一種山羊mstn基因定點修飾系統及其應用的製作方法
2024-01-19 12:29:15 3
一種山羊mstn基因定點修飾系統及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種山羊MSTN基因定點修飾系統及其應用方法,所述山羊MSTN基因定點修飾系統,即能夠有效的識別、修飾山羊MSTN基因靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs;本發明提供的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由分別能夠特異識別所述識別模塊TALMEX-1F和TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R和TALEN-L組成;所述核酸酶TALEN-L為SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列編碼的蛋白質,所述核酸酶TALEN-R為SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示核苷酸序列編碼的蛋白質。本發明還公開了使用上述敲除系統對山羊細胞MSTN基因進行靶向修飾,獲得突變細胞系的方法。本發明對於在山羊上對MSTN基因進行敲除或改造以獲得優質瘦肉率的新品種及MSTN基因調控機理研究具有重大應用價值。
【專利說明】一種山羊MSTN基因定點修飾系統及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】,尤其涉及一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用,具體的說是利用一對轉錄激活效應因子核酸酶定點修飾山羊MSTN基因。
【背景技術】
[0002]肌生成抑制素(Myostatin,MSTN)廣泛存在於動物骨骼肌內,是骨骼肌生長的負調控因子,MSTN基因在動物胚胎發育期和成年期的骨骼肌中都有表達。小鼠、大鼠、人、牛、豬、羊、雞、火雞、斑馬魚的MSTN基因的cDNA已經被克隆、測序。研究結果表明,MSTN基因含有3個外顯子,並且在不同物種間MSTN基因序列高度保守。敲除MSTN基因會導致動物肌纖維廣泛性增生和肥大,骨骼肌量顯著增加。小鼠、大鼠、人、豬、雞、牛、綿羊、狒狒和斑馬魚等物種的MSTN基因編碼序列發生點突變或移碼突變,均呈現「雙肌症狀」(double muscling),表現出肌肉量顯著增加的性狀。目前已經在人、牛、綿羊、狗等物種中發現了自然發生的MSTN基因的突變,如比利時蘭牛(Belgian blue)、皮埃蒙特牛(Piedmontese)等在exon3序列上發生突變,機體表現出雙肌性狀。
[0003]按照人類意願對基因組進行定向修飾一直是許多科學家的夢想。通過對MSTN基因進行突變、缺失、敲除等遺傳修飾,獲得基因突變動物,一方面可以構建出具有「雙肌症狀」的動物模型用於生物學研究和疾病機理研究,另一方面可以達到改進肌肉質量和重量的目的,生產具有商業化性質的優良品種家畜。
[0004]人們一直在尋找簡單高效的方法對基因組進行靶向修飾。傳統的基因打靶技術依賴於細胞內自然發生的同源染色體隨機重組交換,中靶比例極低,通常只有10_6-10_8,未被廣泛應用。近年來核酸酶指導的基因組靶向修飾技術發展迅速。這類核酸酶通常由一個DNA識別結構域和一個非特異性核酸內切酶結構域構成,由DNA識別結構域特異的識別靶位點,把核酸酶定位到需要進行編輯的基因組區域,然後由非特異性核酸內切酶切斷DNA雙鏈,引起DNA自我修復機制,從而引發基因序列的突變和促進同源重組的發生。
[0005]人工鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZFN)技術是近年來發展起來的基因組定點修飾技術。ZFN是一種由能夠識別特異的DNA序列的結構域與Fok I內切酶結構域融合而成的蛋白,通過識別特定的DNA序列使得Fok I核酸內切酶在靶位點形成二聚體產生內切酶活性,造成靶位點DNA雙鏈的斷裂,從而引發非同源末端連接以及同源重組修復機制。在修復過程中產生的移碼突變可被用來對目的基因進行基因敲除,同源重組伴隨外源基因的插入可被用來執行特異位點的基因敲入。ZFN技術曾被認為對基因功能或產生轉基因動物意義重大,但是飽含著希望與失望,由於ZFN受上下文依賴效應影響與靶點DNA序列之間結合不穩定,不能靶向所有序列,使用前需要大量的篩選和鑑定工作,並且產生脫靶性切割引入無法預期的基因突變可能性高。此外,商業購買高效特異的ZFN價格昂貴,而研究者很難自行設計出特異和高效的ZFN。
[0006]近幾年研究發現,轉錄激活樣效應因子(transcription activator-likeeffector, TALE)具有DNA結合特異性,並且其識別密碼具有模塊化和簡單化特點,TALE-DNA結合結構域由串聯重複單元組成,大部分單元含34個胺基酸,單元的第12和13位胺基酸高度可變,成為重複可變區(repeat variable diresidues, RVDs)。TALE的RVDs識別DNA序列的4個鹼基具有高度專一性,第13位胺基酸直接與DNA的鹼基特異結合。研究者能夠根據DNA序列,在任意位點構建特異的TALE-DNA識別結合域,可以廣泛用於基因序列突變修飾和基因打靶等。
