利用博德特氏菌轉化膽固醇生產低分子量透明質酸的方法
2024-01-25 23:12:15
專利名稱：利用博德特氏菌轉化膽固醇生產低分子量透明質酸的方法
技術領域：
本發明涉及博德特氏菌在生產多糖類物質的應用，尤其涉及利用博德特氏菌轉化膽 固醇生產低分子量透明質酸的方法。
技術背景透明質酸(Hyaluronic acid， HA)是一種由p-D-N-乙醯氨基葡萄糖和(3-D-葡萄糖醛 酸為結構單元，以P-1， 4-糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子粘多糖。HA廣泛地存在於人或 動物的各種組織中，1934年由美國人Meyer和Palmer首先從牛眼玻璃體中分離出HA。HA也可用獸疫鏈球菌通過發酵的方法生產，其分子量分布在5xlS和6xl06道爾 頓之間，主要受HA發酵和提純工藝的影響。透明質酸在許多已開發和正在開發的領域有著廣泛的應用，可以用於化妝品、面部 美容、眼科學、整形外科、風溼病學、傷口復原、腫瘤學等領域。其生理學功能包括為 組織提供機械支持、彈性連接、溶質傳輸和為潤滑之用保存水分。研究表明，HA的分子量對HA的活性有影響，不同分子量的HA甚至表現出截然相 反的活性。低分子量透明質酸(LMW-HA)具有促血管生成、促進創傷癒合、抗腫瘤及免 疫調節等生物活性。此外，低分子量透明質酸還可以添加到功能食品中，具有保健和美 容養顏的功效。目前國內外主要通過對經微生物發酵產生的高分子量透明質酸進行降解獲得低分 子量透明質酸，降解的方法主要有物理降解、化學降解、生物降解三大類。這幾種降解 方法具有歩驟較多，產物分子量不均一及成本較高等缺點。經檢索，目前還未見通過微生物轉化膽固醇直接生產低分子量透明質酸的專利及文獻報導。 發明內容針對現有技術中所述的不足，本發明要解決的問題是提供一種利用博德特氏菌轉化 膽固醇生產低分子量的透明質酸的方法。本發明所述利用博德特氏菌轉化膽固醇生產低分子量透明質酸的方法，其涉及的工藝步驟如下(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(5on/W〃a平)54 CGMCCNo.2229;(2) 斜面培養將上述菌種接種於固體斜面基本無機鹽培養基上，25 37'C條件 下，靜止培養24 72小時；(3) 種子培養取步驟(2)培養後的菌株在無菌條件下用接種環接1 2環於20 100 mL含有質量百分比為0.01% 1.0%膽固醇的基本無機鹽培養基中，25 37'C條件 下，振蕩培養24 72小時，製得種子液；(4) 擴大培養以體積百分比為2% 10%的接種量，將上述種子液接種於50 1000 mL含有質量百分比為0.1% 1.0%的膽固醇的基本無機鹽培養基中，25 37。C條件下， 振蕩培養48 144小時；(5) 收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液以2000 8000 rpm轉速離心10 30分鐘，收集上清液，上清液即含低分子量透明質酸；(6) 低分子量透明質酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至l~10ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質酸的溶液；(7) 乙醇沉澱將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉澱，收集沉澱即得低分子量透明質酸。(8) 乾燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質酸沉澱置於IO(TC烘箱中乾燥，得固體低分子量透明質酸。上述利用博德特氏菌轉化膽固醇生產低分子量透明質酸的方法中，步驟(1)所述的博德特氏菌(SwY/e^/to sp.) ￡4 CGMCC No. 2229已於2007年 10月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市 海澱區中關村北一條13號，郵政編碼100080。上述博德特氏菌(Aw/efe〃" sp.)似CGMCC No. 2229可以在基本無機鹽培養基 上以葡萄糖和膽固醇作為碳源生長。步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養基配方為每1000毫升蒸餾水中添加 KH2P04 0.6g， Na2HP04 1.2g， NaCl O.lg， MgS04-7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO40.02g; 115'C條件下滅菌30分鐘。步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養基配方為基本無機鹽培養基中添加質 量百分比為1.5 2.0%的瓊脂；優選添加質量百分比為1.8%的瓊脂粉。步驟(2)、 G)、 (4)中所述的培養溫度優選30 37'C。步驟(3)所述的菌株振蕩培養時間優選36 72小時。步驟(3)、 (4)中所述的膽固醇的質量百分比優選0.3% 1.0%。步驟(4)所述的菌體振蕩培養時間優選60 120小時。步驟(5)所述的離心轉速優選5000 6000rpm ;離心時間優選20 25分鐘。發明人從2005年即開始了能夠轉化膽固醇等甾體化合物的微生物菌株的篩選，本發 明所述博德特氏菌是發明人篩選獲得的一株能夠轉化膽固醇的博德特氏菌^w^^/to sp.WCGMCCNo.2229菌株，所述菌株己於2007年10月24日保藏於中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心。本發明利用博德特氏菌轉化膽固醇成功實現了低分子量透明質酸的生產，所述利用 博德特氏菌生產低分子量的透明質酸是首次報導。本發明方法生產的低分子量的透明質 酸分子量為150 kD以下，得率達到2g/L以上，己經達到或高於國際領先水平，如果通 過發酵罐發酵生產會進一步提高產量。利用本發明所述的博德特氏菌B0Wwe//a Sp.54 CGMCC No. 2229可以製備低分子量 的透明質酸，並且可以進一步降解生產寡聚透明質酸，可以在醫藥工業中作為促血管生 成劑、促進創傷癒合藥物、抗腫瘤藥物及免疫調節劑等，具有極大的應用前景。本發明的優點在於利用微生物轉化膽固醇，生產膽固醇氧化酶和膽甾酮的同時，直 接產生低分子量的透明質酸，不需經過先生產高分子量的透明質酸，再用酶法、物理法 或化學法進行降解的過程，過程簡單，收率較高，極大地降低了生產成本。