對C型肝炎病毒具有感染抑制活性的抗體的製作方法
2023-10-05 09:43:49 5
本發明涉及對C型肝炎病毒具有感染抑制活性的抗體及其片段。
背景技術：
C型肝炎病毒(C型肝炎病毒，Hepatitis C virus，以下有時也記載為HCV)是被分類為黃病毒科C型肝炎病毒(Hepacivirus)屬的RNA病毒，作為非A非B肝炎(非甲非B肝炎)的主要原因病毒被鑑定(非專利文獻1)。
HCV主要通過輸血而感染，但目前已經確立了高靈敏度的HCV的檢測方法，因此通過輸血而導致的新的HCV感染病人驟降。另一方面，現在已經推定：包含未顯現出肝炎的病毒攜帶者在內的HCV持有者，在日本上升至200萬人以上、全世界上升至1億7000萬人以上。最大的原因在於：因HCV感染而導致的肝炎的慢性化率高達70～80%或藥物治療不能顯示充分的效果。由於HCV感染而引起的慢性肝炎、即丙型慢性肝炎，其後經過20幾年之中有可能進展至肝硬化、最終惡化至肝癌。已知病狀進行到肝硬化的丙型慢性肝炎病人可通過活體肝移植進行治療，但活體肝移植後約半數復發肝炎，現狀是沒有防止肝炎復發的對策(非專利文獻2)。
為了防止活體肝移植後的肝炎復發，期望開發以病毒的感染抑制或排除為目的的抗體藥物。作為HCV感染的最初過程的HCV與細胞表面結合，認為HCV包膜蛋白發揮作用，因此研究了製作針對HCV包膜蛋白的抗體。但是，C型肝炎病人的10%左右在血清中可見抗HCV包膜蛋白抗體，由於抗HCV包膜蛋白抗體的出現而使C型肝炎自然治癒者，佔其中的約10%(非專利文獻3)，因此認為由於抗HCV包膜蛋白抗體而治癒的病人只佔全部C型肝炎病人的僅1%左右。推測這是由於存在針對HCV包膜蛋白的抗體產生受到阻礙或抑制的機制(非專利文獻4)。另外，還研究了將從多個抗HCV抗體陽性丙型慢性肝炎病人的血漿獲得的免疫球蛋白混合而得的製劑。但是，明確了：來源於病人的抗HCV抗體混合製劑，自活體肝移植時給予的情形，也沒有抑制血漿中HCV量(非專利文獻5)。
另一方面，非專利文獻4中公開了：在哺乳動物中表達的、作為HCV的包膜蛋白之一的E2蛋白與存在於人細胞表面的CD81特異性結合。根據該實驗結果嘗試了從C型肝炎病人分離顯示抑制E2蛋白與CD81結合的NOB(Neutralisation of binding)活性的抗體。作為其代表性的例子，使用噬菌體展示法，自感染了基因型1a的HCV的丙型慢性肝炎病人的骨髓淋巴細胞製作抗體基因文庫，從中分離顯示NOB活性的抗體(專利文獻1)。並且，自感染了基因型1b的HCV的C型肝炎病人的末梢B細胞製作雜交瘤，從中分離顯示NOB活性的抗體(非專利文獻6、專利文獻2)。但是，還報導了：顯示NOB活性的抗體未必均抑制感染(非專利文獻7)。
另外，將抗HCV抗體用作抗體藥物時，由於病毒基因組突變有可能出現對於HCV感染抑制抗體的抑制活性獲得耐性的病毒突變株、即逃逸突變株。由於抗HCV抗體的給予而出現HCV的逃逸突變株在使用黑猩猩的實驗中得到了證實(非專利文獻8)。
在非專利文獻9中，暗示了對基因型2a的HCV具有感染抑制活性的抗HCV抗體抑制逃逸突變株的出現，實際上還公開了暗示逃逸突變株的出現的數據(專利文獻3)。另外，在專利文獻3中，這些抗體未顯示對基因型1b的HCV的感染抑制活性，另外，對公開的基因型1b的HCV的結合活性弱，因此認為這些抗體不具有對基因型1b的HCV的充分的感染抑制活性。並且，在專利文獻3中，關於這些抗體對基因型2a以外的基因型的HCV是否抑制逃逸突變株的出現仍未解明。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1：國際公開第2003/064473號；
專利文獻2：國際公開第2004/005316號；
專利文獻3：國際公開第2013/033319號；
非專利文獻
非專利文獻1：Choo等人、Science、1989年、第244卷、第359-362頁；
非專利文獻2：Gane等人、Liver Transplantation、2003年、第9卷、第s28-s34頁；
非專利文獻3：Matsuura等人、J. Virol.、1992年、第66卷、第1425-1431頁；
非專利文獻4：Gerlach等人、Gastroenterology、1999年、第117卷、第933-941頁；
非專利文獻5：Davis等人、Liver Transplantation、2005年、第11卷、第941-949頁；
非專利文獻6：Hadlock等人、J. Virol.、2000年、第74卷、第10407-10416頁；
非專利文獻7：Burioni等人、J. Virol.、2002年、第76卷、第11775-11779頁；
非專利文獻8：Morin等人、Plos Pathogens、2012年、第8卷、e1002895；
非專利文獻9：Keck等人、Plos Pathogens、2012年、第8卷、e1002653。
技術實現要素：
發明所要解決的課題
對不限於特定基因型的HCV的多個基因型的HCV具有感染抑制活性的抗HCV抗體，不僅對感染了多個基因型的HCV的病人具有效果，而且對象病人的適用範圍廣，因而作為藥物特別有用。因此，期望對多個基因型的HCV具有高的感染抑制活性的抗HCV抗體。並且，期望可強有力地抑制在幹擾素和病毒唑治療中難治性的基因型1b的HCV的感染的抗體。
另外，逃逸突變株的出現成為將抗HCV抗體作為藥物開發時的重大障礙。因此，期望難以誘導逃逸突變株的出現、顯示逃逸突變株出現抑制性的抗HCV抗體。
因此，本發明的目的在於提供抑制多個基因型的HCV的感染的抗HCV抗體。並且，本發明的另一目的在於提供顯示HCV的逃逸突變株出現抑制性的抗HCV抗體。
用於解決課題的手段
本發明人為了解決上述的課題而進行了深入的研究，結果發現了：對多個基因型的HCV具有高的感染抑制活性的抗HCV抗體，並且發現了：顯示逃逸突變株出現抑制性的抗HCV抗體。
即，本發明提供以下的內容。
(1) 抗C型肝炎病毒E2蛋白抗體或抗原結合性抗體片段，其具有C型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性。
(2) 上述(1)所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其顯示逃逸突變株出現抑制性。
(3) 上述(1)或(2)所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其中，上述抗體或抗原結合性抗體片段包含以下的(a)或(b)的重鏈可變區：
(a) 重鏈可變區，其包含：由SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列構成的CDR3；
(b) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列。
(4) 上述(3)所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其進一步包含輕鏈可變區。
(5) 上述(1)～(4)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其中，上述抗體或抗原結合性抗體片段包含以下的(c)～(f)的任一項的輕鏈可變區：
(c) 輕鏈可變區，其包含：由SEQ ID NO: 8所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列構成的CDR3；
(d) 輕鏈可變區，其包含：由SEQ ID NO: 23所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 24所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 25所示胺基酸序列構成的CDR3；
(e) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4所示胺基酸序列；
(f) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 22所示胺基酸序列。
(6) 抗體或抗原結合性抗體片段，其與上述(5)所述的抗體或抗原結合性抗體片段識別相同的立體結構表位。
(7) (1)所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其包含以下的(g)或(h)所述的重鏈可變區和以下的(i)或(j)所述的輕鏈可變區：
(g) 重鏈可變區，其包含：由SEQ ID NO: 15所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 16所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 17所示胺基酸序列構成的CDR3；
(h) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 12所示胺基酸序列；
(i) 輕鏈可變區，其包含：由SEQ ID NO: 18所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列構成的CDR3；
(j) 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 14所示胺基酸序列。
(8) 上述(1)～(7)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其中，上述抗體或抗原結合性抗體片段為IgG、Fab、Fab』、F(ab』)2、單鏈抗體、dsFv、(scFv)2、或單結構域抗體。
(9) 上述(1)～(8)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其中，上述抗體為人抗體或人源化抗體。
(10) 上述(1)～(9)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段，其中，上述抗體或抗原結合性抗體片段進行了化學修飾。
(11) 核酸，其編碼上述(1)～(9)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段。
(12) 編碼重鏈可變區的核酸，所述重鏈可變區包含：由SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列構成的CDR3。
(13) 載體，其包含上述(11)或(12)所述的核酸。
(14) 導入了上述(13)所述的載體的宿主細胞。
(15) 抗C型肝炎病毒E2蛋白抗體或抗原結合性抗體片段的製備方法，該方法包括：培養上述(14)所述的宿主細胞的步驟、和回收所表達的抗體或抗原結合性抗體片段的步驟。
(16) 藥物，其含有上述(1)～(10)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段作為有效成分。
(17) 上述(16)所述的藥物，其為C型肝炎的治療藥或預防藥。
(18) 上述(17)所述的藥物，其為用於在肝臟移植中使用的C型肝炎的預防藥。
(19) C型肝炎病毒檢測用試劑，其含有上述(1)～(10)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段。
(20) C型肝炎病毒感染的治療或預防方法，該方法包括：將上述(1)～(10)的任一項中所述的抗體或抗原結合性抗體片段給予對象者。
本說明書包含作為本申請的優先權主張基礎的日本國專利申請2014-058936號的全部公開內容。
發明效果
本發明的抗體或其抗原結合性片段對多個基因型的HCV具有HCV感染抑制活性。
附圖簡述
圖1是顯示編碼抗體噬菌體e2d066和抗體噬菌體e2d081所提呈的VH區的核苷酸序列(上段)及其VH區的胺基酸序列(下段)的圖。FR1、FR2、FR3和FR4為框架區。CDR1、CDR2和CDR3為互補決定區(Complementarity-determining region；CDR)。
圖2顯示編碼抗體噬菌體e2d066所提呈的VL區的核苷酸序列(上段)及其VL區的胺基酸序列(下段)。
圖3顯示編碼抗體噬菌體e2d073所提呈的VH區的核苷酸序列(上段)及其VH區的胺基酸序列(下段)。
圖4顯示編碼抗體噬菌體e2d073所提呈的VL區的核苷酸序列(上段)及其VL區的胺基酸序列(下段)。
圖5顯示編碼抗體噬菌體e2d081所提呈的VL區的核苷酸序列(上段)及其VL區的胺基酸序列(下段)。
圖6顯示本發明的IgG抗體對基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖7顯示本發明的scFv對基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖8顯示本發明的IgG抗體對基因型3a的HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖9顯示本發明的scFv對基因型3a的HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖10顯示本發明的IgG抗體對基因型1b的HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖11顯示本發明的scFv對基因型1b的HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖12顯示本發明的IgG抗體對基因型1a的HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖13顯示本發明的scFv對基因型1a的HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
圖14顯示本發明的IgG抗體對未變性E2蛋白(圖14A)和變性E2蛋白(圖14B)的結合性(表位分析)。作為E2蛋白，使用了TH E2-Fc蛋白。
圖15顯示本發明的IgG抗體對直鏈狀肽(由E2蛋白胺基酸序列內的12個胺基酸殘基構成)的結合性(表位分析)。圖15A：e2d066 IgG、圖15B：e2d073 IgG、圖15C：e2d081 IgG、圖15D：MBL-HCV1(IgG)。
圖16顯示其它抗體對與生物素化e2d066 IgG的E2蛋白(TH E2Fc蛋白)結合的競爭結合抑制作用(表位分析)。
圖17顯示其它抗體對與生物素化e2d066 IgG的E2蛋白(TH E2Fc蛋白)結合的競爭結合抑制作用(表位分析)。
圖18顯示本發明的抗體和其它抗體對基因型2a的J6CF株(圖18A)的E2蛋白、或基因型1b的TH株(圖18B)的E2蛋白的結合性。
圖19顯示基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)感染後通過e2d066 IgG處置的感染擴大抑制作用。
具體實施方式
本發明涉及抗C型肝炎病毒E2蛋白抗體或抗原結合性抗體片段，其對多個基因型的C型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性。
另外，本發明涉及抗C型肝炎病毒E2蛋白抗體或抗原結合性抗體片段，其對多個基因型的C型肝炎病毒(HCV)顯示感染抑制活性和逃逸突變株出現抑制性。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段優選對多個基因型的HCV顯示逃逸突變株出現抑制性。
