一種完全培養基及人羊膜間充質幹細胞的培養方法

2023-05-28 11:04:51

專利名稱：一種完全培養基及人羊膜間充質幹細胞的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種完全培養基及人羊膜間充質幹細胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)的培養方法，屬於細胞工程及生物醫藥技術領域。
背景技術：
人羊膜為附著在胎盤絨毛膜表面的一層半透明薄膜，屬於胎膜組織的一部分，由胚胎發育期的細胞滋養層演化而來。除人羊膜上皮細胞以外，hAMSCs是構成人羊膜組織的主要細胞類型之一，表達胚胎幹細胞和間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的標誌，具有多譜系分化潛能，是一種具有代表性的MSCs。在體外特定誘導條件下，hAMSCs 可分化成來自三個胚層的所有細胞，包括神經細胞、心肌樣細胞、胰腺細胞和肝細胞等。 hAMSCs因其多向分化潛能和低免疫原性，體外擴增能力明顯強於骨髓間充質幹細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，加之其來源豐富，易於富集，不牽涉醫學倫理問題等優勢，且目前臨床已用於角膜損傷、眼皮膚損傷和肌腱損傷等治療，並取得較好的治療效果。因而，hAMSCs在體細胞治療和組織工程研究中顯示出良好的應用前景。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)含有豐富的生長因子、營養成分及維持細胞生長的激素，還可為細胞貼壁、鋪展提供所需的因子。因此，幹細胞的培養體系主要應用含動物血清(如FBS)的培養基，BMSCs和臍帶血間充質幹細胞的培養也多採用FBS。目前， hAMSCs的培養體系通常為LG-DMEM培養基中加入10%的FBS、2mmol/L L-穀氨醯胺、1 %非必需胺基酸55ymol/L 2-巰基乙醇和lmmol/L丙酮酸鈉，傳代培養2-4代，hAMSCs的表面標誌與BMSCs相似，除表達典型的間充質細胞標誌，如波形蛋白(vimentin，VIM)、CD105+、 CD90+、CD73+、CD44+、CD29+、HLA-A，B，C+、CD13+、CD10+、CD49c+、CD49d、CD49e+、CD54+ 和 CD166+、 ⑶271低表達，⑶⑶34\⑶45\⑶3Γ、⑶133-和⑶；Γ，不表達HLA-DR，還表達幹細胞標誌 Oct-4、TRA-1-60、SSEA-3、SSEA-4 和其他 CD 分子 CD349、CD 140b 和 CD324 (E-cadherin) 等。但FBS等動物血清的應用，在幹細胞移植後，輸入異種蛋白對患者存在潛在的威脅，可產生抗FBS抗體及其他尚未知曉的不良反應，而且可能造成人與其他物種間病毒感染的傳播。如何優化培養體系，找到一種既能促進MSCs增殖，又能提供多向分化潛能的優質幹細胞，也是滿足細胞治療臨床需求的基本條件，研究人員不斷探索，努力提高細胞培養血清質量，或探索無血清培養體系等，因而，良好的培養體系的建立是生物技術產業中幹細胞體外擴增應用於臨床的關鍵、核心技術。人臍帶血血清(human cord blood serum, hCBS)來源於分娩後的臍帶，含有一系列營養因子和細胞因子，來源豐富、易於獲取、採集方便，對供者沒有損害，無生理和倫理問題，較FBS等動物血清而言，引起動物性疾病在人的傳播風險小，可以避免細胞吞噬FBS中的蛋白質及移植時宿主產生免疫反應。hCBS已用於BMSCs和臍帶血間充質幹細胞的培養， 且hCBS在BMSCs的培養擴增中明顯優於優等FBS。在hCBS為主體的培養體系中，臍帶間充質幹細胞可穩定生長，貼壁細胞呈現典型的MSCs特徵，細胞呈成纖維細胞樣，平行排列生長或旋渦狀生長，並可傳代擴增。但有關自體hCBS用於hAMSCs培養的研究國內外尚未見報導。基於hAMSCs的良好臨床應用前景，發明人在已建立的胰酶和II型膠原酶消化、分離、純化和10% FBS LG-DMEM完全培養基培養hAMSCs方法基礎上，首次建立自體hCBS培養體系，並觀察、分析hCBS培養的hAMSCs的免疫表型、細胞增殖和細胞周期及其多能幹細胞標誌等，為hAMSCs用於人體細胞治療提供基本培養技術，可望優先滿足自體hAMSCs移植的需要和解決一定規模的hAMSCs細胞產品製備。

