明5 / 共編碼284個胺基酸，該蛋白分子量(MW)為31. 9Kda，理論等電點(pi)為7. 71。將此蛋白胺基酸殘基序列在國際基因庫(GenBank)中進行搜索，發現SbDREB所編碼的蛋白含有一個在DREB亞族轉錄因子中很保守的AP2/EREBP結構域，即自氨基端(N端)第100位至第158位胺基酸殘基(SEQ ID N2: 2中自5』端第489 - 665位鹼基為其編碼序列)，共59個胺基酸，其中第十四位是胺基酸是纈氨酸(V)，與已報導的DREB類轉錄因子是一致的。序列的同源性比對分析可以為基因功能的研究提供一些有用信息。為明確SbDREB與已報導的DREB類轉錄因子的同源關係和其在整個AP2/EREBP家族中的分類地位，現將SbDREB AP2/EREBP DNA結合域的胺基酸序列與該家族中的其他成員進行進化樹比對分析，具體方法為將SbDREB與在GenBank中登陸並且有文獻報導的來自其他植物的DREB類轉錄因子的DNA結合域的胺基酸序列用DNAMAN軟體進行序列比對分析，發現SbDREB的AP2結構域與蘋果MdAP2轉錄因子(GenBank登錄號 ADE41121)，檸條CkDREB2轉錄因子(GenBank登錄號ADD69957)，棉花GhDREB2轉錄因子 (GenBank 登錄號AAT39542)，大豆 GmDREB2 轉錄因子(GenBank 登錄號AAQ572^)，玉米轉錄因子 ZmDBFl (GenBank 登錄號AAM80486. 1),ZmDREBl (GenBank 登錄號ACG;35323)和 ZmDREB2 (GenBank登錄號AC07^93))的AP2區域具有高度同源性，同源性分別為96 %、 93 %、94 %、93 %、88 %、88 %、90%，AP2保守區序列胺基酸同源性極高(見附圖1)。這些蛋白的胺基酸殘基序列都含有一個保守的AP2/EREBP結構域，而且在這個結構域中的第14 位和19位的胺基酸分別為纈氨酸和亮氨酸。研究表明這兩個位置的胺基酸對於DREB亞族和ERF亞族成員與DNA結合的特異性起到關鍵性的作用。在擬南芥中，第14位的纈氨酸在所有的DREB亞族成員都是保守的，而在19位的胺基酸的可變性要大一些，主要是穀氨酸， 此外，還發現有亮氨酸和纈氨酸等。同胺基酸的保守性相一致，^kuma等通過定點突變的方法進行研究發現第19位的胺基酸單點突變幾乎不影響DREB轉錄因子與DRE元件的親和力，而14位纈氨酸的單點突變則顯著降低了該親和力，表明14位的纈氨酸決定了 DREB亞族轉錄因子與 DRE 元件結合的特異性(Sakuma Y, Liu Q，Dubouzet J G, et al. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration and cold一inducible gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290: 998-1009)。BDREB類轉錄因子是植物中可與DRE元件結合進而調控植物抗逆脅迫反應的轉錄因子。DREB類轉錄因子屬於AP2/ERF轉錄因子家族中一個亞族(DREB亞族)，Sakuma (2002)進一步將該亞族分為6個組(Al至A6)。目前對DREB亞族成員的研究主要集中在A-I和A-2組，而對其他組成員則研究的較少。但根據擬南芥中數據，其他組成員在整個DREB亞族中佔據著75%的數量。用DNAstar軟體繪製SbDREB與代表每個亞族的DREB蛋白的系統進化樹，結果顯示SbDREB屬於DREB亞族的A-6亞組，已報導的DREB家族A-6組的其他成員還有玉米ZfflZ^SSl基因、棉花GhDBPl基因、大豆GmDREBl 基因、蘆薈J7MSS2基因及檸條α/^廠基因，根據已報導的DREB家族A-6組其他成員的功能推測SbDREB可能受高鹽、乾旱等環境脅迫誘導(見附圖2)。實施例3 逆境脅迫對SbDREB基因表達的影響
為了研究SbDREB對外界環境脅迫的響應，用實時定量PCR的方法檢測SbDREB基因在
7各種環境脅迫處理條件下的表達模式，並採取以下措施保證檢測結果的可靠性a、用擴增級別DNase I消化提取的總RNA中可能存在的少量的基因組DNA的汙染，為檢測基因組DNA 是否消除乾淨，可取出一部分用DNase I消化的總RNA樣品進行常規PCR反應，當發現沒用擴增條帶產生時，再進行反轉錄步驟；b、由於5 基因沒有內含子，且在畢氏海蓬子中可能有其同家族成員，所以擴增產物儘量不放在其cDNA的編碼區，特別是編碼很保守的 AP2/ERF結構域的區域，為了進一步驗證實時定量PCR擴增的條帶是否就是5,將PCR 產物切膠回收進行測序。依據所獲得的5 基因5』非翻譯區序列設計一對實時定量 PCR的引物(引物由上海生物工程公司合成) Sb-QF (上遊引物)=SEQ ID N2 11 5』 -TGCACAAAACCTTCCAAATTCTTC-3『； Sb-QR (下遊引物)=SEQ ID N2 12
