鹿茸鹼性成纖維生長因子(deerfgf)提取及其製備方法
2024-01-28 10:03:15
專利名稱：鹿茸鹼性成纖維生長因子(deer fgf)提取及其製備方法
技術領域：
本發明屬於鹿茸提取物的醫用或食用製品領域。更具體地來說，本發明涉及由鹿茸提取具有鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)活性的提取物的方法以及由該方法製備的富含鹼性成纖維細胞生長因子的鹿茸提取物。另外，本發明還涉及該鹿茸提取物在藥品、食品和化妝品等方面的應用。
背景技術：
鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作為傳統的中藥材，具有強筋健骨、補腎壯陽、疏通血脈等功效，自古以來就被廣泛應用於配製成為各種滋補藥品、食品和化妝品。通過現代藥物化學研究分析，鹿茸中含有許多種生理活性成分，包括磷脂、生物胺類化合物、前列腺素、維生素、胺基酸、無機鹽、不保護脂肪酸、皮質醇等。隨著現代生物技術高速發展，人們發現鹿茸中除了含有上述各種生理活性成分之外，其中還含有胰島素樣生長因子(IGF-1)、胰島素、人生長激素(HGH)、促生長釋放因子(GHRF-6)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)等大分子活性蛋白質。以上各種活性成分，尤其是各種活性蛋白質，相互協同作用，發揮功效。其中，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)具有突出的藥理作用。
鹼性成纖維細胞生長因子是一種分子量約為17kD的蛋白質。最初因其具有很強的促成纖維細胞生長的作用而得名(參見Nature，1974，249123)，但其促進生長的作用廣泛，對幾乎所有來源於中胚層的細胞都有效(參見Nature CancerInstitute Monograph，1978，48109、中國專利CN1055009A等)。因此bFGF能夠刺激和調節血管內皮細胞、上皮細胞、成肌細胞、成骨細胞和神經膠質細胞等多種細胞的分化、增殖，能保護神經元，促進神經突起生長，對周圍神經再生具有一定的效果。
然而，在傳統的鹿茸加工過程中，鹿茸直接粉碎後服用，顆粒較大，造成吸收效率低下；有時，鹿茸的加工需要經過加熱煎煮、烘乾等步驟，高溫會使其中的bFGF等蛋白質變性，從而降低乃至喪失它們的功效。另一種傳統的加工方式是將鹿茸浸泡在高濃度酒精含量的酒中，製成藥酒服用。但是由於酒中含有高濃度的作為有機溶劑的酒精，會使bFGF等蛋白質變性，而且從大顆粒鹿茸中也不利於溶解出bFGF等蛋白質，因而會導致鹿茸中的bFGF利用效率低下，造成資源浪費。另外，高濃度酒精含量的藥酒也限制了每次的服用量。
為了提高鹿茸材料的使用效率，人們嘗試了各種方法提取鹿茸中富含鹼性成纖維細胞生長因子的有效成分。例如，中國專利CN1104095A中公開了一種含有bFGF的鹿茸生長因子製劑，預處理後，需要對鹿茸浸提液進行鹽析、Sephadex C50柱層析和Sepharose親和柱層析，不但製備過程中需要換層析柱，而且沒有提供洗脫峰的圖譜，收集到的所謂活性峰只有標號，需要重新摸索才能重複該方法。
針對現有技術中存在的缺陷，經過長期艱苦的研究摸索，本發明人獲得了一種具有鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)活性的鹿茸提取物的製備方法，該方法通過階段梯度洗脫，預處理後，僅僅需要一步層析就可以獲得高純度的鹼性成纖維細胞生長因子，大大簡化了生產工藝的複雜程度，便於在大規模生產中控制質量，節約成本。此外，在製備工藝中沒有使用任何化學添加劑，產品更易為消費者接受。
發明內容
本發明的發明目的在於提供提取鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的方法以及由該方法製備的富含鹼性成纖維細胞生長因子的鹿茸提取物，並提供了該鹿茸提取物在藥品、食品、保健品和化妝品等方面的應用。
具體而言，在第一個方面，本發明提供了一種提取鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步凝膠過濾層析。在本文中，術語「鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子」指的是來自鹿茸的具有鹼性成纖維細胞生長因子活性的蛋白質。通過本領域普通技術人員熟悉的實驗手段就可以判斷提取自鹿茸的蛋白質是否具有鹼性成纖維細胞生長因子活性，並檢測出該蛋白質的純度，例如分析蛋白質電泳圖譜。優選本發明的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子純度大於90％，更優選大於95％。