通常，病毒的增殖在中和抗體的存在下暫時被抑制，但會再次進行增殖。也就是說，如此增殖而來的病毒針對其抗體具有中和抵抗性(neutralization-resistance)，將該病毒稱為逃逸突變株。該再次增殖在中和抗體的存在下引起病毒的包膜蛋白的突變，結果使中和抗體無法與包膜蛋白結合。還已知下述的抗體：即使在中和抗體存在下，在其抗體所結合的病毒的包膜蛋白中的表位也不引起突變，難以誘導逃逸突變株的出現。在本申請說明書中，將這樣的抗體定義為顯示「逃逸突變株出現抑制性」的抗體。本發明的抗體或抗原結合性片段，與以往的抗體相比，難以使病毒的包膜蛋白中的表位產生突變，難以誘導逃逸突變株的出現。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段，優選與立體結構表位結合，顯示逃逸突變株出現抑制性。
對於C型肝炎病毒(HCV)，10種病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)作為以該順序連接而成的1個前體蛋白(polyprotein，多聚蛋白)來翻譯，之後，利用細胞內和病毒的蛋白酶，由前體蛋白分別形成10種成熟的病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)。C型肝炎病毒(HCV)的實體是以病毒顆粒的形式存在。HCV的病毒顆粒(HCV顆粒)在由HCV的結構蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白)構成的病毒殼的內部含有HCV基因組。在本申請說明書中，C型肝炎病毒(HCV)與HCV顆粒以相同的含義使用。
在本申請說明書中，關於C型肝炎病毒(HCV)的病毒蛋白中的胺基酸殘基的位置(也稱胺基酸殘基編號或胺基酸編號)，以HCV的前體蛋白為基準，以將前體蛋白的N末端的胺基酸(起始甲硫氨酸)作為第1位時的編號表示。例如，基因型1b的TH株的E2蛋白是起始於第384位的胺基酸殘基而中止於第717位的胺基酸殘基。
立體結構表位(也稱為結構表位)與由一次結構上連續的胺基酸殘基構成的直鏈狀表位不同，是依存於由一次結構上離開的不連續性的胺基酸殘基構成的蛋白的高級結構的表位。構成立體結構表位的不連續性的胺基酸殘基也可部分地連續。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段識別立體結構表位，這可通過與利用還原劑和熱處理等而變性的E2蛋白的結合性消失或結合性降低來確認。
E2蛋白是參與與存在於宿主細胞表面的受體(HCV受體)結合的包膜蛋白，C型肝炎病毒(HCV)經由該HCV受體感染宿主細胞。報導了：CD81作為該HCV受體之一被鑑定，是HCV感染的必需因子之一(Akazawa等人、J. Virol.、2007年、第81卷、第5036-5045頁)。
抗體(完全抗體)是通常也被稱作免疫球蛋白(Ig)的蛋白，其結構是以包含2條重鏈(Ｈ鏈)和2條輕鏈(L鏈)的異源四聚體作為最小單元、該最小單元的1個或2個以上聚集而成的蛋白。代表性的是，各自的輕鏈通過1個的二硫共價鍵與重鏈連接，但各種免疫球蛋白同種型中重鏈間的二硫鍵的數目發生變動。各自的重鏈和輕鏈還可在鏈內具有二硫鍵。各自的重鏈具有重鏈可變區(以下、VH區)，其上連接有恆定區(IgG的情形，CH區：CH1、CH2、CH3)。各自的輕鏈具有輕鏈可變區(以下、VL區)，其上具有1個恆定區(以下、CL區)。CL區與重鏈的最初恆定區CH1並列，且VL區與VH區並列。抗體的可變區(Fv)具有：顯示被稱為互補決定區(以下、CDR)的特定可變性而對抗體賦予結合特異性的區。可變區除了CDR之外，還具有被稱為框架區(以下、FR)的相對性保守的部分。完全的重鏈和輕鏈的可變區分別包含通過3個CDR(CDR1、CDR2、CDR3)連接的4個FR(FR1、FR2、FR3、FR4)，從氨基末端到羧基末端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序配置。完全抗體例如可以是IgG、IgM、IgA。
本發明的抗C型肝炎病毒E2蛋白抗體(完全抗體)具有帶來C型肝炎病毒E2蛋白特異性結合性的重鏈可變區和輕鏈可變區、以及恆定區(CL、CH1和Fc)。
本發明的抗原結合性抗體片段是指，包含完全抗體的部分成分，對該抗體的C型肝炎病毒E2蛋白保持抗原結合性的蛋白。本發明的抗原結合性抗體片段對HCV保持感染抑制活性。通常，抗原結合性抗體片段與完全抗體(免疫球蛋白分子)相比分子量小，因此細胞浸透性優異，而且可以使用微生物進行生產，因此具有可以比較廉價地製備的優點。
作為抗原結合性抗體片段的例子，可舉出：Fab(由VH、VL、CL和CH1構成的抗體片段；通過將IgG抗體用木瓜蛋白酶進行處理而獲得)、F(ab)』2(在鉸鏈區中由二硫鍵交聯而得的2個Fab片段構成的抗體片段；通過將IgG抗體用胃蛋白酶進行處理而獲得)、Fab』、Fv、單鏈抗體(scFv等)、dsFv、(scFv)2、雙價抗體(Diabody)、微抗體(minibody)等，但不限於這些。單鏈抗體中包含scFv，scFv(single chain Fv)是指，代表性的是，作為可變區(Fv)的VH區與VL區通過接頭連接成單鏈而得的抗體。dsFv(二硫鍵穩定性抗體，disulfide-stabilized Fv)是指，經由用於穩定化而導入到框架區的鏈內二硫鍵將Fv的VH區與VL區連接而得的抗體。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段可以是例如化學性合成的(合成抗體)、利用基因重組技術製作的(重組抗體)、人抗體、人源化抗體、重鏈和輕鏈可變區經由接頭或導入的二硫鍵等連接而得的(單鏈抗體或雙價抗體等)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、嵌合抗體等。重組抗體是指，代表性的是，使用轉染了宿主細胞的重組表達載體而表達的抗體或抗原結合性抗體片段。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段可以是多克隆抗體，但優選單克隆抗體。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的一實施方式包含VH區，所述VH區包含具有SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列的CDR3。優選該VH區包含SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段可以是包含VH區、且不包含VL區的單結構域抗體(也稱為免疫球蛋白VH結構域片段(Immunoglobulin VH Domain Fragment))。這例如是僅由VH區構成的抗體片段。例如可舉出：包含VH區、且不包含VL區的單結構域抗體，例如僅由該VH區構成的抗體片段，所述VH區包含具有SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列的CDR3。
另外，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段可以是包含VH區、且包含VL區的抗體，所述VH區包含具有SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列的CDR3。VL區(輕鏈可變區)只要是對HCV的特異性結合性沒有實質性影響即可，沒有特別限定，可以是來源於任意抗體(優選來源於人抗體)的序列。
作為本發明的抗體或抗原結合性抗體片段所具有的VL區的優選例子，例如可舉出：包含具有 SEQ ID NO: 8所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的CDR3的VL區。作為該VL區，例如可舉出：包含SEQ ID NO: 4所示胺基酸序列的區。
作為上述VL區的另外的優選例子，還可舉出：包含由SEQ ID NO: 23所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 24所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 25所示胺基酸序列構成的CDR3的VL區。作為該VL區，例如還可舉出：包含SEQ ID NO: 22所示胺基酸序列的區。
作為本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的具體例子，可舉出包含下述的VH區和VL區的抗體或抗原結合性抗體片段，所述VH區包含SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列，所述VL區包含SEQ ID NO: 4所示胺基酸序列。作為本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的具體例子，可舉出包含下述的VH區和VL區的抗體或抗原結合性抗體片段，所述VH區包含SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列，所述VL區包含SEQ ID NO: 22所示胺基酸序列。
另外，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段可以是與上述的抗體或抗原結合性抗體片段識別相同立體結構表位的抗體或抗原結合性抗體片段。例如，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段也包括與包含下述的VH區和VL區的抗體或抗原結合性抗體片段識別相同立體結構表位的抗體或抗原結合性抗體片段：VH區包含具有SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列的CDR3 (優選包含SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的VH區)；VL區包含具有SEQ ID NO: 8所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的CDR3 (優選包含SEQ ID NO: 4所示胺基酸序列的VL區)，或，VL區包含由SEQ ID NO: 23所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 24所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 25所示胺基酸序列構成的CDR3 (優選包含SEQ ID NO: 22所示胺基酸序列的VL區)。
上述的本發明的抗體或抗原結合性抗體片段對多個基因型(優選包含基因型1a、1b、2a、和3a)的C型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性、顯示逃逸突變株出現抑制性。在優選的實施方式中，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段對2個以上的基因型、優選基因型1a、基因型1b、基因型2a和基因型3a的HCV具有高的感染抑制活性。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的另一實施方式可以包含下述的VH區和VL區，所述VH區包含具有SEQ ID NO: 15所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 16所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 17所示胺基酸序列的CDR3，所述VL區包含具有SEQ ID NO: 18所示胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列的CDR3。該VH區優選包含SEQ ID NO: 12所示胺基酸序列。該VL區優選包含SEQ ID NO: 14所示胺基酸序列。這些抗體對多個基因型的HCV具有高的感染抑制活性。作為這樣的本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的具體例子，可舉出包含下述的VH區和VL區的抗體或抗原結合性抗體片段，所述VH區包含SEQ ID NO: 12所示胺基酸序列，所述VL區包含SEQ ID NO: 14所示胺基酸序列。這樣的本發明的抗體或抗原結合性抗體片段對多個基因型(包含基因型1b和2a)的C型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性。
CDR是確定抗體的特異性的區。本發明的抗體和抗原結合性抗體片段所具有的CDR以外的區(例如，完全抗體的情形，重鏈和輕鏈的各FR和各恆定區)的胺基酸序列只要實質上不影響對HCV的特異性結合性即可，沒有特別限定，可以是來源於其它抗體的序列。在此，其它抗體也包含來源於人以外的生物的抗體，但從降低副作用的觀點出發優選來源於人的抗體。即，本發明的抗體和抗原結合性抗體片段，優選CDR以外的區包含來源於人抗體的對應胺基酸序列。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的CDR是來源於人抗體，因此構成本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的其它區只要是來源於人抗體即可，由於形成僅由來源於人抗體的胺基酸序列構成的抗體或抗原結合性抗體片段，所以更優選。本發明的抗體和抗原結合性抗體片段的輕鏈可具有包含SEQ ID NO: 38～40的任一項所示胺基酸序列的CL區(恆定區)。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段可以是免疫球蛋白分子的任意類別、例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY，或任意亞類、例如可以屬於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等的任一類別，但優選為IgG。本發明的抗體的輕鏈可以是λ鏈或κ鏈的任一種。
本發明的抗體可以是具有包含上述的重鏈可變區(VH區)的重鏈和包含上述的輕鏈可變區(VL區)的輕鏈、同時具有恆定區的完全抗體。作為完全抗體的本發明抗體的優選例子，可舉出：具有由SEQ ID NO: 26所示胺基酸序列構成的重鏈和由SEQ ID NO: 27所示胺基酸序列構成的輕鏈的抗體(與實施例中記載的e2d066 IgG對應)，具有由SEQ ID NO: 30所示胺基酸序列構成的重鏈和由SEQ ID NO: 31所示胺基酸序列構成的輕鏈的抗體(與實施例中記載的e2d081 IgG對應)，和具有由SEQ ID NO: 28所示胺基酸序列構成的重鏈和由SEQ ID NO: 29所示胺基酸序列構成的輕鏈的抗體(與實施例中記載的e2d073 IgG對應)。
另外，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段還包含與下述的抗體識別相同立體結構表位的抗體或抗原結合性抗體片段，所述抗體具有由SEQ ID NO: 26所示胺基酸序列構成的重鏈和由SEQ ID NO: 27所示胺基酸序列構成的輕鏈(與實施例中記載的e2d066 IgG對應)；或者，所述抗體具有由SEQ ID NO: 30所示胺基酸序列構成的重鏈和由SEQ ID NO: 31所示胺基酸序列構成的輕鏈(與實施例中記載的e2d081 IgG對應)。