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明內容作進一步的說明。實施例l:(1)菌種選擇選用博德特氏菌(萬wrfefe〃"^.)萬￥ CGMCC No.2229;(2) 斜面培養將上述菌種接種於固體斜面基本無機鹽培養基上，27X:條件下， 靜止培養24小時；(3) 種子培養取步驟(2)培養後的菌株在無菌條件下用接種環接2環於50mL 含有質量百分比為0.02%膽固醇的基本無機鹽培養基中，27'C條件下，振蕩培養24小 時，製得種子液；(4) 擴大培養以體積百分比為3%的接種量，將上述種子液接種於500 mL含有 質量百分比為0.2%的膽固醇的基本無機鹽培養基中，27C條件下，振蕩培養48小時；(5) 收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液以3000rpm轉速離心IO分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質酸；(6) 低分子量透明質酸分離將歩驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 5ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質酸的溶液；(7) 乙醇沉澱將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉澱，收集沉澱即得低分子量透明質酸；(8) 乾燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質酸沉澱置於IO(TC烘箱中乾燥， 得固體低分子量透明質酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養基配方為每1000毫升蒸餾水中添 力口 KH2P04 0.6g， Na2HP041.2g， NaCl O.lg， MgS04.7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g;步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養基配方為基本無機鹽 培養基中添加質量百分比為1.8%的瓊脂。實施例2:(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(5oWe&〃fl印.)54 CGMCCNo.2229;(2) 斜面培養將上述菌種接種於固體斜面基本無機鹽培養基上，3(TC條件下， 靜止培養36小時；(3) 種子培養取步驟(2)培養後的菌株在無菌條件下用接種環接2環於60mL 含有質量百分比為0.5%膽固醇的基本無機鹽培養基中，30'C條件下，振蕩培養36小時， 製得種子液；(4) 擴大培養以體積百分比為5%的接種量，將上述種子液接種於600 mL含有 質量百分比為0.5%的膽固醇的基本無機鹽培養基中，30'C條件下，振蕩培養96小時；(5) 收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液以5000rpm轉速離心20分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質酸；(6) 低分子量透明質酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 6ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質酸的溶液；(7) 乙醇沉澱將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉澱，收集沉澱即得低分子量透明質酸；(8) 乾燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質酸沉澱置於IO(TC烘箱中乾燥， 得固體低分子量透明質酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養基配方為每1000毫升蒸餾水中添 力口 KH2P04 0.6g, Na2HP041.2g， NaC10.1g， MgS04-7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g;步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養基配方為基本無機鹽培養基中添加質量百分比為1.8%的瓊脂。 實施例3:(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(SoWe e〃a平)54 CGMCC No.2229;(2) 斜面培養將上述菌種接種於固體斜面基本無機鹽培養基上，32'C條件下， 靜止培養48小時；(3) 種子培養取步驟(2)培養後的菌株在無菌條件下用接種環接2環於80mL 含有質量百分比為0.7%膽固醇的基本無機鹽培養基中，32'C條件下，振蕩培養48小時， 製得種子液；(4) 擴大培養以體積百分比為8%的接種量，將上述種子液接種於800 mL含有 質量百分比為0.9%的膽固醇的基本無機鹽培養基中，32'C條件下，振蕩培養120小時；(5) 收集發酵產物將歩驟(4)所得的發酵液以6000rpm轉速離心25分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質酸；(6) 低分子量透明質酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 8ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質酸的溶液；(7) 乙醇沉澱將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉澱，收集沉澱即得低分子量透明質酸；(8) 乾燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質酸沉澱置於IO(TC烘箱中乾燥， 得固體低分子量透明質酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養基配方為每1000毫升蒸餾水中添 力口 KH2P04 0.6g， Na2HP041.2g， NaC10,lg， MgS04-7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g;步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養基配方為基本無機鹽 培養基中添加質量百分比為1.8%的瓊脂。