發明內容
本發明的目的在於提供一種完全培養基及hAMSCs的培養方法。本發明以人自體臍帶血血清和低糖-Dulbecco極限必須培養基組成完全培養基，用於人羊膜間充質幹細胞 (hAMSCs)的培養，能使細胞保持良好形態學特徵和增殖能力，並保持間充質細胞及幹細胞的表型標誌和蛋白特徵及多向分化潛能。本發明是這樣構成的一種完全培養基，它是按體積比向低糖-Dulbecco極限必須培養基(低糖-dulbecco，s minimum essential medium，LG_DMEM)溶液中加入3%-10% 的人自體臍帶血血清(human cord blood serum, hCBS)配製而成。前述低糖-Dulbecco極限必須培養基(LG-DMEM)溶液這樣製備取低糖-Dulbecco極限必須培養基(LG-DMEM) IOg (Gibco公司市售產品，IOg/袋)溶於1000ml 超純水中，調pH值至7. 2-7. 4，過濾除菌，分裝，4°C保存，即可。前述人自體臍帶血血清(hCBQ這樣製備無菌條件下抽取臍帶血50_70ml，注入無菌玻璃瓶中，靜置於37°C培養箱池，待血凝塊完全析出後，無菌條件下，超淨臺中吸取析出的血清，移入新的無菌離心管內，4°C、IOOOg離心20min，收集上清15_20ml，56°C水浴滅活30min，0. 2 μ m濾器除菌後，血清分裝於5ml小瓶，_20°C保存、備用；同時進行培養，檢菌， 無細菌生長即可。一種人羊膜間充質幹細胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs) 的培養方法，包括以下步驟(1)分離將羊膜組織用D-Hank』S液衝洗乾淨，剪碎，分裝於離心管內，用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA-2Na消化液重複消化、過濾3次，剩餘的羊膜組織用D-Hank' s液衝洗，加入0. 75mg/ml II型膠原酶-0. 075mg/ml Dnase I消化液旋轉消化，至組織完全消化，過濾，收集細胞濾液，離心，棄上清；( 原代培養離心後的沉澱用完全培養基進行原代培養；(3)傳代培養待人羊膜間充質幹細胞生長到80% -90%融合後， 再進行傳代培養。前述步驟(1)中用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA_2Na消化液消化的過程為先於 37°C消化lOmin，棄去消化液；再於37°C、200rpm低速旋轉，繼續消化20min，經300目不鏽鋼網過濾，收集組織碎片於離心管內；同樣方法重複消化、過濾2次。前述步驟(1)中的旋轉消化條件為37°C、200rpm，消化時間為2h，經300目不鏽鋼網濾過，收集細胞濾液於離心管。前述步驟( 所述原代培養過程為用含3% -10% hCBS的完全培養基懸浮細胞後計數，按lX107cells/ml的細胞密度接種，37°C、5% CO2、飽和溼度條件下培養4 後換液，繼續培養5-7d，每3-4d換液一次，觀察細胞生長情況。前述步驟C3)所述傳代培養過程為取對數生長期內，融合率80% -90%的人羊膜間充質幹細胞，棄去原有培養液，用D-Hank』 s洗滌，加入適量0. 125%胰蛋白酶消化液 30s-lmin,觀察消化程度，及時用完全培養基終止消化，收集細胞，離心，棄上清，沉澱用完全培養基重新懸浮，按lX105/ml的細胞密度傳代接種，37°C、5% CO2、飽和溼度條件下培養，每隔3-5d換液、傳代一次，每日觀察細胞生長情況。