本發明的抗原結合性抗體片段還優選為具有上述的重鏈可變區(VH區)和上述的輕鏈可變區(VL區)的單鏈抗體、例如為scFv。單鏈抗體也稱為一條鏈抗體，是指至少包含VH區和VL區(可以進一步包含CL區)、且它們連接成單鏈的抗體片段。關於scFv，代表性的是，構成Fv的VH區1個和VL區1個通過接頭連接而得的抗體。但是，在本說明書中，也將除了VH區和VL區之外、還包含CL區的抗體稱為scFv。作為本發明的scFv的具體例子，可舉出：包含VH區、接頭、以及VL區和CL區(VLCL區)的、由SEQ ID NO: 32所示胺基酸序列構成的抗體片段(與實施例中記載的e2d066 scFv對應)、由SEQ ID NO: 34所示胺基酸序列構成的抗體片段(與實施例中記載的e2d081 scFv對應)、和由SEQ ID NO: 33所示胺基酸序列構成的抗體片段(與實施例中記載的e2d073 scFv對應)。
本發明的抗體和抗原結合性抗體片段只要在人體內不具有免疫原性即可，可以包含不是來源於人的免疫球蛋白的胺基酸序列的序列(例如，人為地加入突變的序列)。本發明的抗體和抗原結合性抗體片段可以是例如對於上述記載的構成完全抗體的胺基酸序列，其FR或恆定區中的胺基酸被其它胺基酸取代而得的抗體和抗原結合性抗體片段。這樣的胺基酸的取代，優選為1～5個胺基酸、更優選為1個或2個胺基酸的取代。具有這樣的胺基酸取代的抗體優選與未取代抗體在功能上同等。因此，胺基酸取代優選為保守性胺基酸取代，這是電荷、側鏈、極性、芳香性等的性質類似的胺基酸間的取代。性質類似的胺基酸例如可分類為：鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性胺基酸(天冬氨酸、穀氨酸)、無電荷極性胺基酸(甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、無極性胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)、支鏈胺基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族胺基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸)等。通過將框架區內的胺基酸殘基取代成半胱氨酸的胺基酸取代而導入二硫鍵，由此可以製作穩定化的抗體和抗原結合性抗體片段(dsFv等)，這樣的抗體和抗原結合性抗體片段也包含在本發明的範圍內。在此，「在功能上同等」是指，具有胺基酸取代的抗體與取代前的抗體具有同樣的生物學或生化學活性、特別是具有HCV感染抑制活性。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段例如可利用下述的方法製作。
將編碼抗體或抗體片段的核酸(基因)插入1個或多個適當的載體，將其導入宿主細胞(例如，哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞等)，使用基因重組技術，使其產生本發明的抗體或抗原結合性抗體片段(P. J. Delves.、ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.、1997年、WILEY；P. Shepherd and C. Dean.、Monoclonal Antibodies.、2000年、OXFORD UNIVERSITY PRESS；J. W. Goding.、Monoclonal Antibodies: principles and practice.、1993年、ACADEMIC PRESS)。需要說明的是，編碼抗體或抗體片段的DNA，例如可以使用基因重組技術(Sambrook等人、Molecular Cloning A Laboratory Manual、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Press)或DNA合成機進行製作。
具體而言，例如，製作完全抗體時，可將編碼抗體可變區的DNA與編碼人IgG恆定區的DNA連接，並將其插入表達載體。或者，也可將編碼抗體可變區的DNA插入包含編碼抗體恆定區的DNA的表達載體。這些DNA優選在表達載體中的表達控制區例如增強子、啟動子的控制下插入。其次，用所得的表達載體轉化宿主細胞，將該細胞進行培養，由此可產生抗體。這些表達載體可以單獨或將2種以上組合使用。
將所得的DNA與編碼人抗體恆定區的DNA連接，接著插入到表達載體中，將其導入宿主細胞使之表達，由此可獲得完全抗體(參見歐州專利申請公開第EP239400號、國際公開第1996/02576號)。作為經由CDR而連接的人抗體的FR，可以選擇使用下述的FR：互補決定區不妨礙形成與下述實施例中記載的e2d066或e2d081的完全抗體同樣結構的抗原結合部位。另外，還可以取代成各種的來源於人抗體的FR(參見國際公開第1999/51743號)。
本發明的抗原結合性抗體片段也可以使用公知的方法、例如完全抗體的酶消化或基因重組技術來製作。本發明的抗原結合性抗體片段只要維持與抗原的結合活性，還可以與其它蛋白融合。例如，將包含VH的Ｈ鏈片段和包含VL的L鏈片段經由適當的接頭進行連接，使其在宿主細胞中表達、或者在培養細胞中使由各自的載體表達的Ｈ鏈蛋白和L鏈蛋白締合，由此可以製作scFv或Fab等的抗原結合性抗體片段。
例如，在噬菌體展示法中，通過用插入有VH和VL的噬菌粒轉化大腸桿菌，也可製作本發明的抗原結合性抗體片段。具體而言，使VH和VL分別通過PCR法擴增，將VL插入噬菌粒載體，並轉化大腸桿菌，進行VL陽性的噬菌粒的純化，其次，將VH插入VL陽性的噬菌粒，使其在大腸桿菌中表達，通過這樣的2步克隆法可以製作本發明的抗原結合性抗體片段。另外，使VH和VL分別通過PCR法擴增之後進行連接，將該連接物插入噬菌粒，利用該噬菌粒轉化大腸桿菌，通過這樣的VL-VH裝配法也可以製備本發明的抗原結合性抗體片段。
scFv的製備例如可如下進行。利用基因重組技術，向所分離的編碼VH和VL的各自的cDNA之間(或者，編碼VH和VLCL的各自的cDNA之間)插入編碼接頭的DNA，將編碼所得單鏈抗體的重組DNA插入表達載體，將其導入宿主細胞使之表達，由此可以製作scFv。
在本發明的scFv中，將VH區和VL區連接的接頭，只要不抑制連接於其兩端的VH和VL的表達、或者、VH和VL的結合即可，沒有特別限定。接頭肽的長度通常為1～100個胺基酸、優選為1～50個胺基酸、更優選為1～30個胺基酸、特別優選為12～18個胺基酸(例如15個胺基酸)。本發明中優選將由(GGGGS)3這樣的15個胺基酸構成的多肽(SEQ ID NO: 35)( Kim等人、Protein Engineering Design and Selection(蛋白質工程設計與選擇)、2007年、20(9)卷、第425-432頁)作為接頭使用(需要說明的是，G表示甘氨酸、S表示絲氨酸)。為了製備編碼可變區的DNA，例如，可利用PCR法由將設計成CDR與人抗體FR連接的核苷酸序列製作成末端部具有重疊的部分的數個寡核苷酸來合成。
在FR的選擇中，例如可以採用2個方法。第1個方法是：使用NEWM、REI等三維結構已經明確的人抗體框架的方法(Riechmann L.等人、Nature、1988年、第332卷、第323-327頁；Tempst, PR等人、Protein Engineering、1994年、第7卷、第1501-1507頁； Ellis JH.等人、J.Immunol.、1995年、第155卷、第925-937頁)。第2個方法是：用人抗體的FR選擇最通用的胺基酸的方法(Sato K.等人、Mol Immunol.、1994年、31卷、第371-381頁； Kobinger F.等人、Protein Engineering、1993年、6卷、第971-980頁； Kettleborough CA.等人、Protein Engineering、1991年、第4卷、第773-783頁)。本發明中還可以使用這些的任一種方法。
另外，作為用於製備與某多肽在功能上同樣的多肽的、本領域技術人員熟知的方法，已知有將突變導入多肽的方法。例如，只要是本領域技術人員，使用位點特異性誘變法(Hashimoto-Gotoh T.等人、Gene、1995年、第152卷、第271-275頁； Zoller MJ. and Smith M、Methods Enzymol.、1983年、第100卷、第468-500頁；Kramer W.等人、Nucleic Acids Res.、1984年、第12卷、第9441-9456頁；Kramer W.and Fritz HJ.、Methods Enzymol.、1987年、第154卷、第350-367頁；Kunkel TA.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1985年、第82卷、第488-492頁；Kunkel、Methods Enzymol.、1988年、第85卷、第2763-2766頁)等，通過向編碼本發明的抗體和抗原結合性抗體片段的規定核酸中導入適宜突變，即可製備與該抗體和抗原結合性抗體片段在功能上同樣的抗體和抗原結合性抗體片段。用於實施位點特異性誘變的試劑盒也有市售，可用於本發明的抗體和抗原結合性抗體片段的製作。
本發明的抗體和抗原結合性抗體片段可以是化學性修飾(化學修飾)的抗體和抗原結合性抗體片段。即，本發明的抗體和抗原結合性抗體片段包含經化學修飾的抗體和抗原結合性抗體片段。關於該化學修飾，只要本發明的抗體和抗原結合性抗體片段對於HCV可具有特異性結合性，就可以是任意的化學修飾，例如可以是功能上的修飾或標記。作為這樣的化學修飾，例如可舉出：糖基化、乙醯化、甲醯化、醯胺化、磷酸化、和PEG化(聚乙二醇)等。而且，關於化學修飾，例如還可以是通過螢光色素(FITC、羅丹明、Texas Red、Cy3、Cy5)、螢光蛋白(例如，PE、APC、GFP)、酶(例如，西洋辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或者生物素或(鏈黴)親和素進行的修飾。這些修飾可以使用該技術領域中公知的任意方法來進行。
本發明還提供編碼本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的核酸。例如，編碼本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的核酸可以是包含編碼SEQ ID NO: 1所示VH區的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO: 3所示VL區的核苷酸序列的核酸，可進一步包含編碼由SEQ ID NO: 38所示胺基酸序列構成的CL區的核苷酸序列。編碼本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的核酸還可以是包含編碼SEQ ID NO: 11所示VH區的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO: 13所示VL區的核苷酸序列的核酸，可進一步包含編碼由SEQ ID NO: 39所示胺基酸序列構成的CL區的核苷酸序列。編碼本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的核酸還可以是包含編碼SEQ ID NO: 1所示VH區的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO: 21所示VL區的核苷酸序列的核酸，可進一步包含編碼由SEQ ID NO: 40所示胺基酸序列構成的CL區的核苷酸序列。本發明還提供編碼下述的重鏈可變區的核酸，所述重鏈可變區包含由SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列構成的CDR1、由SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列構成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列構成的CDR3。本發明還提供包含編碼本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的核酸的載體、以及導入有該載體的宿主細胞。
宿主細胞是指載體所導入的對象細胞，例如可以是細菌細胞、哺乳動物細胞(人細胞等)、真菌細胞(酵母細胞等)、昆蟲細胞等。導入有載體的宿主細胞由於突然變異或環境的影響等，可成為與導入有載體的當初細胞顯示不完全相同的特性(表現型)的細胞，但這樣的細胞的後代也包含在該「宿主細胞」中。
本發明還提供抗C型肝炎病毒E2蛋白抗體或抗原結合性抗體片段抗體的製備方法，該方法包括：培養導入有載體的宿主細胞的步驟，所述載體包含編碼本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的核酸；以及，回收該培養中所表達的抗體或抗原結合性抗體片段抗體的步驟。更具體而言，可在誘導由該載體表達本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的條件下培養宿主細胞，從該培養物中回收目標抗體或抗原結合性抗體片段。所回收的抗體或抗原結合性抗體片段可利用公知的方法進行純化。
以下，作為本發明的抗體的製備方法的更具體的例子，雖然記載了人源化IgG抗體的製備方法，但與該方法同樣地進行也可獲取其它抗體。
用於人源化IgG抗體製備的表達用載體(人源化抗體表達用載體)是插入有編碼人抗體的重鏈恆定區和人抗體的輕鏈恆定區的基因的表達載體。該載體可通過將編碼人抗體的重鏈恆定區和人抗體的輕鏈恆定區的基因分別克隆到表達載體中而構建。
人抗體的恆定區可以是任意的人抗體的重鏈和輕鏈恆定區，例如可舉出：人抗體的重鏈的IgG1亞類的恆定區和人抗體的輕鏈的κ類別的恆定區等。編碼人抗體的重鏈和輕鏈恆定區的基因可以是包含外顯子和內含子的染色體DNA，還可以是cDNA。
作為為了製作人源化抗體表達用載體而使用的動物細胞用表達載體，只要是可插入編碼人抗體恆定區的基因且表達的載體，可以使用任意的表達載體。例如可舉出：pAGE 107(Cytotechnology、3、133(1990年))、pAGE103(J. Biochem.、101、1307(1987年))、pHSG274(Gene、27、223(1984年))、pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、78，1527(1981年))、pSG1βd2-4(Cytotechnology、4、173(1990年))等。作為在動物細胞用表達載體中使用的啟動子和增強子，可舉出：SV40的初期啟動子和增強子(J. Biochem.、101、1307(1987年))、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR(Biochem. Biophys. Res. Commun.、149、960(1987年))、免疫球蛋白重鏈的啟動子(Cell、41、479(1985年))和增強子(Cell、33、717(1983年))等。
人源化抗體表達用載體可以是抗體重鏈和輕鏈存在於各自載體上的型或存在於同一載體上的型(以下，記為串聯型)的任一種類型，但從構建人源化抗體表達用載體的容易程度、導入動物細胞的容易程度、在動物細胞內的抗體重鏈和輕鏈的表達量的平衡均衡等的角度考慮，優選串聯型的人源化抗體表達用載體(J. Immunol. Methods、167、271(1994年))。作為串聯型的人源化抗體表達用載體，可舉出：pKANTEX 93(Mol. Immunol.、37、1035(2000年))、pEE 18(Hybridoma(雜交瘤)、17、559(1998年))等。