在本發明中，術語「一步」指的是在本發明的方法中，僅僅在同一種層析柱(即凝膠過濾層析柱)上進行上樣和洗脫，而不包括進行其他層析的步驟。本發明由於只進行一種層析，因此工藝較之現有技術更簡單，節約了生產成本，適合在大規模生產中推廣。凝膠過濾層析是本領域普通技術人員所熟知的，優選那些已經商品化的。目前已經有成熟的方法來檢測鹼性成纖維細胞生長因子，優選用本發明實施例中的活性檢測方法來確定含鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的峰並收集。在本發明的一個具體實施方式
中，凝膠過濾層析優選為Sephadex G75凝膠柱層析。層析時，本發明優選使用水來進行洗脫，收集含鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的峰，這樣可以不引入額外的化學試劑。本發明人的研究表明，對於使用Sephadex G75凝膠柱，用水就可以將高純度的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子洗脫下來，因此在本發明的第一個方面中，優選將鹿茸浸提液上樣於Sephadex G75凝膠柱，並且用水洗脫，收集含鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的峰。
本文中，鹿茸浸提液指的是用水或緩衝液對鹿茸進行浸漬而得的提取液，其中含有鹿茸中的水溶性成分，包括鹼性成纖維細胞生長因子。本發明優選選用新鮮鹿茸或冷藏的新鮮鹿茸作為原材料，這樣有利於最大限度地保存bFGF的含量和活性。本文中所用的術語「新鮮」指的是採集鹿茸後6小時內就開始進行加工製備本發明的納米化製品或進行冷藏了，優選加工或冷藏不遲於採集後的3小時，更優選不遲於1小時，最優選不遲於20分鐘。本文中所用的術語「冷藏」指的是將鹿茸保存於0℃以下的環境中，優選保存於-20℃的環境中。優選浸提鹿茸前先將鹿茸粉碎(如，切片、研磨、勻漿和/或超生波破碎)，這樣有利於提高浸提出有效成份的效率。通過離心和/或過濾等方式，可以收集鹿茸浸提液，去除不溶物質。
優選本發明第一個方面的方法，其依次包括如下步驟 (1)粉碎鹿茸並浸提出鹿茸浸提液； (2)將鹿茸浸提液上樣於Sephadex G75凝膠柱，再用蒸餾水洗脫，收集含鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的峰。
在第二個方面，本發明提供了一種具有鹼性成纖維細胞生長因子活性的鹿茸提取物的製備方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步凝膠過濾層析。在本發明中，術語「一步」指的是在本發明的方法中，僅僅在同一種層析柱(即凝膠過濾層析柱)上進行上樣和洗脫，而不包括進行其他層析的步驟。本發明由於只進行一種層析，因此工藝較之現有技術更簡單，節約了生產成本，適合在大規模生產中推廣。凝膠過濾層析是本領域普通技術人員所熟知的，優選那些已經商品化的。目前已經有成熟的方法來檢測鹼性成纖維細胞生長因子，優選用本發明實施例中的活性檢測方法來確定具有鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子活性的峰並收集。在本發明的一個具體實施方式
中，凝膠過濾層析優選為Sephadex G75凝膠柱層析。層析時，本發明優選使用水來進行洗脫，收集具有鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子活性的峰，這樣可以不引入額外的化學試劑。本發明人的研究表明，對於使用Sephadex G75凝膠柱，用水就可以將高純度的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子洗脫下來，因此在本發明的第一個方面中，優選將鹿茸浸提液上樣於Sephadex G75凝膠柱，並且用水洗脫，收集具有鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子活性的峰。優選還可以包括進一步濃縮的步驟。
本發明優選本發明第二個方面的方法，其依次包括如下步驟 (1)粉碎鹿茸並浸提出鹿茸浸提液； (2)將鹿茸浸提液上樣於Sephadex G75凝膠柱，再用蒸餾水洗脫，收集具有鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子活性的峰。
在第三個方面，本發明提供了本發明第一個方面的方法提取的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子。該bFGF能夠刺激和調節血管內皮細胞、上皮細胞、成肌細胞、成骨細胞和神經膠質細胞等多種細胞的分化、增殖，能保護神經元，促進神經突起生長，對周圍神經再生具有一定的效果；而且通過分析蛋白質電泳圖譜，其純度大於90％，更優選大於95％。在本發明的具體實施方式