[0007]設定DNA靶序列,組裝TALE-DNA結合域,融合Fok I內切酶的非特異性DNA切割域,組裝成 TALE 核酸酶(tanscription activator-like effector nucleases, TALENs)。TALENs靶向結合DNA,Fok I非特異性切割DNA序列,產生DNA雙鏈斷裂(DNA double-srandbreaks, DSBs)。在真核細胞內DSBs激活兩條保守的DNA修復通路:非同源末端連接修復(non-homologous end joining, NHEJ)可以將斷裂的染色體重新連接,在連接過程中斷裂位點有可能引入小片段鹼基的丟失或插入,從而影響基因功能或產生基因敲除效應。若此時引入同源重組載體;同源指導修復(homology-directed repair, HDR)能夠利用相似的DNA模板指導修復,替代斷裂點周圍的DNA序列,實現特定突變或定點導入外源DNA。
【發明內容】
[0008]本發明目的在於提供一種山羊MSTN基因定點修飾系統及其在山羊MSTN基因修飾中的應用方法。
[0009]本發明中術語山羊MSTN基因是指山羊肌肉生成抑制蛋白(Myostatin,MSTN)基因。
[0010]為了解決上述問題,本發明採取了如下技術方案:
[0011]一種山羊MSTN基因定點修飾系統,所述定點修飾系統為一對山羊MSTN基因靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs,能夠有效剪切山羊MSTN基因靶序列;
[0012]所述山羊MSTN基因靶序列如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列,23-40位核苷酸為識別模塊TALMEX-1F,57-74位核苷酸的反向互補序列為識別模塊TALMEX-1R,41-56位核苷酸為間隔序列;
[0013]所述的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由識別所述識別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識別所述識別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R組成;
[0014]所述核酸酶TALEN-L,其特徵在於,由TALMEX-1F識別結構域TALE-L與經過人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成;所述核酸酶TALEN-R,其特徵在於,由TALMEX-1R識別結構域TALE-R與經過人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成;
[0015]所述識別結構域TALE-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質;所述DNA切割蛋白Fok-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示2023-2814位核苷酸編碼的蛋白質;所述識別結構域TALE-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質;所述DNA切割蛋白Fok-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示2023-2808位核苷酸編碼的蛋白質。
[0016]本發明還提供上述山羊MSTN基因定點修飾系統的製備方法,包括以下步驟:
[0017] (I)根據山羊MSTN基因選擇SEQ ID N0.1所示核苷酸序列為靶序列,SEQ ID N0.1所示核苷酸序列中23-40位核苷酸為識別模塊TALMEX-1F,與57-74位核苷酸反向互補的序列為識別模塊TALMEX-1R,41-56位核苷酸為間隔序列;[0018](2)根據步驟(1)所得識別模塊TALMEX-1F和識別模塊TALMEX-1R合成剪切所述靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs ;所述轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由識別所述識別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識別所述識別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R 組成;
[0019]所述核酸酶TALEN-L的核苷酸編碼序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示,所述核酸酶TALEN-R的核苷酸編碼序列如SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示;
