黃烷酮3』,5』-羥化酶基因及其所編碼的蛋白質的製作方法
2024-02-26 22:55:15
專利名稱：黃烷酮3』,5』-羥化酶基因及其所編碼的蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明公開了一個來自川烏頭(Aconi turn carmichaeli Debx)的黃烷酮 3』，5』 -羥化酶基因(Ac-F3』 5』 H)及其所編碼的蛋白質，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
花色是觀賞植物最重要的觀賞性狀和經濟性狀之一。藍色給人高雅和夢幻般的感覺，但目前世界四大鮮切花都缺少藍色系列，因此培育藍色花卉已成為近十多年來花卉育種中花色研究和改良的熱點之一。目前，儘管常規育種方法能培育出許多新的花色品種，但很難打破屬、種間的生殖隔離，在資源尤其是野生花卉資源的利用上存在較大的局限性，使某些重要的育種目標如藍色花色等難以實現。世界四大切花都缺乏藍色品種，這是因為它們都缺乏能合成藍色色素——翠雀花色素的關鍵基因，即黃烷酮3』，5』 -羥化酶基因 (flavanone3』，5』 -hydroxylase,簡稱F3』 5』 H)，而基因工程或分子育種正好可以彌補常規育種的技術缺陷，是改變花色的必要手段。F3』 5』 H屬於細胞色素P450酶家族 (cytochrome P450, CYP450)，是藍色色素苷合成過程中的關鍵酶，它能與黃烷酮3』 -羥化酶(flavanone3，-hydroxylase,簡稱 F3，H)和黃酮醇合酶(flavonol synthase, 簡稱FLS)競爭底物，催化黃烷酮(flavanone)、聖草酚(eriodictyol)、二氫山奈酚 (dihydrokaempferol, DHK)等形成二氫楊梅黃酮(dihydromyricetin，DHM),即藍色色素形成的前體，因此，F3』 5』 H也被稱為「藍色基因」(Holton et al Cloning and expression of cytochrome P450 genes controlling flower colour NATURE Nature. Vol. 366, Nol8. pp. 276-279，1993)。很多觀賞植物如月季、菊花、百合等之所以缺少藍色系，主要是因為不含或僅含少量的F3』 5』 H。近年來已先後在多種植物中分離出F3』 5』 H基因，並對其表達模式和功能進行了初步研究，其中已經有的已被用於藍色花色花卉品種的選育工作 (Mori et al Heterologous expression of the flavonoid-S' , 5' -hydroxylase gene of Vinca major alters flower color in transgenic Petunia hybrida PLANT CELL REPORTS Vol. 22， No. 6， pp. 415—421，2004 ；Katsumoto Y et al Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully Generated Blue-Hued Flowers Accumulating Delphinidin PLANT AND CELL PHYSIOLOPY Vol. 48，Issue of November 11，pp. 1589-1600,2010)。但是在烏頭中還沒有發現此類基因的報導。川烏頭是我國特有的野生藍色花色植物，其花色亮蘭，異常美麗。所以我們從川烏頭中克隆出的黃烷酮3』，5』 -羥化酶基因可以導入其它花卉如四大切花中，有望通過基因工程手段培育出市場流行的藍色花色的花卉品種，提高花卉觀賞性。
發明內容
本發明的目的在於提供一個來自川烏頭(Aconitum carmichaeli Debx)的黃烷酮 3』，5』 -羥化酶基因(H1T W)及其所編碼的蛋白質，以便作為目的基因導入其它花卉如月季、康乃馨、香石竹、非洲菊、百合等品種中，從而育成藍色花卉品種，提高花卉觀賞性。本發明提供的黃烷酮3』，5』-羥化酶基因(Ac_F3』5』H)及其所編碼的蛋白質，來自川烏頭(Aconi turn carmichaeli Debx )，命名為Ac_F3 』 5 』 H基因，該黃烷酮3 』，5 』 -羥化酶基因Ac-F3，5，H的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。該黃烷酮3，，5，-羥化酶基因Ac_F3，5，H 編碼的蛋白質，命名為Ac-F3，5，H蛋白質，其胺基酸序列為SEQ ID NO. 2。本發明的優點及效果是由於本發明提供了一個黃烷酮3』，5』 -羥化酶基因 Ac-F3，5，H及其所編碼的蛋白質，且該基因來自川烏頭carmichaeli Debx), 為川烏頭中首次報導，該基因的表達可以促使植物合成翠雀花色素而使植物花色表現為藍色。該基因可作為目的基因導入其它缺少藍色花色系的花卉，如月季、康乃馨、香石竹、非洲菊、百合等品種，從而有望培育出藍色花色的花卉品種，以提高花卉觀賞性。
圖1為用W-FH-F和W-FH-R引物在川烏頭中擴增F3』5』H基因的結果，887bp條帶為目的條帶；
圖2為川烏頭F3』 5』 H基因RACE結果圖2中的A圖為3』 -RACE結果，圖2中的B圖為5』 -RACE結果，圖中的M為Marker，1為雙引物擴增結果，2和3為單引物擴增結果，4為陰性對照；
