考馬斯亮藍染色液及其染色方法和在蛋白檢測中的應用的製作方法

2023-04-30 18:49:21

專利名稱：考馬斯亮藍染色液及其染色方法和在蛋白檢測中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質染色領域，更具體地說，涉及考馬斯亮藍染色液及其染色方法和在蛋白檢測中的應用。
背景技術：
目前，在蛋白質組學研究中的蛋白質染色方法大致有以下四種，考馬斯亮藍染色法、螢光染色法、硝酸銀染色法、同位素顯色法等。其中，螢光染色以SYPRO試劑為主，蛋白質檢測靈敏度高，能兼容質譜，但由於需要配備特殊的檢測儀器及昂貴的試劑，未被作為常規方法使用；同位素顯色法則存在安全性和操作局限性等問題，也未能被廣泛使用；硝酸銀染色法是目前公認的除放射性標記以外的一種最為靈敏的蛋白檢測方法，可在納克級水平上檢測SDS-PAGE膠上的蛋白質，但是，其步驟繁瑣，成本高，對環境的汙染嚴重；更為嚴重的是，其在脫色過程中所使用的戊二醛等醛類物質會對蛋白質進行不可逆的修飾，嚴重幹擾後期的質譜鑑定工作。因此，在蛋白質組學研究中，更傾向於採用經典的考馬斯亮藍染色法。經典的考馬斯亮藍染色法具有良好的重複性、極低的染色背景、較高的靈敏度 (大約O. 5 μ g/mm2)以及優良的質譜兼容性。特別是經過Neuhoff等人(Neuhoff,V. ,Arold, N. , Taube, D. , Ehrhardt ff. , Electrophoresis 1988,9,255)的開創性工作之後，發明了改良型考馬斯亮藍染色法，該方法的靈敏度得到了顯著提高，可以檢測到蛋白質總量約為 30納克的條帶，其所使用的考馬斯亮藍染色液的成分如下2%磷酸、10%硫酸銨、20%甲醇、O. I %考馬斯亮藍G250。隨後，在Neuhoff等人的研究基礎上，Candiano及其合作者 (Giovanni C. , Maurizio B. , Luca M. , Electrophoresis 2004, 25,1327-1333)發明了一種被稱為Blue Silver的考馬斯亮藍染色方法，該方法能夠檢測到僅含有10納克蛋白的條帶，靈敏度接近銀染法，據稱是目前所報導的考馬斯亮藍染色方法中靈敏度最高的一種，其所使用的考馬斯亮藍染色液的成分與NeuhofT等人的研究相比，區別在於增加考馬斯亮藍 G250的含量(由O. I %升至O. 12% )、磷酸的含量(由2%升至10% )。但這種方法需要在水中脫色很長的時間，使得膠吸水膨大，變得非常脆，極易破裂，不利於後續的研究工作。因此，需要一種新的考馬斯亮藍染色液和染色方法，能夠在保證靈敏度的情況下， 以更低的成本實現對SDS-PAGE膠的染色。

發明內容
本發明的目的在於提供一種考馬斯亮藍染色液及其染色方法和在蛋白檢測中的應用，旨在保證靈敏度(IOng)的情況下，進一步降低SDS-PAGE膠染色成本，並解決脫色後膠容易破碎的問題。為了實現發明目的，本發明提供了一種考馬斯亮藍染色液，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10%的酸，質量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. 1%的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和 R250中的至少一種。優選的，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為
4.75 % 8. 5 %的酸，質量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01 % O. I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。更優選的，所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75 % 8. 5 %的磷酸，質量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質量體積濃度為 O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍G250的水溶液。本發明還提供了一種基於上述任一種考馬斯亮藍染色液的染色方法，包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置於考馬斯亮藍染色液中，染色45min以上；B.脫色用水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，將染色液衝洗乾淨即可；所述考馬斯亮藍染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10%的酸，質量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01%