[0020]本發明還公開了含有上述山羊MSTN基因定點敲除系統編碼基因的重組表達載體、重組菌或重組細胞系;
[0021]公開了所述山羊MSTN基因定點敲除系統在靶細胞中修飾目的基因核酸序列的應用。所述MSTN基因定點敲除系統在其他哺乳動物細胞MSTN基因修飾中的應用。
[0022]一種定點敲除山羊MSTN基因的方法,包括在山羊細胞中表達上述定點敲除系統的步驟。
[0023]進一步提供了能夠表達所述TALENs的mRNA,其特徵在於,所述mRNA序列以TALEN-L和TALEN-R所示的核苷酸序列為轉錄模板。以及所述mRNA在山羊細胞或受精卵中刪除MSTN基因的應用。 [0024]與現有技術相比,本發明的有益效果在於:
[0025]1、已經發現牛、綿羊和人等物種出現MSTN基因的天然突變,並且能夠引起雙肌性狀,但受限於技術因 素,應用同源打靶技術或ZFN方法很難實現山羊MSTN基因的高效突變。因此,本發明通過TALEN技術對山羊MSTN基因進行TALENs編輯,獲得MSTN基因靶序列發生突變的細胞系,為進一步驗證MSTN基因對山羊肌肉生長的調控機制提供了可行的材料和方法。
[0026]2、本發明獲得的MSTN基因靶序列發生突變的細胞系,能夠作為體細胞核移植製備MSTN基因突變山羊的核供體細胞,為改善山羊肉質和提高山羊出肉率提供新的技術途徑,對於在山羊上對MSTN基因進行敲除或改造以獲得優質瘦肉率的新品種及研究MSTN基因對山羊肌肉生長的調控機理具有重大應用價值。
[0027]3、本發明TALENs構建是針對山羊MSTN基因特定靶序列的重組核酸酶,在特異的位點切斷基因DNA,引發非同源末端連接修復,進而產生MSTN基因Knock-out突變。他克服了常規的ZFN方法不能識別任意目標基因序列,脫靶率高,以及識別序列經常受上下遊序列影響等問題;也克服了同源重組工作量大,突變率低,需要引入外源基因或標記基因等問題;而具有ZFN相等或更高的活性,在不引入外源基因或標記基因情況下,使MSTN基因定點突變變得更加簡單、方便,並且使用此類突變細胞在後續應用中能夠獲得生物安全性更高的基因突變動物品系。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為TALENs定點修飾山羊MSTN基因的作用原理示意圖;
[0029]圖2為pTALEN-L和pTALEN-R質粒示意圖;
[0030]圖3為細胞樣品擴增產物電泳圖;
[0031]圖4為細胞樣品擴增產物AluI酶切電泳圖;
[0032]圖5為TALENs活性檢測測序峰圖;[0033]圖6為突變細胞株L4測序峰圖
[0034]圖7為L4、L6、L7、L10、L11、L13樣品TA克隆測序結果;注:WT表示野生型基因序列;八表示出現基因缺失突變;fragmesshift表示發生鹼基替換;
[0035]圖8為L9、L16樣品測序峰值圖;注:峰值單一無套峰,表明發生雙等位基因發生的突變情況完全一致;
【具體實施方式】
[0036]下面結合附圖和具體實施案例對本發明作進一步詳細描述,但不作為對本發明的限定,具體操作過程按照下面步驟進行:
[0037]第一步、根據需敲除的基因序列設計出具有特異性的序列TALEN靶點;
[0038]第二步、根據設計出的TALEN靶點構建出TALEN質粒;
[0039]第三步、將TALEN質粒轉染受體細胞;[0040]第四步、對轉然後的細胞進行篩選、培養、挑取單克隆,單克隆擴大培養,鑑定單克隆細胞基因組突變情況,挑選出符合突變要求的陽性細胞克隆,以備後續實驗使用。
[0041]下述實例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。
[0042]下述實例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑購買獲得,可用類試劑或試劑盒替代。
[0043]實例山羊胎兒成纖維細胞MSTN基因修飾
[0044]MSTN基因與肌肉生長調控有關。本發明應用TALENs技術,針對山羊MSTN基因exonl的AGCT位點進行密碼子突變操作,從而實現MSTN基因的修飾。
[0045]1、本實例所需材料與試劑
[0046]FastTALETM TALEN Assembly kit 試劑盒由 Sidansai BiotechnologyC0., LTD (http://www.sidansa1.com/)提供。該試劑盒由8個骨架載體,172個RVD單體識別模塊及5種模塊連接操作液等組成。
[0047]感受態細胞購自生興生物技術(南京)有限公司,Cla 1.AluI內切酶、DNA Marker等購自寶生生物工程(大連)有限公司,測序及引物合成由華大基因(北京)科技有限公司完成,其他生化試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司,Multiporator、HypotonicElectroporationBufTer 及 electroporation cuvettes 購自 Eppendorf 公司,山羊胎兒成纖維細胞取自懷孕35~40天薩能奶山羊。
[0048]pL15、pRlI 骨架載體均來源於 FastTALETM TALEN Assembly kit。