更具體的hAMSCs的培養方法為⑴分離將羊膜組織用D-Hank』 s液反覆衝洗， 除盡殘留的血跡，刮出羊膜表面的血管、粘液，剪碎羊膜分裝於離心管內，加2. 5-3倍體積的0. 05 %胰蛋白酶-0. 02 % EDTA-2Na消化液，37 V消化IOmin，棄去消化液，再於37 V、 200rpm低速旋轉，繼續消化20min，經300目不鏽鋼網過濾，收集組織碎片於離心管內；繼續用同樣方法重複消化、過濾2次；消化後剩餘的羊膜組織用D-Hank』 s液衝洗，加入0. 75mg/ ml II型膠原酶-0. 075mg/ml Dnase I消化液，37°C、200rpm旋轉消化2h，至組織完全消化，經300目不鏽鋼網過濾，收集細胞濾液於離心管，1500r/min離心lOmin，棄上清；(2) 原代培養離心後的沉澱用完全培養基懸浮後，臺盼藍染色、計數，當細胞活力> 90%後， 按lX107cells/ml的細胞密度接種於培養瓶，37°C、5% CO2、飽和溼度條件下培養4 後換液，繼續培養5-7d，每3-4d換液-次，觀察細胞生長情況；(3)傳代培養待hAMSCs生長到 80% -90%融合後，棄去原有的培養液，用D-Hank』 s洗滌，加入適量0. 125%胰蛋白酶消化液30s-lmin，觀察消化程度，及時用完全培養基終止消化，收集細胞，1500r/min離心5min， 棄上清，沉澱用完全培養基重新懸浮，按lX105/ml的細胞密度傳代接種，37°C、5% CO2、飽和溼度條件下培養，每隔3-5d換液、傳代一次，每日觀察細胞生長情況。為了驗證本發明的可行性及效果，下面用具體實驗例進一步詳細說明。一、材料和方法1、材料1. 1人羊膜及臍帶血來源經知情同意後，無菌採集12例剖宮產足月分娩的胎盤， 孕婦及胎兒身體健康，愛滋病和B型肝炎陰性，收集同一個體的羊膜和臍帶血，採集後2小時內進入實驗程序。1. 2主要試劑本實驗所用主要試劑見表1，其它試劑均為國產或進口分析純。表1主要試劑
權利要求
1.一種完全培養基，其特徵在於它是按體積比向低糖-Dulbecco極限必須培養基溶液中加入3% -10%的人自體臍帶血血清配製而成。
2.根據權利要求1所述的完全培養基，其特徵在於所述低糖-Dulbecco極限必須培養基溶液這樣製備取低糖-Dulbecco極限必須培養基IOg溶於IOOOml超純水中，調pH值至7. 2-7. 4，過濾除菌，分裝，4°C保存，即可。
3.根據權利要求1所述的完全培養基，其特徵在於所述人自體臍帶血血清這樣製備 無菌條件下抽取臍帶血50-70ml，注入無菌玻璃瓶中，靜置於37°C培養箱池，待血凝塊完全析出後，無菌條件下，超淨臺中吸取析出的血清，移入新的無菌離心管內，4°C、1000g離心20min，收集上清15-20ml，56°C水浴滅活30min，0. 2 μ m濾器除菌後，血清分裝於5ml小瓶，-20°C保存、備用；同時進行培養，檢菌，無細菌生長即可。
4.一種人羊膜間充質幹細胞的培養方法，其特徵在於(1)分離將羊膜組織用 D-Hank' s液衝洗乾淨，剪碎，分裝於離心管內，用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA_2Na消化液重複消化、過濾3次，剩餘的羊膜組織用D-Hank』 s液衝洗，加入0. 75mg/ml II型膠原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液旋轉消化，至組織完全消化，過濾，收集細胞濾液，離心，棄上清；( 原代培養離心後的沉澱用完全培養基進行原代培養；(3)傳代培養待人羊膜間充質幹細胞生長到80% -90%融合後，再進行傳代培養。
5.按照權利要求4所述的人羊膜間充質幹細胞的培養方法，其特徵在於步驟(1)中用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA-2Na消化液消化的過程為先於37°C消化lOmin，棄去消化液；再於37°C、200rpm低速旋轉，繼續消化20min，經300目不鏽鋼網過濾，收集組織碎片於離心管內；同樣方法重複消化、過濾2次。