5，-TTCCCCCAATGTCTCTGCCTTACT-3，。PCR 產物長度為 144bp。以畢氏海蓬子的actin (激動蛋白)cDNA為內參，實時定量PCR引物為(引物由上海生物工程公司合成)
Actin-F (上遊引物)SEQ ID N2 13 5』 -TTTGAGCAGGAATCAGAAACCGCC-3，； Actin-R (下遊引物)SEQ ID N2 14 5，-AGGACCTCTGGGCAACGGAATCTC-3，。PCR 產物長度為 116bp。具體方法為取3個月大的畢氏海蓬子幼苗分別進行下述脅迫出來NaCl(將幼苗從土中取出後在1/2MS溶液中預培養7天後放入含250mMNaCl的2/1MS溶液中進行處理)、 乾旱(將幼苗從土中取出後在2/1MS溶液中預培養7天後放入含20% PEG6000的1/2MS溶液中進行處理)、低溫(4°C)和ABA (將幼苗從土中取出後在1/2MS溶液中預培養7天後放入含ΙΟΟμπι/L ABA的1/2MS溶液中進行處理)，以未做任何處理的畢氏海蓬子幼苗為對照， 然後用與上述相同的方法檢測5 的表達情況，同樣以畢氏海蓬子的actin (激動蛋白) cDNA為內參。實驗步驟具體如下採用SV Total RNA lysis試劑盒(Promega公司，美國) 提取經脅迫處理與對照的畢氏海蓬子肉質莖總RNA，先取IygS RNA加入擴增級別DNase I (Sigma, USA)室溫放置30分鐘來去除基因組DNA的汙染，然後加入停止緩衝液(50mM EDTA)，70°C加熱10分鐘變性DNase I和RNA ；然後採用寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄試劑盒按照試劑盒說明書進行反轉錄，每個樣品取2 μ g總RNA，在42°C下反應1小時，在 70°C加熱10分鐘後取出，置於冰上，以使反轉錄酶使活；最後取1 μ 1翻轉錄產物進行實時定量PCR擴增。使用TaKaRa公司的STOR Premix Ex Taq 試劑盒，按照操作說明，在螢光定量PCR儀Light Cycler 2.0 (Roche公司)上進行螢光定量PCR。採用Light Cycler 2. 0中的2 — ΔΔw方法進行基因相對表達量分析，檢測肉質莖中5 基因的表達，以對照肉質莖中基因的表達作為標準，數值設為1，其餘樣本為相對於標準1的相對表達值，每個樣品設置3次重複，做兩種PCR反應，20 μ L反應體系。具體為(1)目的基因的PCR反應體系包括Ιμ cDNA，2XPCR mix 緩衝液 10yl，SEQ ID 11 與SEQ ID Nq :12 弓丨物(5μΜ/ 口1)分別1「1，7「1 H2O補足；(2)內參基因的PCR反應體系包括1 μ 1 cDNA，2XPCR mix 緩衝液 10yl，SEQ ID NQ:13 與 SEQ ID N2 14 引物(5 μ M/μ 1)分另Ij 1μ1，7μ1 H2O 補足。 PCR反應程序均為95 °C預變性30 s; 95 0C 5 s, 57 V IOs, 72 V 20 s, 40個循環後，做溶解曲線分析。檢測結果表明，5 ^基因能夠被乾旱、高鹽誘導表達。5基因在乾旱、高鹽脅迫下均隨著脅迫時間的延長表達量逐漸升高，在脅迫處理8小時時表達量達到最高，然後逐漸降低。5 基因在高鹽處理下表達豐度迅速提高，比乾旱處理下的表達提早達到高峰。SbDREB基因在高鹽處理下8小時的表達豐度約是對照的25倍，而在乾旱下8小時的表達豐度則為對照的9. 5倍。與A-6亞組的ZmDBFl基因一樣，ABA能夠誘導SbDREB基因的表達，ABA處理0.5至2小時，5基因的表達量略有升高，而在處理4小時後，其表達豐度迅速升高，表達量為對照的16倍，然後逐漸降低。4°C低溫處理0.5小時，SbDREB 基因表達量基本不變，然而低溫處理2小時，5基因的表達量迅速減少，隨著脅迫時間的進一步延長表達量基本保持不變，在低溫處理M小時時，表達量僅為對照的12% (附圖 3 )。這些結果表明該基因受高鹽、乾旱和A BA的誘導，而不受低溫誘導。實施例4 ,SbDREB基因植物表達載體的構建及轉基因菸草的抗逆性實驗 (1)表達載體的構建
議SbDREB cDNA全長序列為模板，在含有酶切位點的引物(上海生物工程公司合成) Strans-F :SEQ ID N2 15
5，- GCCTCTAGAATGGCTGCTGCAATAGATACATATAG -3，(帶下劃線鹼基為限制內切酶損a I識別位點)
Strans-R :SEQ ID N2 16