[0049]2、山羊MSTN基因特異性TALENs靶點的選擇
[0050]本實例的針對山羊MSTN基因exonl序列,米用TAL effector NucleotideTarger2.0 (https: //tale-nt.cac.Cornell, edu/node/add/talen)設計識別模塊,5』 端保留T鹼基。選取TALMEX-1F和TALMEX-1R為識別模塊對山羊MSTN基因exonl序列的AGCT位點進行修飾。
[0051]TALMEX-1F CCTCAGTAAACTTCGCCT
[0052]TALMEX-1R TATAGCATCTTTGCTGAT
[0053]識別模塊TALMEX-1F對應的RVD序列:
[0054]HD-HD-NG-HD-N1-NN-NG-N1-N1-N1-HD-NG-NG-HD-NN-HD-HD-NG 或[0055]HD-HD-NG-HD-N1-NH-NG-N1-N1-N1-HD-NG-NG-HD-NH-HD-HD-NG
[0056]識別模塊TALMEX-1F對應的RVD序列:
[0057]NG-N1-NG-N1-NN-HD-N1-NG-HD-NG-NG-NG-NN-HD-NG-NN-N1-NG 或
[0058]NG-N1-NG-N1-NH-HD-N1-NG-HD-NG-NG-NG-NH-HD-NG-NH-N1-NG
[0059]其中HD識別C,NI識別A,NG識別T,NN或NH識別G。
[0060]本實例編碼TALEN-L識別區蛋白質的核苷酸序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3序列229-2022位核苷酸所示,編碼TALEN-R識別區蛋白質的核苷酸序列如SEQ ID N0.4或SEQ IDN0.4序列229-2022位核苷酸所示,分別能夠特異的識別MSTN基因中的18個核苷酸(TALEN-1^PJij CCTCAGTAAACTTCGCCT ; TALEN-R 識別 TATAGCATCTTTGCTGAT),由 TALEN-L 與TALEN-R共同組成TALENs突變系統,其作用原理如圖1所示。
[0061]3、TALENs表達載體的構建
[0062]參照FastTALETM TALEN Assembly kit 使用說明,根據 TALMEX-1F 和 TALMEX-1R識別模塊選擇對應的連接模塊,TALMEX-1F選擇9個識別單體模塊(CC1-T2-CA3-CT4-AA5-AC6-TT7-CG8-CC9)與pL15骨架載體連接,構建pTALEN-L質粒;TALMEX_1R選擇9個識別單體模塊(TA1-T2-AG3-CA4-TC5-TT6-TG7-CT8-GA9)與 pRll 骨架載體連接,構建 pTALEN-R 質粒。
[0063]轉化感受態細胞並進行篩選,ClaI酶切鑑定及測序獲得連接正確的pTALEN-L和pTALEN-R質粒,pTALEN-L和pTALEN-R示意圖如圖2所示。
[0064]4、TALENs活性檢測及單克隆突變細胞株的獲得
[0065]pTALEN-L和pTALEN-R質粒擴增、提取與純化參照《分子克隆實驗指南》第二版的方法進行。
[0066]手術方法取35日齡薩能奶山羊胎兒,在超淨工作檯內用D-Hank』 s液洗滌三次,用眼科剪剪去胎兒頭、四肢及內臟,剩餘組織用剪刀剪成lmm3的小塊組織,移入IOml離心管中並加入0.25% Trypsin消化液手握吹打消化15min,靜置2min後,吸取下部較大組織塊至新離心管,重複消化操作,將上清1500r/min、5min離心,棄去上清,加入新鮮的DMEM培養液(含10% FBS+1% PS)重懸細胞,稀釋成3X IO5個/ml,鋪板培養(37°C、5% CO2、飽和溼度的CO2)。細胞生長至匯合度80%時,用0.25%胰蛋白酶消化處理,洗滌收集後獲得山羊胎兒成纖維細胞備用。
[0067]向收集的細胞中加入1ml Electroporation Buffer懸浮細胞,1500r/min離心5min,棄上清液,將細胞重懸於400 μ L的轉染液(Hypotonic Electroporation Buffer分別含有20 μ g/ml的pTALEN-L和pTALEN-R質粒)中,使細胞密度為I~3 X IO6個/ml,將400 μ I 的細胞懸液轉移至 electroporation cuvettes (徑寬 2mm)內,放入 Multiporator電轉染槽中進行電轉染(轉染模式(Mode)為:Eukaryotes 「Θ」、Voltage (V) 400V、Timeconstant ( τ ) 300us、N0.0f pulse (n) I次)。電脈衝後,使細胞懸液在cuvette (轉染杯)中室溫條件下靜置5min ;將細胞懸液加入正常細胞培養液,鋪於6孔板後置於37°C、5% CO2>飽和溼度培養。
[0068]鋪板24h 後更換篩選培養液(DMEM+10 % FBS+1 % PS+3 μ g/ml Puro),篩選 72h 後更換為正常細胞培養液繼續培養,消化收集3孔細胞進行活性檢測,編號為LI~L3,其餘細胞繼續擴大培養5~10天,挑取細胞克隆96個至48孔板繼續培養至匯合度70%時,收集部分細胞進行突變檢測,編號為L4~L45,同時收集部分正常細胞作為對照組,編號為Wl~W30