中，該bFGF能顯著促使細胞增殖，生物活性達到1.55×104IU/mL。。
在第四個方面，本發明提供了本發明第二個方面的方法製備的具有鹼性成纖維細胞生長因子活性的鹿茸提取物。在該鹿茸提取物中，鹿茸鹼性成纖維細胞生長的蛋白質純度大於90％，優選大於95％。測定蛋白質純度可利用本領域所常用的手段來進行，例如通過分析蛋白質電泳圖譜。該鹿茸提取物具有鹼性成纖維細胞生長因子活性，能夠刺激和調節血管內皮細胞、上皮細胞、成肌細胞、成骨細胞和神經膠質細胞等多種細胞的分化、增殖，能保護神經元，促進神經突起生長，對周圍神經再生具有一定的效果。在本發明的具體實施方式
中，該鹿茸提取物能能顯著促使細胞增殖，生物活性達到1.55×104IU/mL。。
在第五個方面，本發明提供了含有本發明第四個方面的鹿茸提取物的製劑。鹿茸提取物可以和藥學上可接受的輔劑組合從而加工各種製劑。藥學上可接受的輔劑包括藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等，它們與活性成分相容。運用藥學上可接受的輔劑製備製劑對本領域普通技術人員來說是公知的。本發明的製劑優選為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑等劑型，從而適合各種給藥形式，例如口服、非腸道注射、黏膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等的給藥形式。在本發明的具體實施方式
中，製劑優選為鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子凍幹劑，其由本發明第四個方面的鹿茸提取物冷凍乾燥而得。
在第六個方面，本發明提供了本發明第三個方面的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子、本發明第四個方面的鹿茸提取物或本發明第五個方面的製劑在製備用於刺激細胞分化和/或增殖的藥品、食品和/或化妝品中的應用。由於bFGF能夠刺激和調節血管內皮細胞、上皮細胞、成肌細胞、成骨細胞和神經膠質細胞等多種細胞的分化、增殖，能保護神經元，促進神經突起生長，因此可以治療或預防相應疾病。
對於藥品來說，可以對需要刺激細胞分化和/或增殖的患者進行給藥。給藥的劑量和形式一般由醫師根據患者的具體情況(如年齡、體重、性別、病情、患病時間、身體狀況等)確定。一般而言，bFGF計，給藥的劑量為0.001～100mg/kg患者體重，優選為0.01～1mg/kg，優選為0.02～0.1mg/kg。給藥形式可以根據各種藥物製劑的劑型來確定，適合的給藥形式有口服、非腸道注射、黏膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等給藥形式，優選使用口噴劑或膠囊劑口服給藥。
對於食品和/或化妝品來說，由於是天然製品，而且鹿茸本身有著悠久的使用歷史，健康人服用一定量的本發明的bFGF提取物或製品有助於維持其正常的細胞增殖、分化。本發明的bFGF提取物或製品可以單獨作為食品和/或化妝品使用，也可以添加到其他食品和/或化妝品中使用，例如，可以添加到常規的飲料、食品和/或化妝品中配合應用。
本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。
為了便於理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。
圖1顯示了bFGF凝膠層析圖譜，其中箭頭所指的峰為鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子所在的峰。
圖2顯示了bFGF的等電聚焦電泳圖譜，其中右邊的條帶為鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子，而左邊的條帶為標準pH電泳標記。
具體實施例方式 實施例1，鹿茸的預處理 取新鮮鹿茸0.5kg，用冷凍切片機將鹿茸切成厚度為1～2mm的切片，然後加入適量(200mL)預冷的去離子水在4℃用勻漿機進行粉碎，勻漿操作進行至勻漿中沒有可見的組織塊時結束。然後向勻漿物中加入200mL預冷的去離子水，混勻後在冰浴條件下進行超聲波破碎。對得到的破碎產物以5000轉/分鐘(rpm)離心20分鐘，取上清液。在離心沉澱中加入200mL預冷的去離子水，重懸沉澱後再次以5000rpm離心20分鐘，取上清液。然後，重複上述重懸、離心過程一次，取上清液。合併各次離心分離所得的上清液，即得到經預處理後的鹿茸浸提液680mL。