圖3為用Wl-FH-F和Wl-FH-R引物在川烏頭花瓣中克隆Ac_F3，5，H基因全長cDNA克隆結果M為Marker，1為Ac_F3』 5』 H基因全長cDNA擴增結果，2為陰性對照； 圖4為Ac-F3』 5』 H在川烏頭花朵不同發育時期表達結果； 圖5為Ac-F3』 5』 H在川烏頭植株不同組織部位表達結果。
具體實施例方式1、利用兼併引物在川烏頭花朵中進行候選基因片段的克隆
在川烏頭(公知公用材料，瞿素萍等的「組織培養法快速繁殖川烏頭種苗」中國野生植物資源 CHINESE WILD PLANT RESOURCES 2004，23 (4) 62-63)花期，取其不同發育時期的花朵並迅速置液氮中冷凍後，用TRIZOL (invitogen)按試劑說明書分別提取總RNA，分別取川烏頭花朵不同發育時期的總RNA，利用AMV反轉錄酶(TaKaRa)按試劑說明書反轉錄為 cDNA，再以cDNA稀釋10倍為模板，以兼併引物進行PCR反應，兼併引物名稱和序列分別如下
W-FH-F 5，-C (A/T/C/G)CA(A/G)GA(T/C)ATGGT(T/C/G)TT(C/T)G-3， W-FH-R 5，-C (A/T/G)AT(A/T/C/G)GCCCA(A/T/G)AT(A/G)TT (A/T/C/G)A-3』
ΙΟμΜ 的 5，引物和 3，引物各 0. 5μ1 ；2. 5μ1 IOXbuffer ；2. 5μ1 2. 5mM 的 dNTP ；1. 5μ1 25mM 的 mg2+ ；0. 25μ1 (5U/^l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25μ1，反應條件為94°C預變性 3min;94°C 30s, 52°C 45 s，72°C lmin，33 個循環；72°C延伸 IOmin ;PCR 產物經 1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果從川烏頭花朵第4時期(川烏頭花朵不同發育時期如圖4所示) 可以擴增出明亮的條帶(如圖1所示)；擴增條帶經切膠回收，再與18-T載體(TaKaRa)連接，並轉化到感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)中，篩選陽性單克隆進行測序，測序由上海傑李生物技術有限公司完成；測序結果經BLAST比較分析發現這是一個黃烷酮3』，5』 -羥化酶基因cDNA片段，長度為887bp ；根據此序列分別設計3』 RACE和 5』 RACE引物，其中3』 RACE引物名稱和序列分別如下 3' innner: 5' -ATCAGGTCATTGGCAGGAAC-3『； 3' out: 5' -AAGGAACATATGGCGACGAG-3『； 5』 RACE引物名稱和序列分別如下 5』 innner: 5』 -CCCAGTCTTCAATGGCCTTA-3』 5' out: 5' -AACTCGTTCGACTCCACACC-3『；
分別利用 3，RACE 試劑盒 3，-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa)和 5，RACE 試劑盒5』 -Full RACE Kit (TaKaRa)，並根據試劑盒說明書分別進行候選基因3』端和5』端序列的擴增，PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖2所示)，將目標條帶切膠回收並與18-T載體(TaKaRa)連接，並轉化到rra/^l-Tl感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)中，陽性單克隆進行測序，測序由上海傑李生物技術有限公司完成。對測序結果經 BLAST比較分析，並與長度為887bp的候選基因中間片段序列進行電子拼接，得到一個長度為1720bp的全長cDNA序列，包含一個編碼506個胺基酸的完整的ORF框，該基因推測為黃烷酮3』，5』 -羥化酶基因。又根據電子拼接後得到全長cDNA序列設計包含506個胺基酸完整的ORF框在內的特異引物，引物名稱和序列分別如下 Wl-FH-F 5'-GCACCACCAATCACCATG-3' Wl-FH-R 5'-TTCCACAACAATTCTCCC-3'
以川烏頭花朵發育第4時期的c DNA為模板進行RCR反應10μΜ的5』引物和3』引物各 0. 5μ1 ；2. 5μ1 IOXbuffer ；2. 5μ1 2. 5mM 的 dNTP ； 1. 5μ1 25mM 的 mg2+;0. 25μ1 (5U/^l)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至 25μ1。反應條件為:94°C預變性 3min ;94°C 30 s,52°C 30 s, 72°C lmin，33個循環；72°C延伸lOmin。PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶經切膠回收，再與18-T載體(TaKaRa)連接，並轉化到rra/^l-Tl感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)中，篩選到的陽性單克隆進行測序，測序由上海傑李生物技術有限公司完成。該片段長1560pb，包含與電子拼接序列完全一致的ORF框(0RF框長度，胺基酸和鹼基序列都完全一致)(如圖3所示)。以上試驗結果證明，得到一個長度為1720bp的全長cDNA 序列，包含一個編碼506個胺基酸的完整的ORF框，該基因推測為黃烷酮3』，5』 -羥化酶基因，將其命名為Ac-F3，5，H。 2、驗證候選基因在川烏頭花朵不同發育時間及植株不同部位的表達分析