6.按照權利要求4所述的人羊膜間充質幹細胞的培養方法，其特徵在於步驟(1)中的旋轉消化條件為37°C、200rpm，消化時間為2h，經300目不鏽鋼網濾過，收集細胞濾液於離心管。
7.按照權利要求4所述的人羊膜間充質幹細胞的培養方法，其特徵在於步驟(2)所述原代培養過程為用含3% -10%人自體臍帶血血清的完全培養基懸浮細胞後計數，按 1 X 107cells/ml的細胞密度接種，37°C、5% CO2、飽和溼度條件下培養4 後換液，繼續培養 5-7d，每3-4d換液一次，觀察細胞生長情況。
8.按照權利要求4所述的人羊膜間充質幹細胞的培養方法，其特徵在於步驟(3)所述傳代培養過程為取對數生長期內，融合率80% -90%的人羊膜間充質幹細胞，棄去原有培養液，用D-Hank』 s洗滌，加入適量0. 125%胰蛋白酶消化液30s-lmin，觀察消化程度，及時用完全培養基終止消化，收集細胞，離心，棄上清，沉澱用完全培養基重新懸浮，按 IXlOVml的細胞密度傳代接種，37°C、5% CO2、飽和溼度條件下培養，每隔3_5d換液、傳代一次，每日觀察細胞生長情況。
9.按照權利要求4-8中任一項所述的人羊膜間充質幹細胞的培養方法，其特徵在於 (1)分離將羊膜組織用D-Hank』 s液反覆衝洗，除盡殘留的血跡，刮出羊膜表面的血管、粘液，剪碎羊膜分裝於離心管內，加2. 5-3倍體積的0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA-2Na消化液，370C消化lOmin，棄去消化液，再於37°C、200rpm低速旋轉，繼續消化20min，經300目不鏽鋼網過濾，收集組織碎片於離心管內；繼續用同樣方法重複消化、過濾2次；消化後剩餘的羊膜組織用D-Hank』 s液衝洗，加入0. 75mg/ml II型膠原酶_0. 075mg/ml Dnase I消化液，37°C、200rpm旋轉消化2h，至組織完全消化，經300目不鏽鋼網過濾，收集細胞濾液於離心管，1500r/min離心lOmin，棄上清；(2)原代培養離心後的沉澱用完全培養基懸浮後，臺盼藍染色、計數，當細胞活力> 90%後，按1 X 107cellS/ml的細胞密度接種於培養瓶，37°C、 5% CO2、飽和溼度條件下培養4 後換液，繼續培養5-7d，每3-4d換液一次，觀察細胞生長情況；(3)傳代培養待人羊膜間充質幹細胞生長到80% -90%融合後，棄去原有的培養液， 用D-Hank』 s洗滌，加入適量0. 125%胰蛋白酶消化液30s-lmin，觀察消化程度，及時用完全培養基終止消化，收集細胞，1500r/min離心5min，棄上清，沉澱用完全培養基重新懸浮，按 IXlOVml的細胞密度傳代接種，37°C、5% CO2、飽和溼度條件下培養，每隔3_5d換液、傳代一次，每日觀察細胞生長情況。
全文摘要
本發明公開了一種完全培養基及人羊膜間充質幹細胞(hAMSCs)的培養方法。完全培養基是按體積比向低糖-Dulbecco極限必須培養基溶液中加入3％-10％的人自體臍帶血血清配製而成；培養方法包括(1)分離；(2)原代培養；(3)傳代培養。本發明採用前述完全培養基用於hAMSCs培養的優點為迴避了使用胎牛血清的風險，且無需添加L-穀氨醯胺、非必需胺基酸、2-巰基乙醇和丙酮酸等，仍可保持hAMSCs較好的增殖特性和表型特徵及一些幹細胞多向分化潛能標誌基因和蛋白表達；傳代培養中hAMSCs貼壁的牢固程度明顯低於FBS培養條件，消化時間明顯縮短，減少了胰酶消化對細胞的損傷和細胞數量的損失。
文檔編號C12N5/0775GK102191218SQ201110080968
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月28日 優先權日2011年3月28日
發明者餘麗梅 申請人:遵義醫學院附屬醫院