構建的人源化抗體表達用載體可用於人型嵌合抗體和人型CDR移植抗體在動物細胞中的表達。
關於人源化抗體的穩定性生產，可通過將人源化抗體表達載體導入適當的動物細胞，來實現獲得穩定生產人型嵌合抗體和人型CDR移植抗體(以下，一併稱為人源化抗體)的轉化株。作為將人源化抗體表達載體導入動物細胞的方法，可舉出：電穿孔法(日本特開平2-257891；Cytotechnology、3, 133(1990年))等。作為導入人源化抗體表達載體的動物細胞，只要是可產生人源化抗體的動物細胞，就可以使用任意的細胞。具體而言，可舉出：作為小鼠骨髓瘤細胞的NSO細胞、SP2/0細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO/dhfr-細胞、CHO/DG44細胞、大鼠骨髓瘤YB2/0細胞、IR983F細胞、敘利亞倉鼠腎臟來源的BHK細胞、人骨髓瘤細胞的NAMALWA細胞等，優選可舉出：作為中國倉鼠卵巢細胞的CHO/DG 44細胞、大鼠骨髓瘤YB 2/0細胞等。
導入人源化抗體表達載體之後、穩定生產人源化抗體的轉化株，可按照日本特開平2-257891中公開的方法，利用包含G418硫酸鹽(以下，記為G418；Sigma-Aldrich)或嘌呤黴素(Sigma-Aldrich、P8833)等試藥的動物細胞培養用培養基進行選擇。作為動物細胞培養用培養基，可以使用RPMI 1640培養基(日水製藥)、GIT培養基(日本製藥)、EX-CELL302培養基(SAFC Biosciences)、IMDM培養基(Thermo Fisher Scientific)、雜交瘤-SFM培養基(Thermo Fisher Scientific)、EX-CELL CD CHO Fusion(NICHIREI BIOSCIENCE：14365C)、或向這些培養基中添加胎牛血清(以下，記為FCS)等的各種添加物而得的培養基等。通過將所得的轉化株在培養基中進行培養，可在培養上清中使人源化抗體生產並蓄積。培養上清中的人源化抗體的生產量和抗原結合活性可利用酶免疫抗體法(以下，記為ELISA法；Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter14、1998年；或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice、Academic Press Limited、1996年)等進行測定。另外，關於轉化株，可按照日本特開平2-257891中公開的方法，利用DHFR基因擴增體系等，使人源化抗體的生產量提高。
人源化抗體可由轉化株的培養上清使用蛋白A柱進行純化(Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Chapter8、1988年；或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited，1996年)。另外，在人源化抗體的純化中，除此之外，可以使用通常在蛋白的純化中採用的純化方法。例如，可以將凝膠過濾、離子交換層析和超濾等組合進行純化。所純化的人源化抗體的重鏈、輕鏈或抗體分子總體的分子量可利用聚丙烯醯胺凝膠電泳(以下，記為SDS-PAGE；Nature、227，680(1970年))或蛋白質印跡法(Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Chapter12、1988年；或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited，1996年)等進行測定。
以上，示例了將動物細胞作為宿主的抗體的製備方法，如上所述，在酵母、昆蟲細胞、植物細胞、或者非人動物個體或植物個體中也可利用與動物細胞同樣的方法製備抗體。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段對多個基因型的HCV具有高的感染抑制活性。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段優選對2個以上基因型的HCV、例如選自基因型1a、1b、2a、3a、4a、5a、和6a的2個以上基因型的HCV、特別是包含基因型1b和2a的2個以上基因型的HCV具有感染抑制活性。需要說明的是，作為基因型1a的HCV，有H77株、HCV-1株、HCV-H株、J1株等；作為基因型1b的HCV，有TH株、Con1株、HCV-J株、JT株、BK株等；作為基因型2a的HCV，有J6CF株、JFH-1株、JFH-2株、JCH-1株等；作為基因型3a的HCV，有S310株、E-b1株；作為基因型4a的HCV，有ED43；作為基因型5a的HCV，有EUH1480；作為基因型6a的HCV，有EUK2等。
本發明中，「HCV感染」是指，自HCV顆粒結合於宿主細胞的細胞表面時開始、到在宿主細胞內增殖之後、釋放到細胞外為止的過程。因此，本發明中，「HCV感染抑制活性」是指，通過阻礙或抑制HCV感染的上述一系列過程中的至少一個過程來阻止在體內或細胞群中的HCV感染進行的活性。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的HCV感染抑制活性優選為阻礙HCV結合於宿主細胞的細胞表面的病毒受體的途徑和/或阻礙HCV基因組侵入到宿主細胞內的途徑的活性。需要說明的是，「 HCV顆粒」是指，由HCV包膜蛋白和被該蛋白包裝的HCV基因組構成的HCV自身或HCV樣結構物。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的HCV感染抑制活性，例如可通過測定將具有培養細胞感染性的嵌合HCV顆粒感染HCV感受性細胞(例如，Huh-7細胞)時的抑制活性進行評價。具有培養細胞感染性的嵌合HCV顆粒的製作例如可如下進行：將作為某種基因型的HCV基因組的結構基因的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的編碼序列與在培養細胞內高效率地自主複製的基因型2a的HCV株JFH-1的結構基因重組，並導入培養細胞，對其進行培養，使HCV顆粒產生，由此進行製作。通過使用該嵌合HCV顆粒，可評價對各種基因型HCV的感染抑制活性。該基本技術例如記載於Wakita等人、Nature Medicine、2005年、第11卷、第91-796頁； Lindenbach等人、Science、2005年、第309卷、第623-626頁；Pietschmann等人、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2007年、第103卷、第7408-7413頁中。
關於HCV感染抑制活性的評價，具體而言，例如可通過下述的方法進行：在要評價HCV感染抑制活性的抗體的存在下和非存在下，培養HCV顆粒與HCV感受性細胞(例如，Huh-7細胞)的混合物、或者培養感染了HCV顆粒的HCV感染細胞，檢測釋放到所得培養物中的HCV基因組RNA或HCV顆粒。在此，關於檢測，通常可通過測定(例如，定量)培養物中的HCV基因組RNA或HCV顆粒的量來進行。此時，在培養物中不存在HCV基因組RNA和HCV顆粒、或者與抗體非存在下相比少時，可評價為該抗體對HCV具有感染抑制活性。
作為HCV感染抑制活性的評價方法，更具體而言，例如可舉出以下的方法。首先，將包含抗體的試樣與HCV顆粒混合，在37℃下使之反應1小時(混合樣本)。其次，向前一天在96孔板上以5×103個/孔培養的Huh-7細胞中添加50μL混合樣本，在37℃下培養2.5小時。除去培養液，用PBS清洗細胞後，再次加入新鮮培養基繼續培養。48小時後，除去培養液，用PBS清洗1次後，加入100μL ISOGEN(Nippon Gene)，由細胞製備RNA。定量RNA之後，通過定量RT-PCR測定HCV基因組RNA量。HCV基因組RNA通過定量RT-PCR的檢測可通過按照Takeuchi等人的方法(Gastroenterology、1999年、第116卷、第636-642頁)檢測HCV基因組RNA的5』非翻譯區的RNA來進行。由測定而得的HCV基因組RNA量可算出HCV感染抑制活性。
作為HCV感染抑制活性的評價方法，還可舉出以下的方法。將包含抗體的試樣與HCV顆粒混合，在室溫下使之反應30分鐘(混合樣本)。其次，向前一天在48孔板上以2×104個/孔培養的Huh-7細胞中添加100μL混合樣本，在37℃下培養3小時。除去培養液，用PBS清洗細胞後，再次加入新鮮培養基繼續培養。72小時培養後，除去培養液，用PBS清洗細胞後，添加100μL/孔Passive lysis buffer(PLB裂解液)(Promega)，製作細胞溶解液。使用Lumipulse G1200(Fujirebio Inc.、Ortho Clinical Diagnostics)定量所回收的細胞溶解液中所含的HCV核心蛋白。由測定而得的HCV核心蛋白的摩爾濃度可算出HCV感染抑制活性。
在一個實施方式中，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段顯示HCV的逃逸突變株出現抑制性。逃逸突變株是指，通過HCV的病毒基因組突變而對於感染抑制抗體的抑制活性獲得耐性的病毒突變株，逃逸突變株出現抑制性是指，使逃逸突變株出現的誘導率降低、或者不誘導逃逸突變株出現的性質。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段顯示逃逸突變株出現抑制性可如下進行評價：按照Meital等人的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2008年、第105卷、第19450-19455頁)，在評價對象的抗體存在下，使HCV顆粒感染細胞並進行培養之後，將所回收的培養上清和抗體再次混合，使其感染非感染細胞，重複進行操作，最後測定培養上清中所含的HCV的感染效價，由此進行評價(重複繼代感染的評價)。具體而言，例如，將各基因型的HCV與JFH-1的嵌合HCV顆粒和人抗HCV抗體進行混合，在37℃下使之反應1小時(混合樣本)。其次，向接種於12孔板的非感染Huh-7細胞中添加混合樣本，使其感染。感染3天後在6孔板中進行繼代，繼代後第3天和第6天回收培養上清。通過HCV的感染效價測定來確認所回收的培養上清中包含嵌合HCV顆粒，將確認感染效價後的回收的培養上清(在第3天或第6天所回收的培養上清)和抗體再次混合，使其重新感染非感染細胞，將該繼代感染重複8次(繼代感染的重複次數：總8次)。測定最後獲得的培養上清中所含的HCV的感染效價，可算出感染抑制濃度IC50。即使經過8次的重複繼代感染也沒有產生感染抑制濃度IC50的顯著増加、沒有產生感染抑制活性大幅度降低的情形(例如，感染抑制濃度IC50 1μg/mL以下)，可判斷為顯示逃逸突變株出現抑制性。
另外，在Meital等人的文獻(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2008年、第105卷、第19450-19455頁)中，通過上述的重複繼代感染評價AP33抗體的結果，顯示出：繼代感染重複3次時未出現逃逸突變株，但重複5次時出現了逃逸突變株。根據該結果認為：AP33抗體不是顯示逃逸突變株出現抑制性的抗體。另外，Keck等人的文獻(Plos Pathogens、2012年、第8卷、e1002653)記載了：通過上述的重複繼代感染評價的結果，顯示出：CBH-2抗體的情形，若繼代感染重複3次則出現了逃逸突變株，相對於此，HC-84.1抗體和HC-84.25抗體的情形，繼代感染分別重複4次和5次時，抑制逃逸突變體的出現，根據該結果認為：HC-84.1抗體和HC-84.25抗體是顯示逃逸突變株出現抑制性的抗體。但是，關於這些抗體，在國際公開第2013/033319號中報導了下述的數據：通過與上述的重複繼代感染的評價不同的評價方法，具體而言，病毒量和抗體處置濃度與Meital等人的方法不同，通過從感染抑制活性IC50值的濃度開始的方法來評價重複感染的條件時，在重複感染的過程中將病毒量維持在一定濃度所必要的抗體量増加(即IC50值升高)、即暗示逃逸突變株的出現(國際公開第2013/033319號)。因此，根據公知的信息，優選通過上述的重複繼代感染評價的結果、繼代感染重複4～5次仍抑制逃逸突變株的出現的情形，可判斷為顯示逃逸突變株出現抑制性。進一步優選通過上述的重複繼代感染評價的結果、繼代感染重複8次仍未出現逃逸突變體的情形，可判斷為顯示逃逸突變株出現抑制性。
對於逃逸突變株出現抑制性不存在(或低)的公知的抗HCV抗體，由於上述的繼代感染重複4～5次的過程中產生逃逸突變株，因此認為感染抑制活性大幅度降低。另外，逃逸突變株的出現可如下進行確認：分析上述的重複感染培養的期間或最後所得的培養上清中包含的HCV的核苷酸序列，確定所突變的胺基酸殘基，由此進行確認。
作為一個例子，與立體結構表位結合的本發明的抗體或抗原結合性抗體片段優選顯示逃逸突變株出現抑制性。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段與HCV的E2蛋白特異性結合。在一個實施方式中，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段，特別是特異性識別(結合)HCV的E2蛋白的結構表位(立體結構表位)。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段對多個基因型的HCV具有高的感染抑制活性，因此可用作藥物、特別是C型肝炎的治療藥或預防藥。本發明還提供含有本發明的抗體或抗原結合性抗體片段作為有效成分的藥物、特別是C型肝炎的治療藥或預防藥。
本發明的藥物可以是含有藥學上可接受的載體的藥物組合物。「藥學上可接受的載體」是指可在製劑的技術領域中常規使用的溶劑和/或添加劑。
藥學上可接受的溶劑例如可舉出：水、藥學上可接受的有機溶劑(例如，乙醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯類)。這些溶劑優選進行滅菌，根據需要，優選調整為與血液等滲。
另外，藥學上可接受的添加劑可舉出：膠原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧基甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性糊精、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯樹膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作為藥物添加物可接受的表面活性劑等。
關於藥學上可接受的添加劑，除此之外，根據需要，還可包含賦形劑、粘合劑、崩解劑、填充劑、乳化劑、流動添加調節劑、潤滑劑、矯味矯臭劑、助溶劑(可溶化劑)、助懸劑、稀釋劑、表面活性劑、穩定劑、吸收促進劑、增量劑、賦溼劑、保溼劑(例如，甘油、澱粉)、吸附劑、崩解抑制劑、包衣劑、著色劑、保存劑、抗氧化劑、香料、風味劑、甜味劑、緩衝劑等。
關於溶劑和添加劑，根據劑型可以單獨或適當組合使用。例如，作為注射用製劑使用時，可以使用將經純化的抗體溶解於溶劑(例如，生理鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液)中，向其中添加吸附防止劑(例如，Tween80、Tween20、明膠、人血清白蛋白)而得的製劑。或者，為了在使用前進行溶解而製成再構成的劑型，可以是凍幹製品。例如，為了進行凍幹可以使用賦形劑(例如，甘露醇、葡萄糖等的糖醇或糖類)。