5，- GCCCCCGGG TTAAAGAGAATCCCAGTCAATTTC -3，(帶下劃線鹼基為限制內切酶I 識別位點)
在SEQ ID NQ:15和SEQ ID 16的引導下，PCR擴增5，端添加損a I識別位點、3，端添加Sma I識別位點的SbDREB編碼區全長序列。反應結束後，對PCR擴增產物進行1. 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收並純化約850bp的目的片段，將其用Z如I和5 I酶切後，與經相同酶雙酶切的載體mpCAMBIA2301 (圖4)用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應體系含 IXT4DNA 連接酶緩衝液，mpCAMBIA2301 片段 0. 03pmol，5^^￡S 片段 0. 3pmol,350u T4DNA 連接酶)，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞(轉化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，Ρ55-56頁，科學出版社，1992)，轉化後得大腸桿菌DH5 α細胞懸液塗布含80mg/L卡那黴素的平板，對抗卡那黴素的陽性克隆進行擴增並提取質粒，採取酶切和測序的方法驗證連接的正確性得到植物表達載體mpCAMBIA2301: SbDREB,mpCAMBIA2301 SbDREB質粒圖如圖5所示。用凍融轉化法將此載體轉化根癌農桿菌EH105，得到含有mpCAMBIA2301 SbDREB的農桿菌菌株，命名為TmpCAMBIA2301 SbDREB ；將質粒mpCAMBIA2301轉化根癌農桿菌EH105，得到含有mpCAMBIA2301空載體的農桿菌菌株TmpCAMBIA2301。(2)農桿菌介導的菸草轉化與篩選鑑定
從培養平板中挑取單個農桿菌菌落，在含有50mg/L卡那黴素、30mg/L鏈黴素的 2ml YEB培養基中培養過夜；以的量接種於100ml YEB培養基中(50mg/L卡那黴素， 30mg/L鏈黴素)培養過夜，6000rpm離心收集菌體，用侵染培養基重新懸浮，菌液濃度調整至OD6tltl約0.5做為侵染菌液。採用葉圓盤轉化法，用無菌刀片將無菌菸草試管苗葉片切成4 6mm的葉盤，葉盤外植體分別在OD600約0. 5的TmpCAMBIA2301 SbDREB和 TmpCAMBIA2301 (轉空載體對照)農桿菌侵染溶液中感染IOmin，取出後用無菌濾紙吸乾表面液體，放入含有共培養液(MS基本培養基加6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0. 1 mg/ L、蔗糖30g/L，pH 5. 8)的濾紙上黑暗條件下，25 °C共培養2天。經共培養2天的葉盤用含有500mg/L的頭孢黴素水溶液洗滌3次，用無菌濾紙吸乾表面液體轉入篩選分化培養基中，25 °C光照培養。轉化體的篩選在篩選分化培養基(MS基本培養基加6-苄氨基嘌呤 1. Omg/L、萘乙酸0. 1 mg/L、卡那黴素80mg/L、頭孢黴素400mg/L、蔗糖30g/L，pH 5. 8)中進行。待葉片邊緣長出叢生再生芽至2-3cm時，用解剖刀將再生芽切下，並轉入生根培養基 (MS基本培養基加卡那黴素50mg/L、蔗糖20g/L，pH 5. 8)中培養25天。轉化細胞再生的植株具有卡那黴素抗性，為正常綠色植株，共得17株轉基因植株和10株轉空載體植株。用基因組提取試劑盒(Takara)提取TmpCAMBIA2301 SbDREB 和 TmpCAMBIA2301 菸草基因組DNA，以IOOng提取的基因組DNA為模板進行PCR反應。鑑定用PCR為25 μ 1 反應體系，含2. 5μ 1含MgCl2的IOXPCR緩衝液、實例4中的引物SEQ ID NQ:15和SEQ ID N2:16 (濃度10 μ M)各1.0μ1、1.0μ1 IOmMWdNTP (脫氧核苷酸混合物)、1. O μ 1基因組 DNA模板和18. 5 μ 1雙蒸水，以及0. 25 μ 1 rTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。擴增反應條件為94°C預變性5分鐘；95 °C30秒，55 °C 50秒，72 °C 1分10秒，35次循環， 72 °C延伸10分鐘。將擴增產物進行凝膠電泳，結果如圖6所示，在鑑定的15株菸草中，有 14株陽性轉TmpCAMBIA2301 SbDREB菸草擴增產物在預計的850bp處有清晰的條帶，而有1株假陽性轉TmpCAMBIA2301 SbDREB菸草和轉TmpCAMBIA2301菸草(空載體對照)無 PCR產物條帶。