O.I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種；。其中，在步驟A之前還包括步驟A』.固定將SDS-PAGE膠在固定液中固定5min 30min ;所述固定液是包含體積百分濃度為20% 50%的醇，體積百分濃度為I % 5%的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一種。優選的，步驟A』所述固定液是包含體積百分濃度為25% 35%的乙醇，體積百分濃度為3% 5%的磷酸的水溶液；固定時間為IOmin 20min。其中，在步驟A』之前還可包括步驟A」.漂洗用水衝洗SDS-PAGE膠。上述任一方案中，優選的，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20% 的醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的酸，質量體積濃度為5% 8. 5%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。更優選的，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的磷酸，質量體積濃度為5% 8. 5 %的硫酸銨，質量體積濃度為
O.01% O. 03%的考馬斯亮藍G250的水溶液，染色時間為45min 70min。通過上述任一種染色液處理過的SDS-PAGE膠均能應用於蛋白質的定性和/或定
量檢測。與現有技術Blue Sliver法相比，本發明通過降低考馬斯亮藍等的濃度，使得本發明的考馬斯亮藍染色液和染色方法能夠在保證靈敏度(IOng)的情況下，以更低的成本實現對SDS-PAGE膠的染色，且脫色後的膠不易破碎，不會給後續的質譜等研究工作造成困難。


圖I是本發明的實驗組一的染色結果2是本發明的實驗組二的染色結果3是本發明的實驗組三的染色結果4是本發明的實驗組四的染色結果5是本發明的實驗組五的染色結果6是本發明的對照組的染色結果圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。一種考馬斯亮藍染色液，所述染色液是包含體積百分濃度(v/v)為10% 20%的醇，體積百分濃度(v/v)為4. 5% 10%的酸，質量體積濃度(w/v)為5% 10%的硫酸銨， 質量體積濃度(w/v)為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。考馬斯亮藍濃度越高，其對SD-PAGE膠中的蛋白質的雜色越深，即靈敏度越高，但可能加深凝膠的背景，Candiano等在綜合考慮這兩種影響以後，在改良型考馬斯亮藍染色法的基礎上，將考馬斯亮藍G250的含量提高了 20%，同時將磷酸的含量提高了 400%，從而得出了目前靈敏度最高的考馬斯亮藍染色液(Blue Sliver法)。本發明的染色液降低了考馬斯亮藍等的濃度，但是其靈敏度與Blue Sliver法相同(IOng)或更高，又因為利用本發明的考馬斯亮藍染色液對SDS-PAGE膠進行染色時，染色液與SDS-PAGE膠體積的對應關係， 與Blue Silver法中的染色液與SDS-PAGE膠體積的對應關係相同，只需將SDS-PAGE膠完全沒入染色液中即可。在目前的市場上，甲醇的價格較乙醇高，G250和R250的單價相同，磷酸的價格較乙酸高，因此本發明方案中的醇的成本至多為Blue Sliver法中的50% 100%， 酸的成本至多為Blue Sliver法中的45% 100%,硫酸銨的成本至多為Blue Sliver法中的50% 100%,考馬斯亮藍的成本為Blue Sliver法中的十二分之一至六分之五。所以本發明的考馬斯亮藍染色液能夠在保證靈敏度(IOng)的情況下，以更低的成本實現對 SDS-PAGE膠的染色。現有技術中，染色液中使用的醇為甲醇，而在本發明的染色液中，醇包括甲醇和乙醇中的至少一種。當該醇為甲醇和乙醇的混合液時，混合液中的甲醇可用等體積的乙醇替代。本發明的考馬斯亮藍染色液能夠在保證靈敏度(IOng)的情況下，以更低的成本實現對 SDS-PAGE膠的染色。優選的，所述醇為乙醇，以降低染色液的毒性，使操作更安全，且能進一步降低成本。蛋白質著色顯示的靈敏度與染色試劑直接相關，本發明中採用是考馬斯亮藍 G250、R250或G250和R250的混合物。因為G250與蛋白的結合速度比R250更快，因此，當僅是考馬斯亮藍種類(G250或R250)不同時，含G250的染色液能進一步的縮短染色時間； 而含R250的染色液的靈敏度更高，染色後的脫色更快，背景更清晰。優選的，考馬斯亮藍含量為O. 01% O. 05% (w/v);該方案中，考馬斯亮藍的成本僅為Blue Silver法中的十二分之一至十二分之五。更優選的，考馬斯亮藍含量為O. 01% O. 03% (w/v)，即該方案中， 考馬斯亮藍的成本僅為Blue Silver法中的十二分之一至四分之一。與Blue Silver法相比，上述方案中的考馬斯亮藍含量更低，因為考馬斯亮藍的溶解度不高，所以，本發明的染色液在保證了靈敏度(IOng)的情況下，既降低了成本，又使得染色液的配置更為方便，不易出現沉澱；而沉澱的出現會導致染色液在染色過程中出現染色不均勻的現象。在本發明的染色液中，所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種。當所述酸含有多種組分時，磷酸和乙酸相互之間能夠以相同的體積分數替換，例如1% (v/v)的磷酸可用1% (v/v)的乙酸替換。