本發明的藥物可以按照常規方法進行製劑化。關於製劑化，例如可以參見Remington’s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U. S. A.。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段或藥物可以通過口服給予、組織內給予(例如，皮下給予、肌肉內給予、靜脈內給予)、局部給予(例如，經皮給予)或經直腸給予來進行給予。劑型優選為適合於給予方法的形態。例如，組織內給予時，優選經由血流的注射，此時的劑型，代表性的是液體。
進行注射時，對注入部位沒有特別限定。例如可舉出：靜脈內、動脈內、肝臟內、肌肉內、關節內、骨髓內、髓腔內、心室內、經皮、皮下、皮內、腹腔內、鼻腔內、腸內或舌下等。優選為靜脈內注射或動脈內注射等血管內注射。這是由於：經由血流可使本發明的藥物直接到達全身，而且侵襲性比較低，給病人等的對象者帶來的負擔小。或者，還可注射到肝臟內或肝門靜脈。這是由於：可使本發明的藥物直接作用於HCV所處的部位。
將本發明的抗體或抗原結合性抗體片段或藥物給予對象者(病人等)時，優選每一給予單位中含有可發揮HCV感染抑制活性的有效量的本發明的抗體或抗原結合性抗體片段。「有效量」是指，有效成分發揮其功能所必要的量，即本發明中是指抑制HCV感染所必要的量，且是指對所給予的對象者幾乎或完全不產生有害副作用的量。該有效量可根據對象者(病人等)的信息、劑型和給予途徑等的各種條件而發生變化。「對象者(病人等)的信息」包含：疾病的進展程度或重症程度、全身的健康狀態、年齡、體重、性別、飲食生活、藥物敏感性、有無並用藥物、以及對治療的耐性等。本發明藥物的最終給予量和有效量，基於每個對象者的信息等，通過醫師的判斷進行確定。在獲得HCV感染抑制效果方面，有必要大量給予本發明藥物時，為了減輕對於對象者的負擔，還可分成數次進行給予。
將本發明的藥物給予對象者時，作為有效成分的本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的給予量，可在0.001mg～1000mg/次/每kg體重的範圍選擇。或者，每個對象者可以選擇0.01～100000mg/個體(body)的給予量，但不限於這些的給予量。另外，作為上述的給予時機，可在疾病的臨床症狀產生的前後進行給予。
作為具體的給予量的一個例子，例如，給予C型肝炎發病初期、不必並用其它藥物的成年男子(體重60kg)時，每日的上述藥物的有效量通常為1～2000mg、優選為1～1000mg、更優選為1～500mg的範圍。根據對象者的信息或給予途徑等，還可以給予不足上述範圍或超過上述範圍的用量。
對成為本發明的抗體或抗原結合性抗體片段或藥物的給予對象的對象者沒有限定，優選為人等的靈長類、家畜、寵物、實驗(試驗)動物等的哺乳動物，特別優選為人等的靈長類。對象者可以是罹患C型肝炎、或者可以是未罹患C型肝炎但有罹患C型肝炎風險的對象者。對象者可以是接受肝臟移植的慢性C型肝炎病人、或者可以是接受需要輸血的手術的病人。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段或藥物可對任意的C型肝炎有效，優選對慢性C型肝炎或急性重症C型肝炎有效，另外，對由各種基因型的HCV(例如1a、1b、2a、3a、4a、5a、或6a)、例如基因型1a、2a、3a或1b的HCV而引起的C型肝炎特別有效。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段或藥物還可以抑制HCV在曾經感染的活體內的細胞水平的感染擴大(HCV向其它細胞的傳播)。因此，本發明還涉及C型肝炎病毒感染的治療或預防方法，該方法包括：將本發明的抗體或抗原結合性抗體片段或藥物給予對象者。
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段或藥物可以適合用作用於在肝臟移植中使用的C型肝炎的預防藥。例如，為了預防慢性C型肝炎病人在活體肝移植時復發C型肝炎，優選在肝臟移植前、肝臟移植中或肝臟移植後給予。
為了補充或增強本發明藥物的治療或預防效果、或者降低給予量，還可以將本發明藥物與其它藥物適量混合使用或並用使用。作為並用的藥物，可舉出：現有的抗病毒劑，例如幹擾素、病毒唑等。
另外，本發明的抗體或抗原結合性抗體片段還可以用作用於試樣中的HCV檢測的、HCV檢測用試劑。本發明還涉及使用了本發明的抗體或抗原結合性抗體片段的、試樣中的HCV的檢測方法。
試樣是指，可包含HCV(HCV顆粒或其包膜蛋白)的各種試樣。例如為：培養細胞、培養細胞破碎液、培養液上清、或來自對象者的試樣、例如人試樣。人試樣是指，採自人的組織(例如，術後採取的組織)、或血液、血清、血漿、尿、骨髓液、唾液、淋巴液、精液等的體液等所有的來自人的活體試樣，優選為血液、血清、血漿或尿。另外，不僅可以是液體試樣，也可以是固體試樣。例如，也可以是器官移植的捐獻者器官、或組織切片標本等。
HCV的檢測可以通過ELISA法、EIA法、螢光免疫測定法、放射免疫測定法、或發光免疫測定法等的使用標記抗體的公知的免疫學檢測方法、表面等離子體共振法(SPR法)或石英晶體微量天平測定法(Quartz Crystal Microbalance, QCM法)進行實施，但優選通過使用標記抗體的免疫學檢測方法進行實施。
ELISA法也稱為酶聯免疫吸附測定法，是指下述的方法：對於試樣中所含的微量的靶抗原，使用酶標記的抗體或抗原，利用該酶的作用，以顯色濃度或螢光強度的形式檢測抗原抗體反應，來定量靶抗原。例如，是指下述的方法：將本發明的抗體或抗原結合性抗體片段固定於固相載體，酶性檢測該抗體等與試樣中的HCV的免疫學反應。關於ELISA法的測定方法，請參見公知的方法(石川榮治等人編「酶聯免疫測定法」、1987年、第3版、醫學書院等)。作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、膠乳、明膠、瓊脂糖、纖維素、瓊脂糖凝膠、玻璃、金屬、陶瓷或磁性體等材質構成的珠、小平板(microplate)、試驗管、棒或試驗片等形狀的不溶性載體。本發明的抗體或抗原結合性抗體片段固定於固相載體，可以按照物理吸附法、化學結合法或這些並用的方法等公知的方法，使之結合來實現。
作為將本發明的抗體或抗原結合性抗體片段標記的標記物質，例如，ELISA法的情形，可以使用過氧化物酶(POD)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶、澱粉酶或生物素-親和素複合物等；螢光免疫測定法的情形，可以使用異硫氰酸螢光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、取代異硫氰酸羅丹明、二氯三嗪異硫氰酸酯、Alexa 480或Alexa Fluor 488等；而且，放射免疫測定法的情形，可以使用氚、碘125(125I)或碘131(131I)等，但不限於這些。另外，發光免疫測定法可以使用NADH-FMNH2-螢光素酶類、魯米諾-過氧化氫-POD類、吖啶酯類或二氧雜環丁烷化合物類等。關於標記抗原與抗體的結合法，ELISA法的情形，可以使用戊二醛法、馬來醯亞胺法、二硫吡啶法或過碘酸法等公知的方法；放射免疫測定法的情形，可以使用氯胺T法、Bolton-Hunter法等公知的方法。
另外，上述的免疫學測定方法還可以如下實施：將免疫比濁法、膠乳凝集反應、膠乳比濁法、紅細胞凝集反應或顆粒凝集反應等的免疫複合物凝集物的生成，通過光學方法測定其透射光或散射光，或者通過目視測定的測定法來實施。此時，可以使用磷酸緩衝液、甘氨酸緩衝液、Tris緩衝液、或Good緩衝液等作為溶劑，並且可包含聚乙二醇等的反應促進劑或非特異性反應抑制劑。
作為HCV檢測方法的具體例子，對於適用於ELISA夾心法的情形，下面列舉例子簡單地說明。首先，將本發明的抗體固定於不溶性的載體。需要說明的是，待固定的抗體只要是可特異性地識別HCV即可，可以是1種也可以是多種。其次，使可能含有HCV的試樣作用於固定抗體的表面，使固定抗體與HCV的複合物在載體的表面形成。之後，通過使用清洗液進行充分清洗，存在於試樣中的HCV以外的未結合物質被除去。並且，製作特異性地識別HCV的其它抗HCV標記體，使該標記抗體與結合有固定抗體與HCV的複合物的載體作用，使用清洗液充分清洗之後，通過利用標記進行檢測，可以檢測存在於試樣中的HCV。
另外，還可以預先將包含標記抗體和HCV的試樣混合形成抗原抗體複合物之後，使之作用於固定抗體。只要將待固定的抗體進行生物素標記，則將生物素化固定抗體、包含HCV的試樣、實施了生物素以外的標記的抗體全部混合形成抗原抗體複合物之後，使之作用於固定有親和素的載體，就可以利用生物素化以外的標記來檢測抗原抗體複合物。
並且，上述的免疫學測定方法還可以使用免疫層析用試驗片(test strip)。免疫層析用試驗片例如由下述的部構成：由容易吸收試樣的材料構成的試樣容納部、含有本發明診斷藥的試劑部、試樣與診斷藥的反應物所移動的展開部、將已展開的反應物呈色的標記部、已呈色的反應物所展開的提呈部等。市售的妊娠診斷藥等與其具有同樣的形態。本測定方法的原理如下。首先，若將試樣供給到試樣容納部，則試樣容納部吸收試樣、使試樣到達試劑部。接著，在試劑部中試樣中的HCV與抗體進行抗原抗體反應，反應複合物在展開部移動進而到達標記部。在標記部中，產生上述反應複合物與標記二次抗體的反應，若與其標記二次抗體的反應物展開到提呈部，則可確認到呈色。上述免疫層析用試驗片的侵襲性極低，完全不會給使用者帶來痛苦或試劑使用的危險性，因此可用於家庭中的監控器，針對其結果，在各醫療機構水平進行精密檢查並治療(外科的切除等)，可有利於預防轉移、復發。另外，這樣的試驗片可廉價地大量生產，從該角度考慮也是便利的。
實施例
以下，列舉實施例，更具體地說明本發明。
(實施例1) 抗體噬菌體文庫的篩選
在以下的人抗HCV抗體的篩選中，使用了記載於下述文獻中的一般的噬菌體展示法：Chan等人、J. Gen. Virol、1996年、第77卷、第2531-2539頁；Bugli等人、J. Virol、2001年、第75卷、第9986-9990頁；以及Jostock等人、J. Immunol. Methods、2004年、第289卷、第65-80頁。
1. 抗體噬菌體文庫的製作
以下所記載的抗體噬菌體文庫的製作按照Gejima等人、Human antibodies、(2002)、第11卷、第121-129頁中充分記載的方法來進行。
自人慢性C型肝炎病人分離編碼抗體基因的mRNA，利用RT-PCR合成了cDNA。利用PCR法由cDNA分別擴增了VH區基因和VLCL區基因(VL區基因和CL區基因)。將所擴增的VH區基因和VLCL區基因插入到包含編碼有(GGGGS)3(SEQ ID NO: 35)等的接頭肽序列的接頭DNA的噬菌粒載體pTZ19R中，按照VH區基因、接頭、VL區基因、CL區基因的順序製備了scFv基因。將所製備的scFv基因利用限制酶位點HindIII插入到噬菌粒載體pTZ19R中，構建了scFv基因文庫。將該scFv基因文庫轉化到TG-1(SupF)等的大腸桿菌中之後，使輔助噬菌體M13K07再感染，製備了scFv噬菌體文庫。所製作的抗體噬菌體是提呈將人抗體的VH區和VLCL區用接頭連接而成的肽的噬菌體。
2. 用於篩選的HCV的E2蛋白的製作
用於篩選的HCV的E2蛋白的製備使用Drosophila Expression System(果蠅表達系統)(Thermo Fisher Scientific)來進行。該方法充分記載於Krey等人、PLOS PATHOGENS、第6卷、e1000762中。
分別使用S2細胞表達載體pMT/BiP/V5-His(Thermo Fisher Scientific)的限制酶位點BglII和XbaI，插入了HCV的TH株(基因型1b、Wakita,T.等人、J. Biol. Chem.、1994年、第269卷、第14205-14210頁、國際公開第2006/022422號)的編碼E2蛋白(胺基酸編號384-711；不含跨膜區)的DNA或JFH-1株(基因型2a、國際公開第2004/104198號)的編碼E2蛋白(胺基酸編號384-714；不含跨膜區)的DNA。
轉染通過磷酸鈣沉澱法來進行。如下製作了轉染用溶液。利用HCV的E2蛋白編碼基因將重組有插入片段的pMT/BiP/V5-His(19μg)、選擇用質粒載體pCoHygro(1μg)、2M CaCl2(36μL)混合，用純淨水定容至300μL。將該混合溶液緩慢滴加到HEPES-Buffered Saline(HEPES緩衝鹽水(HBS)；50mmol/L HEPES、1.5mmol/L Na2HPO4、280mmol/L NaCl、pH7.1)中，邊溫和地渦旋邊充分混合，製作了轉染用溶液。
向6孔板中接種2mL的1×106細胞/mL的S2細胞，在28℃下培養12小時左右，使達到2～4×106細胞/mL。將上述的轉染用溶液在室溫下靜置30分鐘之後，向接種有S2細胞的6孔板中沒有遺漏地均等地滴加，之後在28℃下培養了24小時。24小時後，交換培養基(Shneider's Drosophila Medium(施耐德的果蠅培養基)、10%FBS、青黴素(50units/mL)、鏈黴素(50μg/mL)、300μg/mL潮黴素B)，每3～4天邊交換培養基邊進行了繼代培養。進行約3周選擇培養，以此作為穩定細胞株。
E2蛋白的表達誘導如下進行：向2×106個的S2細胞(每1個225cm2長頸瓶，40mL)中加入CuSO4 (最終濃度0.5mmol/L)，培養5天。回收培養液，通過離心(2000rpm、5分鐘)除去細胞，獲得了培養上清。將培養上清使用His標籤蛋白純化用層析載體(Ni-NTA agarose)進行純化，獲得了HCV的TH株(基因型1b)的E2蛋白或HCV的JFH-1株(基因型2a)的E2蛋白。
3. 與HCV的E2蛋白結合的抗體噬菌體的篩選
以下所記載的抗體噬菌體的篩選基於下述文獻中充分記載的方法來進行：Gejima等人、Human antibodies、(2002)、第11卷、第121-129頁。
使上述2. 項目中製作的HCV的E2蛋白(TH株(基因型1b)的E2蛋白或JFH-1株(基因型2a)的E2蛋白)與免疫管等的塑料表面或磁珠表面結合，添加上述1.項目中製作的scFv噬菌體文庫進行反應之後，用含有0.1%Tween20的PBS進行清洗，去除了非特異性的噬菌體。特異性結合的噬菌體用0.1mol/L甘氨酸-HCl(pH2.2)洗脫，使其感染大腸桿菌進行了擴增。通過將該操作重複3次，濃縮並獲取了HCV E2蛋白(TH株(基因型1b)的E2蛋白或JFH-1株(基因型2a)的E2蛋白)特異性的噬菌體。
4. 所選拔的抗體噬菌體的可變區
利用常規方法分析了上述3. 項目中選拔的3種抗體噬菌體(e2d066、e2d073、和e2d081)所提呈的肽中的VH區和VL區的核苷酸序列。另外，對於CL區的核苷酸序列，也利用常規方法進行了分析。
(1) 抗體噬菌體e2d066
對於抗體噬菌體e2d066所提呈的VH區和VL區，編碼VH區的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 1、其胺基酸序列示於SEQ ID NO: 2(圖1)，編碼VL區的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 3、其胺基酸序列示於SEQ ID NO: 4(圖2)。另外，對於抗體噬菌體e2d066所提呈的VH區和VL區，VH區的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7，VL區的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10。另外，CL區的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 38。