為了進一步鑑定轉基因植株，採用SV Total RNA lysis試劑盒(Promega 公司，美國)提取通過基因組檢測為陽性的轉TmpCAMBIA2301 SbDREB及轉TmpCAMBIA2301 菸草(空載體對照)葉片總RNA，用1 μ g葉片總RNA經反轉錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉錄得到的cDNA為模板，PCR引物為SEQ ID 15和SEQ ID N2 16, 25 μ 1 PCR反應體系含2. 5μ 1含MgCl2的10XPCR緩衝液、引物SEQ ID和 SEQ ID N2 16 (濃度 10 μ Μ)各 1. 0 μ 1、1. 0 μ 1 IOmM 的 dNTP (脫氧核苷酸混合物)、1. 0 μ 1 cDNA模板和18. 5 μ 1雙蒸水，以及0. 25 μ 1 rTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。擴增反應條件為94°C預變性5分鐘；95 V 30秒，55 V 50秒，72 °C 1分10秒，35次循環，72 °C延伸10分鐘。將擴增產物進行凝膠電泳，鑑定結果如圖7所示，在鑑定的15株轉 TmpCAMBIA2301 SbDREB菸草陽性植株中，有13株的RT-PCR擴增產物在850bp處有清晰的條帶，說明該基因在菸草中已進行了轉錄表達，而有2株轉TmpCAMBIA2301: SbDREB菸草及轉TmpCAMBIA2301菸草(空載體對照)的RT-PCR無PCR產物條帶，說明該基因在菸草中沒有進行轉錄表達。(3)基因功能分析
將大小生長一致的轉DREB基因陽性菸草苗與轉入mpCAMBIA2301空質粒的對照菸草苗帶根取出，在MS液體培養基中恢復培養3天後，將其轉移至含有300mM NaCl的MS培養基中，在的光照培養箱中培養，處理4天後，可以觀察到對照菸草植株葉片萎蔫較轉基因菸草嚴重，轉基因菸草葉片仍然保持一定的膨壓，而對照菸草葉片的心葉就已經開始萎蔫， 葉緣捲曲、葉片下垂等現象(見圖8)。由此可見，5 在菸草中的過量表達能夠提高菸草轉基因植株對鹽脅迫的抗性。以上各實施例不是對本發明的具體限制，本領域的普通技術人員結合本領域的慣用技術手段，藉助本發明公開的胺基酸殘基序列蛋白質及其編碼基因對單子葉植物或雙子葉植物進行植物抗逆性調控，均落入本發明的保護範圍。
權利要求
1.植物的一個DREB轉錄因子，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質a)序列表中的SEQID Ne=I ；b)將序列表中SEQID N2=I的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有轉錄激活功能的調控植物抗逆性的胺基酸殘基序列。
2.根據權利要求1所述的植物的一個DREB轉錄因子，其特徵在於所述蛋白質具有序列表中SEQ ID Ne=I的胺基酸殘基序列。
3.一種如權利要求1或2所述植物的一個DREB轉錄因子的編碼基因，其特徵在於a)序列表中SEQID N2 2的DNA序列；b)編碼序列表中SEQID N2=I蛋白質序列的多核苷酸序列；c)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權利要求3所述編碼基因的表達載體。
5.含有權利要求3所述編碼基因的細胞系。
6.含有權利要求3所述編碼基因的宿主菌。
7.—種如權利要求1或2所述的畢氏海蓬子的一個DREB轉錄因子的應用，其特徵在於將編碼該DREB轉錄因子的基因導入植物組織或細胞，提高植物的抗逆性。
8.根據權利要求7所述的畢氏海蓬子的一個DREB轉錄因子的應用，其特徵在於所述的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述的抗逆性為耐鹽性。
全文摘要
本發明涉及植物的一個DREB轉錄因子，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質a)序列表中的SEQIDNO1；b)將序列表中SEQIDNO1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉錄激活功能的調控植物抗逆性的胺基酸殘基序列。本發明的蛋白質及其編碼基因能夠增強植物對逆境的耐性，尤其是增強對乾旱脅迫和鹽脅迫的抗性。
文檔編號C07K14/415GK102286088SQ201110259308
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月5日 優先權日2011年9月5日
發明者餘桂紅, 孫曉波, 張旭, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農業科學院