根據所獲得的川烏頭Ac-F3』5』H全長cDNA序列設計基因特異引物進行該基因表達譜分析，基因特異引物名稱和序列分別如下 W2-FH-F: 5' -TGAGTATGCTTCGGTTCT-3『； W2-FH-R 5' -ATGCTGGTGTTTGCTATG-3，；
以烏頭中的18s RNA基因(FJ748878)內參基因，內參基因引物名稱和序列分別如下 A-18SR-F:5' -TGAGAAACGGCTACCACA-3'，A-18SR-R:5' -ACGCAATAGGACCGAAAT-3』， 分別以川烏頭花期5個不同發育時期花朵及川烏頭的根、莖、葉及花等四個不同植物部位組織為材料進行Ac-F3』 5』 H基因的表達分析
取川烏頭5個不同發育時期的花朵及川烏頭的根、莖、葉及花等四個不同部位組織，用TRIZOU invitogen)按試劑說明書分別提取總RNA，各取一定量的總RNA利用AMV反轉錄酶 (TaKaRa)按試劑說明書分別反轉錄為cDNA，將cDNA稀釋10倍做為PCR反應模板。先用內參引物來調整川烏頭5個不同發育時期花朵及川烏頭根、莖、葉及花等四個不同部位組織PCR 產物電泳結果至亮度一致，PCR體系及反應程序10μΜ的5』引物和3』引物各0. 5μ1 ；2. 5μ1 IOXbuffer ；2. 5μ1 2. 5mM 的 dNTP ； 1· 5μ1 25mM 的 mg2+;0· 25μ1 (5U/^l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25μ1。反應條件為94°C預變性 3min ;94°C 30 s,55°C 45 s，72°C lmin, 觀個循環；72°C延伸lOmin。取用內參引物調整至PCR反應產物條帶亮度一致後的cDNA為模板用基因特異引物進行該基因的表達分析，PCR反應體系及反應程序為10μΜ的5』引物和 3，引物各 0. 5μ1 ；2. 5μ1 IOXbuffer ；2. 5μ1 2. 5mM 的 dNTP ；1. 5μ1 25mM 的 mg2+ ；0. 25μ1 (5U/^l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25μ1。反應條件為94°C預變性 3min ;94°C 30 s,53°C 45 s，72°C lmin，沘個循環；72°C延伸lOmin。PCR結果電泳檢測(如圖4、5所示)。
序列表
雲南省農業科學院花卉研究所
一個川烏頭黃烷酮3』，5』 -羥化酶基因及其所編碼的蛋白質
說明書
00
2011-07-12
14
PatentIn version 3.1 1 1720 DNA
川烏頭(Aconitum carmichaeli Debx)
Ac-F3』 5』 H基因cDNA全長序列 (1).. (1720) 1
gaaaatgcaccaccaatcaccatgttgtctaccagagaacttgtcgctgcagcgatcatt60tttttcattgcccgtctcttCgtgCgtttCttgtgctcatcgaaacaagcacgcaagctt120cctcccggtccgaaaggatggccagtggtgggcgcattacCCCtgCtgggatccatgcct180catgttgccctggccaagatgtccaggcaatacggccccattgtgtacctcaaattaggt240tcgtgtggtatggttgtcgcttcaacccccgattcggctcgtacgtttttgaaaacccta300gacctaaacttctccaatcgcccgaccgatgcaggtgcaactcatatcgcgtataactca360caggacatggtgtttgcggactatgggccgaggtggaagttgttgcgtaaactgactagc420ttgcatatgttaggcagtaaggccattgaagactgggctagagtcaggcgggatgaggtg480gggtacatggttaaagccatgtacgagtctagctgcgtgggggaggtggttgttgtgccg540gatatgctggtgtttgctatggcgaatatgcttgggcaggtaatactgagCCgCCgtgtg600tttgttacgaaaggtgtggagtcgaatgagtttaaggagatggtgatcgacctaatgaca660tcagcggggttgtttaatgttggtgattatattccttcgattgcatggatggatctgcag720ggtattgtgcggggaatgaaacgtttgcacaggaagttcgatgcgcttttggacaaaaag780ttgaaggaacatatggcgacgagggatgagaggaaggagaagccggacttactcgatgtt840ctgatggataacagggacaataagtctgagcaggagaggcttactgacaccaacatcaag900gctcttctcttgaacttattctcagctggaacagacacatcctcgagcacaatcgaatgg960gcactgacagagatgataaagaaccgaagcatactcaagcgcgcacacgccgaaatggat1020caggtcattggcaggaaccgcaggcttgaagagtctgacataccgaaactcccctactta1080caagcaatatgcaaagaaacattcaggaaacacccctcaacgccgcttaaccttccaaga1140gtggcgatcgaaccgtgcgaaatagacggatactacatccccaagggcacaagactcagt1200gtgaacatatgggcgatcgggcgagacccagacgtgtgggagaatccgctcgagttcaac1260cccgacagattcttaatagggaaaatggcaaaaatcgatccacggggaaataacttcgag1320ctgataccatttggggcagggaggaggatatgtgcagggactaggatgggaattgttctt1380gttgagtacatattggggacgcttgtgcatgcatttgaatggaagatgcctgatggagag1440acgctaaacatggacgaagcgtttggtttagctctacagaagggtgtgccgcttgctgct1500gttgttacccctcgcctgccaccctctgcttatgtagtctgaagagttgggagaattgtt1560gtggaacatataatagtaatgttgaagtactcttaccaga￡1 ￡1 ￡1C ￡1 ￡1C ￡1 gtatagactt1620cgctgtatgcacattgtgtctccgtgtgcatggtttgtggtgttaaaacttgaaagttac1680tggaaataaagcttgtgtcatgtttgataa1720
2 506 PRT
川烏頭(Aconitum carmichaeli Debx)
ORF框胺基酸序列 (1)..(506) 2
Met Leu Ser Thr Arg Glu Leu Val Ala Ala Ala lie lie Phe Phe Ile 151015
Ala Arg Leu Phe Val Arg Phe Leu Cys Ser Ser Lys Gln Ala Arg Lys
202530
Leu Pro Pro Gly Pro Lys Gly Trp Pro Val Val Gly Ala Leu Pro Leu
354045
Leu Gly Ser Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys Met Ser Arg Gln Tyr
505560
Gly Pro lie Val Tyr Leu Lys Leu Gly Ser Cys Gly Met Val Val Ala 65707580
Ser Thr Pro Asp Ser Ala Arg Thr Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn 859095Phe Ser Asn Arg Pro Thr Asp Ala Gly Ala Thr His lie Ala Tyr Asn
100105110
Ser Gln Asp Met Val Phe Ala Asp Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Leu Leu
115120125
Arg Lys Leu Thr Ser Leu His Met Leu Gly Ser Lys Ala lie Glu Asp
130135140
Trp Ala Arg Val Arg Arg Asp Glu Val Gly Tyr Met Val Lys Ala Met 145150155160
Tyr Glu Ser Ser Cys Val Gly Glu Val Val Val Val Pro Asp Met Leu
165170175
Val Phe Ala Met Ala Asn Met Leu Gly Gln Val lie Leu Ser Arg Arg
180185190
Val Phe Val Thr Lys Gly Val Glu Ser Asn Glu Phe Lys Glu Met Val
195200205
lie Asp Leu Met Thr Ser Ala Gly Leu Phe Asn Val Gly Asp Tyr lie
210215220
Pro Ser lie Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly lie Val Arg Gly Met Lys 225230235240
Arg Leu His Arg Lys Phe Asp Ala Leu Leu Asp Lys Lys Leu Lys Glu
245250255
His Met Ala Thr Arg Asp Glu Arg Lys Glu Lys Pro Asp Leu Leu Asp
260265270
Val Leu Met Asp Asn Arg Asp Asn Lys Ser Glu Gln Glu Arg Leu Thr
275280285
Asp Thr Asn lie Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Ser Ala Gly Thr
290295300
Asp Thr Ser Ser Ser Thr lie Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met lie Lys 305310315320
Asn Arg Ser lie Leu Lys Arg Ala His Ala Glu Met Asp Gln Val lie