在酸的體積百分比一定的情況下，磷酸的染色效果更佳。優選的，所述酸的含量為4. 75% 8. 5% (v/v) 0更優選的，所述酸為磷酸；該方案中，磷酸的成本僅為 Blue Silver法中的4. 75% 8. 5%。其中，磷酸在染色液中既能輔助固定蛋白質,又維持了染色液的PH值，有利於考馬斯亮藍G250或R250與蛋白質的結合，使得染色背景更清晰， 有利於獲得信噪比高的圖像；此外，磷酸的揮發性較乙酸更低，使得本發明的染色液的刺激性降低，更易為操作者接受。上述方案均在保證了靈敏度(IOng)的情況下，降低了染色液的成本。優選的，硫酸銨的含量為5% 8. 5% (w/v);該方案中，硫酸銨的成本僅為Blue Silver法中的50% 85%。當把本發明的染色液中的硫酸銨去除後，染色液的靈敏度僅為IOOng左右，硫酸銨的加入，使得染色液成為酸性的離子溶液，在該溶液中蛋白質的葡萄胺和天冬醯胺發生質子化，使得考馬斯亮藍與蛋白的結合更為緊密，從而極大的提高了染色液的靈敏度。上述方案均在保證了靈敏度(IOng)的情況下，降低了染色液的成本。水質對染色液的靈敏度也有一定的影響，本發明中所述的水可採用蒸餾水、雙蒸水或超純水，優選超純水。一種基於上述任一種考馬斯亮藍染色液的染色方法，包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置於考馬斯亮藍染色液中，染色45min以上；B.脫色用水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，將染色液衝洗乾淨即可；所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10 %的酸，質量體積濃度為5 % 10 %的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01 % O. I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。上述的染色方法，能夠在更短的時間內完成對SDS-PAGE膠的染色，且其染色背景較Blue Silver法更低，靈敏度為IOng或更高。其中，在步驟A之前還包括步驟A』 .固定將SDS-PAGE膠在固定液中固定5min 30min ;所述固定液是包含體積百分濃度為20% 50%的醇，體積百分濃度為1% 5%的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一種。通過固定步驟, SDS-PAGE膠中的蛋白被固定在凝膠中，不易擴散，進一步提高了染色液的靈敏度；且通過固定步驟可去除在電泳過程中遺留在SDS-PAGE膠上的幹擾染色過程的物質，如去垢劑、還原劑和緩衝液等成分。在酸的體積百分比一定的情況下，固定液中酸的成本排列如下乙酸< 磷酸 <三氯乙酸，但是經固定以後染色的效果以三氯乙酸最佳，其次是磷酸，最後是乙酸。優選的，步驟A』所述固定液是包含體積百分濃度為25% 35%的乙醇，體積百分濃度為3% 5%的磷酸的水溶液；固定時間為IOmin 20min。本方案中，所述醇為乙醇， 不含甲醇，降低了固定液的毒性，使操作更安全；所述酸為磷酸，本方案綜合考慮了固定液中酸的成本，酸的揮發性對操作者的影響，以及固定液的效果。其中，在步驟A』之前還包括步驟A」.漂洗用水衝洗SDS-PAGE膠。通過漂洗步驟，可衝去在電泳過程中遺留在 SDS-PAGE膠上的幹擾染色過程的物質，如去垢劑、還原劑和緩衝液等成分，尤其是SDS,而 SDS的存在會使染色液在染色過程中出現沉澱，幹擾考馬斯亮藍與蛋白質的集合，從而影響染色效果。優選的，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75 % 8. 5 %的磷酸，質量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍G250的水溶液，染色時間為45min 70min。本方案對 SDS-PAGE膠的染色效果更好，背景更低，靈敏度在5ng IOng之間，較Blue Sliver法更聞。考馬斯亮藍染色液的配置，以體積百分濃度為20%的乙醇，體積百分濃度為5% 的磷酸，質量體積濃度為5%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 02%的考馬斯亮藍G250的水溶液為例。在終體積IOOmL的超純水中加入相應的磷酸，使其終濃度為5 % (v/v)，攪拌均勻；然後加入硫酸銨，使其終濃度為5% (w/v)，攪拌使其徹底溶解；然後加入考馬斯亮藍 G2500. 02g，邊加邊攪拌，當G250全部溶解後，加入600mL的超純水，然後加入適量的無水乙醇，使其終濃度為20% (v/v)，然後用超純水定容至1000mL。配置好後置於棕色瓶中密封保存。其它配比的考馬斯亮藍染色液均可參照上述方法進行配置。例如配比一:0.01% (w/v)G250,10% (v/v)磷酸,9% (w/v)硫酸銨，18% (v/v)乙醇。 本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為10ng，與Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液相同，成本則更低。