實施例2，鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的層析純化及凍幹劑的製備 向60mL實施例1中得到的鹿茸浸提液上樣於Sephadex G75凝膠柱(2.6cm×110cm)(購自Amersham公司)，然後用蒸餾水以80ml/h的流速進行洗脫並用紫外檢測儀在280nm波長處進行檢測(洗脫圖譜如圖1所示)。通過如實施例3所述的檢測方法檢測各個洗脫級分經透析得到的產物，發現如圖1中「目的蛋白峰」所指的峰為鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子。因此，收集該目的蛋白峰，由此得到純化的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子溶液55mL。將得到的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子溶液裝入透析袋，用聚乙二醇20000進行濃縮。然後將濃縮液冷凍，然後在-30～-50℃下用冷凍乾燥機進行冷凍乾燥，得到鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子凍幹劑共210mg。
實施例3，鹼性成纖維細胞生長因子的檢測 根據《分子克隆試驗指南》(科學出版社，2002年)和陳瓊玉等的MTT比色法(中國病理生理雜誌，2006，22(2)247-250)檢測鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子。將實施例2得到的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子溶液進行等電聚焦電泳(以7.5％聚丙烯醯胺為支持介質，用pH3.5～10的兩性電介質，150V聚焦4h)，電泳結束後以考馬斯亮蘭染色，電泳凝膠照片如圖2所示，在約pH9.5處有鹼性成纖維細胞生長因子單一條帶，通過面積歸一法進行圖像分析得其純度達到96.8％。用雪旺細胞的增殖來檢測bFGF的生物活性以加入緩衝液的空白組為對照，在加入實施例2得到的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子溶液的實驗組中，細胞顯著增殖，生物活性為1.55×104IU/mL。
權利要求
1.具有鹼性成纖維細胞生長因子活性的鹿茸提取物的製備方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步凝膠過濾層析。
2.提取鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步凝膠過濾層析。
3.根據權利要求2的方法，其中提取的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子純度大於90％，優選大於95％。
4.根據權利要求1-3之任一的方法，其中所述凝膠過濾層析為Sephadex G75凝膠柱層析。
5.根據權利要求4的方法，其中層析包括，將鹿茸浸提液上樣於SephadexG75凝膠柱，並且用水洗脫，收集含鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的峰。
6.根據權利要求1-5之任一的方法，其依次包括如下步驟
(1)粉碎鹿茸並浸提出鹿茸浸提液；
(2)將鹿茸浸提液上樣於Sephadex G75凝膠柱，再用蒸餾水洗脫，收集含鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子的峰。
7.權利要求2-6之任一的方法提取的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子，優選其純度大於90％，更優選大於95％。
8.權利要求1、4-6之任一的方法製備的具有鹼性成纖維細胞生長因子活性的鹿茸提取物。
9.鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子凍幹劑，其由權利要求8所述的鹿茸提取物冷凍乾燥而得。
10.權利要求7所述的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子、權利要求8所述的鹿茸提取物或權利要求9所述的鹿茸鹼性成纖維細胞生長因子凍幹劑在製備用於刺激細胞分化和/或增殖的藥品、食品和/或化妝品中的應用。
全文摘要
本發明涉及由鹿茸提取具有鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)活性的提取物的方法，其包括對鹿茸浸提液進行一步凝膠過濾層析。另外，本發明還涉及由該方法製備的富含鹼性成纖維細胞生長因子的鹿茸提取物以及該鹿茸提取物在藥品、食品和化妝品等方面的應用。
文檔編號A61K35/32GK101214259SQ20071016463
公開日2008年7月9日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者朱成鋼, 王利忠 申請人:王利忠