325330335
Gly Arg Asn Arg Arg Leu Glu Glu Ser Asp lie Pro Lys Leu Pro Tyr
340345350
Leu Gln Ala lie Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro
355360365
Leu Asn Leu Pro Arg Val Ala lie Glu Pro Cys Glu lie Asp Gly Tyr
370375380
Tyr lie Pro Lys Gly Thr Arg Leu Ser Val Asn lie Trp Ala lie Gly 385390395400
Arg A sp Pro Asp Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Asn Pro Asp Arg405410415
Phe Leu lie Gly Lys Met Ala Lys lie Asp Pro Arg Gly Asn Asn Phe
420425430
Glu Leu lie Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg lie Cys Ala Gly Thr Arg
435440445
Met Gly lie Val Leu Val Glu Tyr lie Leu Gly Thr Leu Val His Ala
450455460
Phe Glu Trp Lys Met Pro Asp Gly Glu Thr Leu Asn Met Asp Glu Ala 465470475480
Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Gly Val Pro Leu Ala Ala Val Val Thr
485490495
Pro Arg Leu Pro Pro Ser Ala Tyr Val Val 500505
3
18
DNA 人工合成
引物 Wl-FH-F
(1)..(18)
3
gcaccaccaatcaccatg
4
18
DNA 人工合成
引物 Wl-FH-R
(1)..(18)
4
Itccacaacaattctccc
5
18
DNA 人工合成
引物 W-FH-F(1).. (18)
5
c(a/1/c/g)ca(a/g)ga(t/c)atggt(t/c/g)tt (c/1)g
6
18
DNA
人工合成
引物 W-FH-R
(1).. (18)
6
c(a/t/g)at(a/t/c/g)gccca(a/t/g)at(a/g)tt(a/t/c/g)a
7
20
DNA
人工合成
引物 3』innner
(1).. (20)
7
atcaggtcattggcaggaac
8
20
DNA 人工合成
引物 3，out
(1).. (20)
8
aaggaacatatggcgacgag
9
20 DNA
人工合成
弓丨物5，innner(1).. (20)9cccagtcttcaatggcctta1020DNA人工合成引物5』 out(1).. (20)10aactcgttcgactccacacc1118DNA人工合成引物 W2-FH-F(1).. (18)11tgagtatgcttcggttct1218DNA人工合成引物 W2-FH-R(1).. (18)12atgctggtgtttgctatg1318DNA人工合成
引物 A-18SR-F (1)..(18) 13
tgagaaacggctaccaca 14 18 DNA 人工合成
引物 A-18SR-R (1)..(18) 14
acgcaataggaccgaaat
權利要求
1.黃烷酮3，，5，-羥化酶基因Ac-F3，5，H，來自於川烏頭腫carmichaeli Debx)，命名為Ac-F3，5，H基因，Ac_F3，5，H基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
2.如權利要求1所述黃烷酮3』，5』-羥化酶基因Ac-F3』 5』 H編碼的蛋白質，命名為 Ac-F3，5，H蛋白質，Ac-F3，5，H蛋白質的胺基酸序列為SEQ ID NO. 2。
全文摘要
本發明提供一種黃烷酮3』,5』-羥化酶基因及其所編碼的蛋白質，黃烷酮3』,5』-羥化酶基因Ac-F3』5』H來自於川烏頭(Aconitum carmichaeli Debx)，命名為Ac-F3』5』H基因，Ac-F3』5』H基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1，其所編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO.2，黃烷酮3』,5』-羥化酶基因Ac-F3』5』H為烏頭中首次報導，黃烷酮3』,5』-羥化酶基因Ac-F3』5』H的表達能夠促使植物合成翠雀花色素而使植物花色表現為藍色。將黃烷酮3』,5』-羥化酶基因Ac-F3』5』H導入其它缺少藍色花色系的花卉中，有望培育出藍色花色的花卉品種，提高花卉觀賞性。
文檔編號C12N9/02GK102304533SQ20111024050
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月22日 優先權日2011年8月22日
發明者吳麗芳, 崔光芬, 張藝萍, 王祥寧, 王繼華, 賈文杰, 馬璐琳 申請人:雲南省農業科學院花卉研究所