配比二0.1% (w/v) G250, 2% (v/v)磷酸,2.8% (v/v)乙酸,5% (w/v)硫酸銨， 11% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液高，成本則更低。配比三0.07%(w/v)G250,5. 5% (v/v)乙酸，7.5% (w/v)硫酸銨,7% (v/v)乙醇，7% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液高，成本則更低。配比四:0.02%(w/v) R250, 7. I % (v/v)磷酸,8% (w/v)硫酸銨，7% (v/v)乙醇， 9% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液更高，成本則更低。配比五0.04%(w/v)R250,6% (v/v)磷酸，5% (w/v)硫酸銨，20% (v/v)甲醇。 本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液高，成本則更低。
配比六0.07%(w/v) R250,4. 5% (v/v)乙酸,9.5% (w/v)硫酸銨，13% (v/v)乙醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液高，成本則更低。配比七0.I % (w/v) R250,10% (v/v)乙酸,6. 3% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇。 本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液高，成本則更低。配比八0.009%(w/v)G250,0. 001 % (w/v)R250,10% (v/v)憐酸，10% (w/v)硫酸銨，18% (v/v)乙醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為10ng，與Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液相同，成本則更低。配比九0.015%(w/v)G250,0. 005% (w/v)R250,9% (v/v)磷酸，9. 5% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇，5% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比 Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液更高，成本則更低。配比十0.01%(w/v)G250,0. 03 % (w/v) R250, 3 % (v/v)憐酸，3% (v/v)乙酸， 7% (w/v)硫酸銨，12% (v/v)甲醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液更高，成本則更低。配比十一:0.03% (w/v)G250,0. 04% (w/v)R250,4. 5% (v/v)憐酸，5% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇。本配比的考馬斯亮藍染色液的靈敏度為5ng，比Blue Sliver考馬斯亮藍染色法中的染色液更高，成本則更低。考馬斯亮藍染色液靈敏度實驗以牛血清白蛋白(BSA)為標準樣品，配置系列濃度的溶液，分別為20ng/ μ L、 16ng/ μ L、10ng/ μ L、6ng/ μ L、4ng/ μ L、2ng/ μ L、lng/ μ L、0. 2ng/ μ L ;各樣品的上樣量均為5 μ L,即各孔上樣量分別為100ng、80ng、50ng、30ng、20ng、10ng、5ng、lng。電泳完成後分別按下述方法進行染色處理。實驗組一考馬斯亮藍染色液0.02% (w/v)G250,5% (v/v)磷酸，5% (w/v)硫酸銨，20% (v/v)乙醇。固定液30%(v/v)乙醇、5% (v/v)磷酸。染色方法I)漂洗蒸餾水衝洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定固定液固定15min ；3)染色染色液染色Ih ；4)脫色蒸餾水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，每次30s，重複4次。實驗組二 考馬斯亮藍染色液0.01%(w/v)R250,2% (v/v)乙酸，8% (v/v)磷酸，10% (w/ v)硫酸銨，15% (v/v)乙醇。染色方法I)漂洗蒸餾水衝洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)染色染色液染色70min ；3)脫色蒸餾水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，每次30s，重複4次。