(2) 抗體噬菌體e2d073
對於抗體噬菌體e2d073所提呈的VH區和VL區，編碼VH區的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 11、其胺基酸序列示於SEQ ID NO: 12(圖3)，編碼VL區的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 13、其胺基酸序列示於SEQ ID NO: 14(圖4)。另外，對於抗體噬菌體e2d073所提呈的VH區和VL區，VH區的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17，VL區的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20。另外，CL區的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 39。
(3) 抗體噬菌體e2d081
編碼抗體噬菌體e2d081所提呈的VH區的核苷酸序列與編碼抗體噬菌體e2d066所提呈的VH區的核苷酸序列相同。即，編碼抗體噬菌體e2d081所提呈的VH區的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 1、其胺基酸序列示於SEQ ID NO: 2(圖1)，VH區的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7。另外，編碼抗體噬菌體e2d081所提呈的VL區的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 21、其胺基酸序列示於SEQ ID NO: 22(圖5)，VL區的CDR1、CDR2、CDR3分別示於SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25。另外，CL區的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 40。
在圖1～5中，顯示編碼VH區或VL區的核苷酸序列(上段)及其胺基酸序列(下段)、與VH區或VL區的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的對應。需要說明的是，圖1顯示抗體噬菌體e2d066和抗體噬菌體e2d081所提呈的VH區、圖2顯示抗體噬菌體e2d066所提呈的VL區、圖3顯示抗體噬菌體e2d073所提呈的VH區、圖4顯示抗體噬菌體e2d073所提呈的VL區、圖5顯示抗體噬菌體e2d081所提呈的VL區。
另外，在表1中，顯示抗體噬菌體(e2d066、e2d073、e2d081)所提呈的CDR。
[表1]
(實施例2) scFv的製作
根據所選拔的3種抗體噬菌體(e2d066、e2d073和e2d081)的VH區、以及VL區和CL區(VLCL區)的核苷酸序列和胺基酸序列，利用常規方法製作了將各自的VH區和VLCL區用接頭連接而成的scFv。作為接頭，使用(GGGGS)3(SEQ ID NO: 35)，利用常規方法將接頭與VH區的C末端和VL區的N末端連接。將包含e2d066的VH區(SEQ ID NO: 2)、VL區(SEQ ID NO: 4)和CL區(SEQ ID NO: 38)(VLCL區)以及接頭(SEQ ID NO: 35)的scFv(稱為e2d066 scFv)的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 32。將包含e2d073的VH區(SEQ ID NO: 12)、VL區(SEQ ID NO: 14)和CL(SEQ ID NO: 39)(VLCL區)以及接頭(SEQ ID NO: 35)的scFv(稱為e2d073 scFv)的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 33。將包含e2d081的VH區(SEQ ID NO: 2)、VL區(SEQ ID NO: 22)和CL區(SEQ ID NO: 40)(VLCL區)以及接頭(SEQ ID NO: 35)的scFv(稱為e2d081 scFv)的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 34。
具體而言，將這些噬菌粒DNA(所選拔的抗體噬菌體)用限制酶SalI消化後，使之自身再結合而變換成蛋白A融合型抗體(scFv-PP型抗體)，使用所得抗體轉化了大腸桿菌DH12STM。轉化後，用25mL的2×YTGA在30℃下進行了過夜培養。將10mL的該培養液與1L的2×YTA混合，培養3小時之後，加入1mL的1mol/L IPTG，在30℃下培養了20小時。將培養液供於4℃、8000rpm、10分鐘的離心處理，回收了上清。向所回收的上清中緩慢加入313g的硫酸銨，在室溫下攪拌30分鐘之後，供於4℃、8500rpm、30分鐘的離心處理。將沉澱物懸浮於加入有20mL的Complete蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的PBS中。接著，相對於PBS在4℃下過夜透析後，供於4℃、10000rpm、10分鐘的離心處理。回收上清，將其添加到填充有2mL的IgG瓊脂糖凝膠(GE Healthcare)的柱中，在室溫下採用自然滴加使其通過柱內。用300mL的PBS清洗柱之後，用8mL的0.2mol/L甘氨酸(pH3.0)進行了洗脫。用2mol/L Tris將洗脫液的pH值調整為7.0之後，裝入透析濃縮用管(Millipore、Amicon Ultra-15、4℃、4500rpm轉)中，相對於PBS進行了透析、濃縮。之後，進行SDS-PAGE，算出了蛋白濃度。
(實施例3) IgG抗體的製作
根據所選拔的3種抗體噬菌體(e2d066、e2d073和e2d081)的VH區和VL區的核苷酸序列和胺基酸序列，利用常規方法製作了包含VH區和VL區的IgG抗體。
具體而言，以scFv抗體的VH和VLCL基因為模板，使用Ｈ鏈和L鏈擴增用引物，進行了PCR。VH的擴增產物預先與包含人IgG1恆定區的構建載體連接、VLCL預先與L鏈用構建載體連接，將它們進行連接獲得了包含IgG型抗體基因的質粒DNA。
將該質粒DNA用限制酶消化，進行線性化，將經線性化的質粒40μg在250V・800μF的條件下通過電穿孔導入到細胞數1×107的CHO-K1細胞。導入後立即懸浮於包含10%FBS的Ham-F12培養基(和光純藥工業：087-08335＋MBL268-1)中，在37℃、5%CO2培養箱開始了培養。
24小時後，添加嘌呤黴素(Sigma-Aldrich、P8833)使最終濃度為10μg/mL，開始了選擇。自約10天到14天後確認所選擇的集落，將細胞用20mL的PBS清洗，用1mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA(和光純藥工業：264-16935)處理後，加入5mL的Ham-F12，自板剝離、回收，測定了細胞數。根據其結果，在0.2細胞/200μL/孔(96孔板5塊)的條件下進行了有限稀釋。14天培養後，通過使用了各孔的培養上清的ELISA，選擇了高表達IgG型抗體的細胞。將所選擇的細胞馴化於無血清培養基EX-CELL CD CHO Fusion(NICHIREI BIOSCIENCE：14365C)，按照初期細胞數2×105培養10天，回收了上清。
將1mL的rProteinA Sepharose Fast Flow(GE Healthcare：17-1279-02)填充到柱中，添加培養上清，以流速1滴/2秒進行送液，使表達蛋白(IgG)與柱結合。將10mL的PBS以流速1滴/2秒進行送液，清洗非吸附成分後，將10mL的洗脫緩衝液(0.2mol/L甘氨酸、pH3)以流速1滴/秒進行送液，回收了洗脫液。利用Amicon Ultra-15離心式過濾裝置10(Millipore：UFC901096)，通過離心超濾濃縮至1mL，同時進行溶液置換(PBS)，通過SDS-PAGE算出了抗體蛋白的濃度。
將所得的包含e2d066的VH區(SEQ ID NO: 2)和VL區(SEQ ID NO: 4)的IgG抗體(稱為e2d066 IgG)的重鏈全長的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 26，輕鏈全長的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 27。將所得的包含e2d073的VH區(SEQ ID NO: 12)和VL區(SEQ ID NO: 14)的IgG抗體(稱為e2d073 IgG)的重鏈全長的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 28，輕鏈全長的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 29。將所得的包含e2d081的VH區(SEQ ID NO: 2)和VL區(SEQ ID NO: 22)的IgG抗體(稱為e2d081 IgG)的重鏈全長的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 30，輕鏈全長的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 31。
(實施例4) scFv和IgG抗體的感染抑制活性
1. 各基因型嵌合HCV顆粒(HCVcc)的製作
(1) J6/JFH-1嵌合HCV顆粒(J6/JFH-1 HCVcc)的產生
J6/JFH-1嵌合HCV顆粒(J6/JFH-1 HCVcc)按照國際公開第2011/052735號中記載的方法如下進行了製作。
按照Wakita, T等人、Nat. Med.、2005年、第11卷、第791-796頁和國際公開第2004/104198號中記載的方法，製作了將HCV JFH-1株(基因型2a)的基因組RNA全區進行逆轉錄而獲得的cDNA(基因組cDNA)克隆到pUC19質粒的T7 RNA啟動子序列的下遊而得的質粒DNA(pJFH-1)。將該pJFH-1用EcoRI消化後，進一步用BclI部分消化，製備將自EcoRI部位到最初BclI部位的片段(約2840bp)切除而得的質粒DNA片段，且對其進行了純化。
另一方面，按照國際公開第2006/022422號中記載的方法，製作了將HCV J6CF株(基因型2a)的基因組cDNA(GenBank 登錄號AF177036； Yanagi, M.等人、Virology、1999年、第262卷、第250-263頁)克隆到pUC19質粒的T7 RNA啟動子序列的下遊而得的質粒DNA(pJ6CF)。將該pJ6CF用EcoRI和BclI部分消化，將所得的約2840bp片段純化，將其與切除了上述EcoRI-BclI的pJFH-1片段連接，獲得了重組質粒DNA(pJ6/JFH-1)。克隆到該pJ6/JFH-1中的DNA是：將J6CF株基因組cDNA的5』非翻譯區、編碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的各蛋白的序列、編碼NS2蛋白的自N末端到第16位的胺基酸殘基為止的區的序列、以及JFH-1株基因組cDNA的編碼NS2蛋白的自第17位的胺基酸殘基到C末端為止的區的序列、編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列、和3』非翻譯區按照該順序連接而得的HCV嵌合基因組cDNA。
將所製作的pJ6/JFH-1用XbaI切斷之後，加入綠豆核酸酶20U(總反應液量為50μL)，通過在30℃下溫育30分鐘，將XbaI切斷末端平滑化之後，進行了苯酚/氯仿萃取和乙醇沉澱。以該切斷的質粒為模板，使用MEGAscript T7試劑盒(Thermo Fisher Scientific)合成了RNA(參見國際公開第2006/022422號)。將如此合成的、J6/JFH-1嵌合基因組RNA用於以下的細胞導入。將3×106個的Huh-7細胞和5μg的J6/JFH-1嵌合基因組RNA懸浮於Cytomix溶液(120mmol/L KCl、0.15mmol/L CaCl2、10mmol/L K2HPO4/KH2PO4、25mmol/L HEPES、2mmol/L EGTA、5mmol/L MgCl2、20mmol/L ATP、50mmol/L穀胱甘肽；400μL)中，轉移到4mm杯(Cuvette)中之後，使用Gene Pulser(BioRad Laboratories)，在260Ｖ、950μF下，進行了J6/JFH-1嵌合基因組RNA對Huh-7細胞的電穿孔。之後，將導入有基因組RNA的Huh-7細胞接種於直徑10cm的培養皿，進行了繼代培養。在繼代時，使用HCV抗原ELISA檢測試劑盒(Ortho Clinical Diagnostics)，定量培養上清中所含的HCV的核心蛋白，進行了HCV顆粒產生的確認。選擇核心蛋白的量多的、即HCV顆粒產生的活性高的培養上清，以J6/JFH-1嵌合HCV顆粒的病毒原液(J6/JFH-1病毒原液)的形式進行了保存。
向利用10%FCS-DMEM培養基(包含1%MEM非必需胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)進行培養的直徑10cm的培養皿中的Huh-7細胞中加入100μL左右的上述獲得的J6/JFH-1病毒原液(4×104ffu/mL(集落形成單位/mL(focus forming units/mL)))，使HCV顆粒感染Huh-7細胞。進行適宜的繼代使細胞不匯合，由1個225cm2長頸瓶擴大培養為4個、12個。其次，自其中的8個225cm2長頸瓶剝離細胞，接種於CellSTACK(商標)5段2個(Corning)中，添加培養基使達到650mL/個。將自剩餘4個的長頸瓶獲得的細胞接種於12個的長頸瓶中，由此有效地持續產生病毒顆粒。
在繼代的次日去除培養上清，加入了650mL的2%FCS-DMEM培養基(包含1%MEM非必需胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)。在交換培養基3天後回收培養上清，通過0.45μm過濾器之後，保存在冰櫃中。另外，向回收培養上清之後的CellSTACK中加入650mL的2%FBS-DMEM培養基(包含1%MEM非必需胺基酸溶液、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)，並且進行了繼續培養。該2天後進行同樣的操作，回收了培養上清。並且，再重複1次同樣的操作。在此，利用下述記載的方法從所回收的培養上清中純化了嵌合HCV顆粒(HCVcc)。
(2) J6/JFH-1嵌合HCV顆粒(J6/JFH-1 HCVcc)的純化
所產生的病毒顆粒使用以下3個階段的步驟進行了純化。
(A) 濃縮和透析過濾
利用中空纖維濾柱Hollow Fiber Cartridge(GE Healthcare：500kDa截留、Model編號UFP-500-C-8A、以下稱為「Hollow Fiber」)，將上述(1)中獲得的包含HCV顆粒的培養上清濃縮至60倍。
(B) 密度梯度超離心