實施例4:(1) 菌種選擇選用博德特氏菌(5wtfefe〃a^.) 54 CGMCC No.2229;(2) 斜面培養將上述菌種接種於固體斜面基本無機鹽培養基上，37'C條件下， 靜止培養72小時；(3) 種子培養取步驟(2)培養後的菌株在無菌條件下用接種環接2環於100 mL 含有質量百分比為1.0%膽固醇的基本無機鹽培養基中，37。C條件下，振蕩培養72小時， 製得種子液；(4) 擴大培養以體積百分比為10%的接種量，將上述種子液接種於1000 mL含 有質量百分比為1.0%的膽固醇的基本無機鹽培養基中，37'C條件下，振蕩培養144小 時；(5) 收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液以8000卬m轉速離心IO分鐘，收 集上清液，上清液即含低分子量透明質酸；(6) 低分子量透明質酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至 10ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質酸的溶液；(7) 乙醇沉澱將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質酸的溶液用3倍體積的無 水乙醇沉澱，收集沉澱即得低分子量透明質酸；(8)乾燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質酸沉澱置於IO(TC烘箱中乾燥， 得固體低分子量透明質酸。上述步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培養基配方為每1000ml蒸餾水中添加 KH2PO40.6g， Na2HP04 1.2g， NaC10.1g， MgS04'7H20 2.7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO4 0.02g; 115°C滅菌30分鐘。步驟(2)中所述固體斜面基本無機鹽培養基配方為 基本無機鹽培養基中添加質量百分比為1.8%的瓊脂；115°C滅菌30分鐘。
權利要求
1. 利用博德特氏菌轉化膽固醇生產低分子量透明質酸的方法，其特徵在於，所述方法涉及的工藝步驟如下(1)菌種選擇選用博德特氏菌(Bordetella sp.)B4 CGMCC No.2229；(2)斜面培養將上述菌種接種於固體斜面基本無機鹽培養基上，25～37℃條件下，靜止培養24～72小時；(3)種子培養取步驟(2)培養後的菌株在無菌條件下用接種環接1～2環於20～100mL含有質量百分比為0.01％～1.0％膽固醇的基本無機鹽培養基中，25～37℃條件下，振蕩培養24～72小時，製得種子液；(4)擴大培養以體積百分比為2％～10％的接種量，將上述種子液接種於50～1000mL含有質量百分比為0.1％～1.0％的膽固醇的基本無機鹽培養基中，25～37℃條件下，振蕩培養48～144小時；(5)收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液以2000～8000rpm轉速離心10～30分鐘，收集上清液，上清液即含低分子量透明質酸；(6)低分子量透明質酸分離將步驟(5)中獲得的上清液利用超濾的方法濃縮至1～10ml，通過離子交換層析獲得含低分子量透明質酸的溶液；(7)乙醇沉澱將步驟(6)中獲得的含低分子量透明質酸的溶液用3倍體積的無水乙醇沉澱，收集沉澱即得低分子量透明質酸；(8)乾燥將步驟(7)中獲得的低分子量透明質酸沉澱置於100℃烘箱中乾燥，得固體低分子量透明質酸。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)、 (4)中所述的基本無機鹽培 養基配方為每1000毫升蒸餾水中添加KH2P04 0.6g， Na2HP04 1.2g， NaCl O.lg， MgS04'7H20 2.7g， CaCl20.1g, (NH4)2S04 0.2g, FeS04 0.02g;步驟(2)中所述固體斜 面基本無機鹽培養基配方為基本無機鹽培養基中添加質量百分比為1.5 2.0%的瓊脂。
3. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，步驟(2)、 (3)、 (4)中所述的培養溫度 是30 37。C。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的菌株振蕩培養時間是36 72小時。
5. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)、 (4)中所述的膽固醇的質量 百分比為0.3% 1.0%。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(4)所述的菌體振蕩培養時間是60 120小時。
7. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(5)所述的離心轉速是5000 6000 rpm ;離心時間是20 25分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種利用博德特氏菌轉化膽固醇生產低分子量透明質酸的方法，其涉及的步驟為(1)菌種選擇；(2)斜面培養；(3)種子培養；(4)擴大培養；(5)收集發酵產物；(6)低分子量透明質酸分離；(7)乙醇沉澱；(8)產物乾燥。本發明利用微生物轉化膽固醇生成重要的甾體類藥物的過程中，同時獲得高附加值的低分子量透明質酸，工藝步驟簡單，成本低，產率較高，具有重要的理論意義和極好的市場前景，能產生巨大的經濟效益。
文檔編號C12R1/01GK101250569SQ20081001548
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月2日 優先權日2008年4月2日
發明者欣 宋, 曲音波, 林建強, 林彥良 申請人:山東大學