實驗組三考馬斯亮藍染色液0.03% (w/v)G250,4. 5% (v/v)磷酸，8· 5% (w/v)硫酸銨， 20% (v/v)甲醇。固定液20% (v/v)甲醇、3% (v/v)三氯乙酸。染色方法I)漂洗蒸餾水衝洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定固定液固定30min ；3)染色染色液染色a ；4)脫色蒸餾水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，每次30s，重複4次。實驗組四考馬斯亮藍染色液0.05% (w/v)G250,8. 5% (v/v)乙酸，7% (w/v)硫酸銨，10% (v/v)乙醇。固定液50%(v/v)乙醇、O. 5% (v/v)磷酸,0.5% (v/v)三氯乙酸。染色方法I)漂洗蒸餾水衝洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定:固定液固定5min ；3)染色染色液染色45min ；4)脫色蒸餾水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，每次30s，重複4次。實驗組五考馬斯亮藍染色液0.05% (w/v)G250,0. 05% (w/v)R250,4. 75% (v/v)磷酸，6% (w/v)硫酸銨，20% (v/v)乙醇。固定液40%(v/v)乙醇、2% (v/v)乙酸。染色方法I)漂洗蒸餾水衝洗SDS-PAGE膠兩次，每次30s ；2)固定固定液固定20min ；3)染色染色液染色Ih ；4)脫色蒸餾水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，每次30s，重複4次。對照組的染色液按Blue Sliver 法(Giovanni C. , Maurizio B. , Luca Μ., Electrophoresis 2004，25，1327-1333)進行配置和染色。實驗組一至五和對照組的實驗結果分別如圖I至6所示。其中，實驗組一的靈敏度為5ng,較對照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外，其脫色過程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時間僅為2min，脫色後的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會給後續的質譜等研究工作造成困難。實驗組二的靈敏度為10ng，與對照組相同，但其成本更低。另外，其脫色過程中， SDS-PAGE膠在水中浸泡的時間僅為2min，脫色後的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現象， 仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會給後續的質譜等研究工作造成困難。實驗組三的靈敏度為5ng,較對照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外,其脫色過程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時間僅為2min，脫色後的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會給後續的質譜等研究工作造成困難。實驗組四的靈敏度為5ng,較對照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外,其脫色過程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時間僅為2min，脫色後的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會給後續的質譜等研究工作造成困難。實驗組五的靈敏度為5ng,較對照組(Blue Sliver法)高,且成本更低。另外,其脫色過程中，SDS-PAGE膠在水中浸泡的時間僅為2min，脫色後的膠與脫色前相比，觀察不到膨大現象，仍然能夠保持很好的韌性，不易破碎，不會給後續的質譜等研究工作造成困難。總體來說，實驗組背景均較對照組淺，實驗組一、三、四、五的靈敏度均在5ng左右，實驗組二和對照組的靈敏度在IOng左右，即本發明的考馬斯亮藍染色液和染色方法與 Blue Sliver法相同或更高，本發明能在保證靈敏度的情況下，進一步降低考馬斯亮藍染色法的成本。另外，根據本發明的發明人觀察，SDS-PAGE膠經本發明的染色方法染色後脫色的時間極短(SDS-PAGE膠在水中浸泡的時間為2min)，脫色後的SDS-PAGE膠未見明顯脹大， 仍然保持較好的韌性，而Blue Sliver法處理的SDS-PAGE膠明顯脹大，在拍膠的時候需非常小心，以防膠破碎。應當說明的是，上述實驗組所體現的染色液配方及染色方法是本發明的幾種具體實施方式