向Ultra-clear 25×89mm離心管(Beckman Coulter：商品目錄編號344058)中加入3mL經冷卻的包含60%蔗糖的TNE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA)，復層了7mL包含20%蔗糖的TNE緩衝液。並且，在包含20%蔗糖的TNE緩衝液之上復層了25mL樣本。使用SW-28(Beckman Coulter)，以28,000轉、4小時、4℃進行了超離心。
使用25G注射針(TERUMO)在管的底面打開穿孔，從該處獲得了12管(支)1mL的級分。對於各級分的溶液測定比重，確認形成了蔗糖的密度梯度。自比重大的一管(支)起回收了第3號、第4號、第5號的各級分，用於濃縮和緩衝液置換。
(C) 濃縮和緩衝液置換
使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(排除分子量：100kDa、Millipore)和TNE緩衝液對洗脫級分進行緩衝液置換，同時進行了濃縮。將如此獲得的濃縮液作為包含感染性HCV顆粒的病毒液(J6/JFH-1 HCVcc)，用於以下的實施例。
(3) 其它基因型的嵌合HCV顆粒(HCVcc)的製作
關於其它基因型的嵌合HCV顆粒的製作，H77株(基因型1a)與JFH-1株的嵌合HCV顆粒(H77/JFH-1 HCVcc)參見Lindenbach等人、Science、2005年、第309卷、第623-626頁；TH株(基因型1b)與JFH-1株的嵌合HCV顆粒(TH/JFH-1 HCVcc)參見國際公開第2009/014216號和國際公開第2009/131203號；S310-A株(基因型3a)與JFH-1株的嵌合HCV顆粒(S310/JFH-1 HCVcc)參見國際公開第2013/031956號，進行了製作。這些嵌合HCV顆粒(HCVcc)還詳細記載於Pietschmann等人、Proc. Natl. Acad. Sci USA、2006年、第103卷、第7408-7413頁的文獻中，基本上按照該文獻進行製作，利用與J6/JFH-1 HCVcc的製作(產生和純化)同樣的方法進行了純化。
用於H77/JFH-1 HCVcc製作的嵌合基因組RNA是：將JFH-1株的5』非翻譯區、H77株的編碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白和NS2蛋白的各蛋白的序列、以及JFH-1株的編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列和3』非翻譯區按照該順序連接而得的HCV嵌合基因組RNA。
用於TH/JFH-1 HCVcc製作的嵌合基因組RNA是：將JFH-1株的5』非翻譯區、TH株的編碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的各蛋白的序列、編碼NS2蛋白的自N末端到第33位的胺基酸殘基的區的序列、以及JFH-1株的編碼NS2蛋白的自第34位的胺基酸殘基到C末端的區的序列、編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列和3』非翻譯區按照該順序連接而得的HCV嵌合基因組RNA。TH/JFH-1 HCVcc的前體蛋白的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 41。
用於S310/JFH-1 HCVcc製作的嵌合基因組RNA是：將JFH-1株的5』非翻譯區、S310株的編碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白和NS2蛋白的各蛋白的序列(相當於胺基酸編號1-1032)、以及JFH-1株的編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列(相當於胺基酸編號1031-3034)和3』非翻譯區按照該順序連接而得的HCV嵌合基因組RNA。
如上所述，在此製作的各基因型嵌合HCV顆粒(HCVcc)的結構基因部分是來自JFH-1株以外的HCV株的基因組RNA。各基因型嵌合HCV顆粒(HCVcc)的細胞感染時的表型是：J6/JFH-1 HCVcc為基因型2a、H77/JFH-1 HCVcc為基因型1a、S310/JFH-1 HCVcc為基因型3a、TH/JFH-1 HCVcc為基因型1b。
2. 感染抑制活性的測定
向用PBS稀釋的、已知的人抗E2蛋白抗體MBL-HCV1 (Broering等人、J. Viol.、2009年、第83卷、第12473-12482頁)、本發明的scFv或IgG抗體中，添加包含各基因型嵌合HCV顆粒(HCVcc)(J6/JFH-1 HCVcc(基因型2a)、H77/JFH-1 HCVcc(基因型1a)、S310/JFH-1 HCVcc(基因型3a)、TH/JFH-1 HCVcc(基因型1b))的PBS稀釋液，使多重感染度(Multiplicity of infection; moi)達到0.1，在室溫下反應30分鐘，製作了抗體-HCVcc混合液。
之後，除去接種Huh-7細胞(2×104細胞/孔；10%FCS-DMEM培養基(包含1%MEM非必需胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉))並進行培養的48孔板中的培養上清，以100μL/孔添加抗體-HCVcc混合液，在37℃、5%CO2培養箱中溫育了3小時。3小時後除去培養上清，置換成D-MEM 500μL，在37℃、5%CO2培養箱中進一步培養了72小時。培養後，除去D-MEM，用PBS清洗細胞後，以100μL/孔添加Passive lysis buffer(被動性溶解緩衝液)(Promega)，製作細胞溶解液，回收到螺帽管中。回收的細胞溶解液中所含的HCV核心蛋白使用Lumipulse G1200(Fujirebio Inc.、Ortho Clinical Diagnostics)進行了定量。由通過測定而得的HCV的核心蛋白的摩爾濃度(核心蛋白量)算出了各抗體(scFv或IgG抗體)的HCVcc感染抑制活性。具體而言，將未加入抗體、使嵌合HCV顆粒(HCVcc)感染的細胞中的HCV核心蛋白量(對照值：圖中的橫軸「0μg/mL」)設為100%時，將在各抗體的存在下添加有HCVcc的細胞中的HCV核心蛋白量的比率(%)作為其抗體的感染抑制活性的評價值。即，細胞中的核心蛋白量(相對於對照的%)越少，則顯示各抗體的感染抑制活性越高。
將針對基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的IgG抗體和scFv的感染抑制活性分別示於圖6和圖7，將針對基因型3a的HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)的IgG抗體和scFv的感染抑制活性分別示於圖8和圖9，將針對基因型1b的HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)的IgG抗體和scFv的感染抑制活性分別示於圖10和圖11，將針對基因型1a的HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)的IgG抗體和scFv的感染抑制活性分別示於圖12和圖13。縱軸表示感染抑制活性。橫軸表示進行作用的各抗體及其濃度(添加到細胞後的最終濃度)。
另外，針對各基因型的HCVcc的MBL-HCV1抗體、本發明的IgG抗體和scFv的感染抑制活性IC50值示於表2。
[表2]
該結果顯示出：如上製作的本發明的scFv (e2d066 scFv、e2d073 scFv、和e2d081 scFv)和IgG抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG、e2d081 IgG)均對多個基因型嵌合HCV顆粒(HCVcc)具有強的感染抑制活性。特別是，包含e2d066的VH區(SEQ ID NO: 2)和VL區(SEQ ID NO: 4)的e2d066 IgG抗體和scFv、以及、包含e2d081的VH區(SEQ ID NO: 2)和VL區(SEQ ID NO: 22)的e2d081 IgG抗體和scFv顯示出對基因型1a、1b、2a和3a的HCV的感染抑制活性，而且對基因型2a(J6/JFH-1 HCVcc)和基因型1b(TH/JFH-1 HCVcc)，顯示出高於感染抑制活性已知的細胞受體抗體即抗CD81抗體(Emmanuel等人、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2004年、第101卷、第7270-7274頁)和MBL-HCV1抗體的感染抑制活性。對此，本發明的抗體和抗原結合性抗體片段具有抑制HCV的感染自身的效果，因而顯示出具有肝臟移植病人的HCV的再感染(C型肝炎復發)等的預防效果，且顯示出可適用於在肝臟移植中使用的C型肝炎的預防藥、特別是慢性C型肝炎病人的活體肝移植時的C型肝炎復發預防。
(實施例5) IgG抗體的逃逸突變株出現抑制性的評價
對於各IgG抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG或e2d081 IgG)，評價了逃逸突變株出現抑制性。
逃逸突變株出現抑制性的評價方法基於下述文獻中充分地記載的方法來進行：Meital等人、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2008年、第105卷、第19450-19455頁。
將用PBS稀釋的IgG抗體和J6/JFH-1 HCVcc混合，在37℃下使之反應1小時，製作了抗體-HCVcc混合液。
之後，向接種於12孔板的Huh-7細胞(培養基：10%FCS-DMEM(包含1%MEM非必需胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉))中，添加抗體-HCVcc混合液，使HCVcc感染細胞。感染3天後，在6孔板中繼代，在繼代後第3天和第6天回收了培養上清。通過感染效價測定(與以下記載的「最後回收的培養上清中所含的J6/JFH-1 HCVcc的感染效價」的測定方法同樣的方法)確認了所回收的培養上清中包含J6/JFH-1 HCVcc。將確認感染效價後的培養上清(第3天或第6天所回收的培養上清)用於此後的感染。
將確認感染效價後的所回收的培養上清(包含通過感染培養而產生的J6/JFH-1 HCVcc)再與IgG抗體混合，將該混合液添加到非感染的Huh-7細胞中，使HCVcc感染細胞。將該操作重複了8次(HCVcc的繼代感染的重複次數：總計8次)。
最後回收的培養上清中所含的J6/JFH-1 HCVcc(以下，稱為J6/JFH-1 HCVcc-8W)的感染效價如下進行了測定。在感染效價測定的前一天，將Huh-7細胞以1×104細胞/孔接種於聚-D-賴氨酸包被(poly-D-Lysine-coated)96孔板(Corning)。將J6/JFH-1 HCVcc-8W添加到各孔中，在37℃下培養了72小時。培養後，除去培養上清，用PBS清洗細胞後，將細胞用甲醇在-20℃下處置20分鐘，進行了固定。所固定的細胞用Block Ace溶液(DSファーマバイオメディカル)封閉1小時，用PBS清洗後，添加抗核心抗體(2H9；Wakita,T.等人、Nat. Med.、2005年、第11卷、第791-796頁)使達到10μg/mL，在室溫下溫育了1小時。除去上清，清洗細胞後，添加Alexa Fluor 488-綴合抗小鼠IgG(Molecular Probes)，在室溫下溫育了1小時。清洗細胞後，向各孔中添加50μL PBS，利用螢光顯微鏡觀察了細胞。感染效價通過計數發螢光的細胞數、以集落形成單位(focus forming units)/mL(ffu/mL)形式表示。
對J6/JFH-1 HCVcc-8W、或作為比較對照的親株J6/JFH-1 HCVcc進行IgG抗體的感染抑制活性測定，進行了逃逸突變株的檢測。首先，向60μL的J6/JFH-1 HCVcc-8W或J6/JFH-1 HCVcc(分別為100ffu)中同容量添加經稀釋的IgG抗體，在37℃下溫育1小時，製作了抗體-HCVcc混合液。將預先在8孔室玻片(Thermo Fisher Scientific)的各孔中接種的Huh-7細胞的培養上清除去，添加100μL抗體-HCVcc混合液，在37℃下培養了24小時。之後，除去培養上清，向各孔中添加200μL的10%FCS-DMEM培養基(包含1%MEM非必需胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉)，進一步培養了48小時。培養後，利用與上述的感染效價測定同樣的方法，使螢光標記抗體與各孔的細胞作用，計數發螢光的細胞數，測定了感染效價。將未加入抗體而感染了J6/JFH-1 HCVcc-8W或J6/JFH-1 HCVcc的細胞的感染效價作為100%，算出添加了各抗體-HCVcc混合液的細胞的感染效價%之後，將50%感染抑制濃度以IC50(μg/mL)表示。IC50的值越低，表示各抗體的感染抑制活性越高。
結果示於表3。表中的「J6/JFH-1 HCVcc」顯示各抗體對親株J6/JFH-1 HCVcc的感染抑制濃度IC50，「J6/JFH-1 HCVcc-8W」顯示各抗體對J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制濃度IC50。
[表3]
如表3所示，已知的人抗E2蛋白抗體MBL-HCV1(Broering等人、J. Viol.、2009年、第83卷、第12473-12482頁)利用與上述同樣的方法進行評價的結果，顯示出：即使在100μg/mL的濃度下，也沒有確認到對J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制活性，出現了逃逸突變株。
相對於此，e2d066 IgG和e2d081 IgG對J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制活性，與對J6/JFH-1 HCVcc的感染抑制活性相比，為同等程度或略微減少。即，關於e2d066 IgG和e2d081 IgG，顯示出：即使經過8次的重複繼代感染也抑制逃逸突變株的出現，這些抗體顯示逃逸突變株出現抑制性。特別是，e2d066 IgG顯示出：沒有確認到逃逸突變株的出現，因此顯示非常強的逃逸突變株出現抑制性。
e2d066 IgG和e2d081 IgG的VH區的胺基酸序列相同(SEQ ID NO: 2)。因此，顯示出：該VH區(SEQ ID NO: 2)(特別是，包含SEQ ID NO: 5所示CDR1、SEQ ID NO: 6所示CDR2、和SEQ ID NO: 7所示CDR3的VH區)可賦予逃逸突變株出現抑制性。
(實施例6) 表位分析
為了判定各IgG抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG)是否識別立體結構表位，試驗了是否識別變性E2蛋白。可與變性E2蛋白結合的抗體是識別E2蛋白的直鏈狀表位的抗體，不與變性E2蛋白結合的抗體可稱為識別E2蛋白的立體結構表位的抗體。
需要說明的是，作為對照抗體，對於識別HCV E2蛋白的直鏈狀表位的MBL-HCV1抗體、識別立體結構表位的AR3A抗體(國際公開第2010/047830號)也同樣地進行了分析。
1. TH E2-Fc蛋白(將人IgG的Fc蛋白附加到TH株的E2蛋白而得的融合蛋白)的製作