[0069]通過單細胞PCR方法進行活性檢測及突變檢測。收集的細胞樣品編號為:L1~L3為篩選72h後收集的細胞;L4~L45為單克隆細胞株;W1~W3為未轉染細胞。將細胞樣品置於200 μ I離心管內,離心去除培養液,加入10 μ L細胞裂解液(見表1),45°C孵育15min,96°C孵育20min後直接作為普通PCR檢測的DNA模板,_20°C保存備用。
[0070]表1細胞裂解液
[0071]
【權利要求】
1.一種山羊MSTN基因定點修飾系統,其特徵在於有效的基因定點修飾系統為剪切山羊MSTN基因靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs ; 所述山羊MSTN基因靶序列如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列,23-40位核苷酸為識別模塊TALMEX-1F,與57-74位核苷酸的互補序列為識別模塊TALMEX-1R,41-56位核苷酸為間隔序列; 所述的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由識別所述識別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識別所述識別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R組成; 所述核酸酶TALEN-L,由TALMEX-1F識別結構域TALE-L與經過人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成;所述核酸酶TALEN-R,由TALMEX-1R識別結構域TALE-R與經過人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成; 所述識別結構域TALE-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質;所述DNA切割蛋白Fok-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示2023-2814位核苷酸編碼的蛋白質;所述識別結構域TALE-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質;所述DNA切割蛋白Fok-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示2023-2808位核苷酸編碼的蛋白質。
2.權利要求1所述山羊MSTN基因定點修飾系統的製備方法,其特徵在於,包括以下步驟: (1)根據山羊MSTN基 因選擇SEQID N0.1所示核苷酸序列為靶序列,SEQ ID N0.1所示核苷酸序列23-40位核苷酸為識別模塊TALMEX-1F、與57-74位核苷酸互補的序列為識別模塊TALMEX-1R、41-56位核苷酸為間隔序列、47-50位核苷酸為剪切靶點並可作為AluI限制性內切酶酶切突變檢測位點; (2)根據步驟(1)所得識別模塊TALMEX-1F和識別模塊TALMEX-1R合成剪切所述靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs ;所述轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由識別所述識別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識別所述識別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R 組成; 所述核酸酶TALEN-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示核苷酸編碼的蛋白質,所述核酸酶TALEN-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示所示核苷酸編碼的蛋白質。
3.含有權利要求1所述山羊MSTN基因定點修飾系統的重組表達載體、重組菌或重組細胞系。
4.權利要求1所述山羊MSTN基因定點修飾系統在靶細胞目的基因識別、修飾中的應用。
5.根據要求I或3所述載體或核苷酸序列合成或轉錄能夠表達權利要求1所述TALENs的mRNA,其特徵在於,所述mRNA序列以TALEN-L或TALEN-R所示的核苷酸序列為轉錄模板。
6.根據權利要求5所述mRNA在山羊細胞MSTN基因修飾中的應用。
7.根據權利要求1所述MSTN基因定點修飾系統在其他哺乳動物細胞MSTN基因修飾中的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK103952405SQ201410201664
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月13日 優先權日:2014年5月13日
【發明者】成勇, 於寶利 申請人:揚州大學