，是為了清楚的闡述本發明的實驗效果，各實驗組內的染色液配方和染色方法之間並不是唯一的對應關係，脫色的時間可根據需要進行相應的調整，例如延長或縮短 SDS-PAGE膠的浸泡總時間。應當說明的是，本發明的所有染色液配方均能通過本發明的染色方法，實現對SDS-PAGE膠中蛋白質的成功染色。另外，本發明的染色液和染色方法的應用不限於蛋白質質譜研究，在其他的蛋白質定性和定量檢測中的應用也應屬於本發明的保護範圍。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種考馬斯亮藍染色液，其特徵在於，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 5% 10%的酸，質量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。
2.根據權利要求I所述的考馬斯亮藍染色液，其特徵在於，所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的酸，質量體積濃度為5% 8.5%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。
3.根據權利要求2所述的考馬斯亮藍染色液，其特徵在於，所述染色液是包含體積百分濃度為15 % 20 %的乙醇，體積百分濃度為4. 75 % 8. 5 %的磷酸，質量體積濃度為 5% 8. 5%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍G250的水溶液。
4.一種考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置於考馬斯亮藍染色液中，染色45min以上；B.脫色用水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，將染色液衝洗乾淨即可；所述考馬斯亮藍染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4.5% 10%的酸，質量體積濃度為5% 10%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. I % 的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。
5.根據權利要求4所述的考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，在步驟A之前還包括步驟A』.固定將SDS-PAGE膠在固定液中固5min 30min ;所述固定液是包含體積百分濃度為20% 50%的醇，體積百分濃度為1% 5%的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一種。
6.根據權利要求5所述的考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，步驟A』所述固定液是包含體積百分濃度為25 % 35 %的乙醇，體積百分濃度為3 % 5 %的磷酸的水溶液；固定時間為 IOmin 20min。
7.根據權利要求5所述的考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，在步驟A』之前還包括步驟A」 .漂洗用水衝洗SDS-PAGE膠。
8.根據權利要求4至7中任一項所述的考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為10% 20%的醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的酸，質量體積濃度為5 % 8. 5 %的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01 % O. I %的考馬斯亮藍的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一種；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一種；所述考馬斯亮藍包括G250和R250中的至少一種。
9.根據權利要求8所述的考馬斯亮藍染色方法，其特徵在於，步驟A所述染色液是包含體積百分濃度為15% 20%的乙醇，體積百分濃度為4. 75% 8. 5%的磷酸，質量體積濃度為5% 8. 5%的硫酸銨，質量體積濃度為O. 01% O. 03%的考馬斯亮藍G250的水溶液，染色時間為45min 70min。
10.根據權利要求I至3中任一項所述考馬斯亮藍染色液在蛋白質的定性和/或定量檢測中的應用。
全文摘要
本發明涉及蛋白質染色領域，具體涉及一種考馬斯亮藍染色液及其染色方法和在蛋白檢測中的應用。所述考馬斯亮藍染色液是包含10％～20％(v/v)的醇，4.5％～10％(v/v)的酸，5％～10％(w/v)的硫酸銨，0.01％～0.1％(w/v)的考馬斯亮藍的水溶液。所述方法包括以下步驟A.染色將SDS-PAGE膠置於考馬斯亮藍染色液中，染色45min以上；B.脫色用水衝洗染色後的SDS-PAGE膠，將染色液衝洗乾淨即可。本發明的考馬斯亮藍染色液和染色方法能夠在保證靈敏度不降低的情況下，以更低的成本實現對SDS-PAGE膠的染色，且脫色後的膠不易破碎，不會給後續的質譜等研究工作造成困難。
文檔編號G01N1/30GK102604425SQ20121004787
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者盛司潼 申請人:盛司潼