利用國際公開第2010/038789號中記載的方法進行了製作。
以TH株(基因型1b)的基因組RNA的cDNA(Wakita,T.等人、J. Biol. Chem.、1994年、第269卷、第14205-14210頁、國際公開第2006/022422號)為模板，通過PCR法擴增了編碼下述蛋白的基因：以TH株的前體蛋白的N末端的起始甲硫氨酸為第1位時由相當於第384位～第717位的區構成的蛋白(相當於E2蛋白)。將所擴增的DNA片段克隆到PCR-TOPO(Thermo Fisher Scientific)中。將編碼E2蛋白的基因片段用HindIII和BamHI消化並切出，以符合讀框的方式插入到p3×FLAG-CMV-13(Sigma-Aldrich)的信號肽序列的下遊的HindIII部位和BamHI部位之間。該載體被命名為CMV-13-THE2。將CMV-13-THE2用SacI和BamHI消化，將編碼信號肽序列和E2蛋白的DNA片段分別用瓊脂糖凝膠電泳分離，用GeneElute(Sigma-Aldrich)進行了純化。之後，將編碼上述信號肽序列和E2蛋白的各自DNA片段以符合讀框的方式插入到在表達由小鼠IL-7受體-人免疫球蛋白Fc結構域構成的嵌合蛋白的載體CDM-mIL7R-Ig(Sudo等人、Proc Natl. Acad Sci USA、1993年、第90卷、第9125～9129頁)的SacI部位和BamHI部位之間，獲得了表達附加有人免疫球蛋白的Fc結構域的抗原E2蛋白(以下，TH E2Fc蛋白)的載體CDM-THE2Fc。
將載體CDM-THE2Fc利用DEAE糊精法轉染COS1細胞，使TH E2Fc蛋白表達。使用結合有Protein-A的載體Prosep-A(Millipore)，從導入有CDM-THE2Fc的細胞的培養上清中，純化了TH E2Fc蛋白。
2. 各抗體的生物素化
將各抗體(e2d066 IgG、e2d073 IgG、e2d081 IgG、AR3A抗體、MBL-HCV1抗體)進行生物素化。生物素化使用EZ-Link(註冊商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific)按照附帶說明書來進行。向100μL用PBS稀釋至0.1mg/mL的IgG抗體中加入2.4μL的20mmol/L Sulfo-NHS-LC-Biotin，進行混合，在冰中靜置了2小時。其次，利用Zaba(商標) Spin Desalting Columns(Thermo Fisher Scientific)進行脫鹽，除去未反應的生物素，製備了生物素化抗體。
3. 表位分析
使TH E2-Fc蛋白在含有2%SDS、5%2ME的50mmol/L Tris-HCl(pH7.0)中進行95℃、3分鐘加熱處理，由此進行了變性。
將未變性的TH E2-Fc蛋白和變性的TH E2-Fc蛋白分別用PBS稀釋使達到0.5μg/mL，以每孔50μL添加到免疫板(Thermo Fisher Scientific)的各孔中，通過在4℃下靜置一夜將各蛋白固定於板上。除去蛋白溶液，將按照付帶手冊製備的Blocking One溶液(Nacalai Tesque)以每孔200μL添加到各孔中，進行了封閉。
其次，將生物素化抗體用PBS進行3倍梯度稀釋，以每孔50μL添加到上述的固定板的各孔中，在室溫下反應了1小時。反應結束後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗之後，將用含有0.05% Tween20的PBS進行3000倍稀釋的親和素-HRP(GE Healthcare)以每孔50μL添加到各孔中，在室溫下反應了1小時。反應結束後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之顯色之後，用1mol/L硫酸使反應停止，利用酶標儀(Microplate Reader)測定了吸光度(450nm)。
其結果示於圖14。圖14A顯示各IgG抗體與未變性的TH E2-Fc蛋白的結合性，圖14B顯示各IgG抗體與變性的TH E2-Fc蛋白的結合性。圖的縱軸顯示吸光度(450nm)，橫軸顯示生物素化抗體的稀釋倍率。
e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG、以及AR3A抗體不與變性的TH E2-Fc蛋白結合，但MBL-HCV1抗體與變性和未變性的TH E2-Fc蛋白的任一種蛋白均進行了反應(圖14)。
因此，這暗示了：e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG與MBL-HCV1抗體不同，識別立體結構表位。
(實施例7) 通過直鏈狀肽進行的表位分析
實施例6暗示了：e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG識別立體結構表位。因此，使用由12個胺基酸殘基構成的直鏈狀肽組，確認了這些抗體識別立體結構表位。
對於相當於TH株的E2蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO: 36)(將TH株的前體蛋白的N末端的起始甲硫氨酸設為第1位時相當於第384位～第717位的胺基酸序列)，合成了由將12個連續的胺基酸按照自N末端起各移動3個胺基酸的方式設計而得的胺基酸序列構成的肽組(肽編號1～82)。使各肽的N末端進行生物素化，C末端為甘氨醯胺。
將各肽溶解於DMSO中後，溶解於PBS中使達到0.01nmol/μL。將該肽溶液以每孔50μL加入到鏈黴親和素包被板(Thermo Fisher Scientific)的各孔中，在室溫下使之反應了2小時。除去肽溶液，將按照付帶手冊製備的Blocking One溶液(Nacalai Tesque)以每孔200μL添加到各孔中，在4℃下靜置一夜，由此進行了封閉。
除去封閉溶液，用含有0.05% Tween20的PBS清洗4次後，將用含有0.05% Tween20的PBS稀釋至1μg/mL的各抗體以每孔50μL添加到各孔中，在室溫下使之反應了1.5小時。反應結束後，除去抗體溶液，用含有0.05% Tween20的PBS清洗4次，接著以每孔50μL加入用含有0.05% Tween20的PBS進行5000倍稀釋的HRP標記抗人IgG山羊抗體(GE Healthcare)，在室溫下反應了1小時。反應後，除去抗體溶液，用含有0.05% Tween20的PBS清洗了5次。清洗後，用過氧化物酶顯色試劑盒使之顯色，通過測定450nm的吸光度，檢測了與肽結合的抗體。
該結果是：MBL-HCV1抗體與肽QLINTNGSWHIN(SEQ ID NO: 37)結合(圖15D)，但e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG與任一種肽均不結合(圖15A、B和C)。由此顯示出：MBL-HCV1抗體識別直鏈狀表位，e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG識別立體結構表位。
(實施例8) 通過競爭結合ELISA進行的表位的比較
關於識別立體結構表位的e2d066 IgG是否與識別立體結構表位的e2d073 IgG、e2d081 IgG和AR3A抗體識別相同表位，通過競爭結合ELISA進行了研究。
作為對照抗體，使用了識別立體結構表位的中和抗體AR3A、識別直鏈狀表位QLINTNGSWHIN(SEQ ID NO: 37)(TH株的E2蛋白的第412位的Q～第423位的N)的中和抗體MBL-HCV1、和識別直鏈狀表位(第522位的D～第534位的N)的非中和抗體8D10-3(國際公開第2010/038789號)。
向各抗體(自20μg/mL起3倍梯度稀釋)中等量加入生物素化的e2d066 IgG(記載於實施例6的項目2.中)進行攪拌後，加入到固定有TH E2-Fc蛋白(記載於上述的實施例6中)(0.5μg/孔)的ELISA板(Thermo Fisher Scientific)中。1小時後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗後，加入3000倍稀釋的親和素-HRP(GE Healthcare)進行了反應。1小時後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗後，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之顯色之後，用1mol/L硫酸使反應停止，利用酶標儀(Microplate Reader)測定了吸光度(450nm)。
結果示於圖16。圖的縱軸顯示吸光度(450nm)，橫軸顯示各抗體的濃度。
生物素化的e2d066 IgG與TH E2-Fc蛋白的結合，被e2d066 IgG和e2d081 IgG抗體濃度依賴性地抑制。因此，顯示出：e2d066 IgG和e2d081 IgG識別相同表位。
另一方面，顯示出：e2d073 IgG、AR3A抗體、MBL-HCV1抗體和8D10-3抗體沒有抑制生物素化的e2d066 IgG與TH E2-Fc蛋白的結合，因此與e2d066 IgG相比表位不同。
e2d066 IgG和e2d081 IgG的VH區的胺基酸序列相同(SEQ ID NO: 2)。因此，顯示出：該VH區(胺基酸序列(SEQ ID NO: 2))、特別是包含SEQ ID NO: 5所示CDR1、SEQ ID NO: 6所示CDR2、和SEQ ID NO: 7所示CDR3的VH區，可賦予相同的表位識別。
其次，將暗示了顯示逃逸突變株出現抑制性的HC-84.1抗體(國際公開第2013/033319號)基於Krey等人的文獻(Plos Pathogens，e1003364，2013)進行製作，對於與e2d066相比的表位異同，利用與上述同樣的方法進行了研究。向將e2d066 IgG、e2d081 IgG、HC-84.1抗體、MBL-HCV1抗體和AR3A抗體自20μg/mL起3倍梯度稀釋的樣本中，等量加入生物素化的e2d066 IgG(記載於實施例6的項目2.中)進行攪拌後，加入到固定有TH E2-Fc蛋白(記載於上述的實施例6中)(0.5μg/孔)的ELISA板(Thermo Fisher Scientific)中。1小時後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗後，加入3000倍稀釋的親和素-HRP(GE Healthcare)進行了反應。1小時後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗後，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之顯色之後，用1mol/L硫酸使反應停止，利用酶標儀(Microplate Reader)測定了吸光度(450nm)。
結果示於圖17。圖的縱軸顯示吸光度(450nm)，橫軸顯示各抗體的濃度。生物素化的e2d066 IgG與TH E2-Fc蛋白的結合，被e2d066 IgG和e2d081 IgG抗體濃度依賴性地抑制。
另一方面，顯示出：HC-84.1抗體、AR3A抗體和MBL-HCV1抗體沒有抑制生物素化的e2d066 IgG與TH E2-Fc蛋白的結合，因此HC-84.1抗體的表位也與e2d066 IgG不同。
(實施例9) 比較各種單克隆抗體與E2蛋白的結合性
比較了e2d066 IgG、e2d081 IgG、HC-84.1抗體、MBL-HCV1抗體和AR3A抗體與J6CF E2-Fc、TH E2-Fc蛋白的結合性。向固定有J6CF E2-Fc或TH E2-Fc蛋白(記載於上述的實施例6中)(0.5μg/孔)的ELISA板(Thermo Fisher Scientific)中加入了將各種單克隆抗體自30μg/mL起10倍梯度稀釋的樣本。1小時後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗後，加入5000倍稀釋的山羊抗人IgG F(ab』)2-HRP(Thermo Fisher Scientific)進行了反應。1小時後，用含有0.05% Tween20的PBS清洗後，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之顯色之後，用1mol/L硫酸使反應停止，利用酶標儀(Microplate Reader)測定了吸光度(450nm)。
該結果示於圖18。顯示出：與HC-84.1抗體、MBL-HCV1抗體和AR3A抗體相比，e2d066 IgG、e2d081 IgG對於基因型2a的J6CF株、基因型1b的TH株的E2蛋白的結合性高。
(實施例10) IgG抗體對C型肝炎病毒(HCV)感染擴大的抑制效果
通過對感染了基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的細胞進行e2d066 IgG的處置，評價了e2d066 IgG對HCV感染擴大的作用。作為比較，對於NS3蛋白的蛋白酶活性的抑制劑特拉匹韋(telaprevir)(VX-950)和幹擾素-α(IFN-α)也進行了評價。
在評價的前一天，向12孔板中接種Huh-7細胞(4×104細胞/孔；10%FCS-DMEM培養基(包含1%MEM非必需胺基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸鈉))並進行了培養。將上述實施例4的項目1.中製作的基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)用PBS製備成moi＝0.03之後，添加到Huh-7細胞中後，將Huh-7細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養了4小時。
4小時後，除去培養上清，置換成分別包含e2d066 IgG、特拉匹韋(VX-950)和IFN-α的D-MEM，在37℃、5%CO2培養箱中進一步培養了96小時。另外，將置換成不含抗體、藥物的D-MEM且同樣地進行培養的細胞設為對照(圖19中的橫軸「未處置」)。培養後，回收了細胞培養上清。使用Lumipulse G1200(Fujirebio Inc.、Ortho Clinical Diagnostics)定量了所回收的細胞培養上清液中包含的HCV核心蛋白。
結果示於圖19。縱軸表示細胞培養上清中的HCV核心蛋白濃度(pmol/L)，該值越低則顯示感染抑制活性越高。橫軸顯示自左起為「未處置」、所作用的抗體e2d066 IgG、藥物特拉匹韋、IFN-α以及它們的濃度(添加到細胞後的最終濃度)。
通過e2d066 IgG的處置，與對照(「未處置」)相比，細胞培養上清中的HCV核心蛋白濃度顯示顯著的低值，該效果與特拉匹韋(Telaprevir)(VX-950)和IFN-α的效果相比為同等以上。即e2d066 IgG具有抑制HCV感染後的細胞中的HCV產生的效果或具有抑制自HCV感染細胞向周圍的HCV未感染細胞的感染的效果。
因此，本發明的抗體和抗原結合性抗體顯示出：可抑制HCV對細胞的感染本身，同時即使在HCV的感染成立後也可抑制HCV的感染擴大。本發明的抗體和抗原結合性抗體由於具有抑制HCV感染本身的效果，因此顯示出具有肝臟移植病人的HCV的再感染(C型肝炎復發)等的預防效果，另外，由於具有HCV感染成立後的HCV感染擴大抑制效果，因此顯示出具有HCV持續感染者的治療效果、即C型肝炎的治療效果。
產業實用性
本發明的抗體或抗原結合性抗體片段由於具有高的HCV感染抑制活性和HCV感染擴大抑制效果，因此可期待用作C型肝炎的治療藥或預防藥、特別是可期待適用於預防慢性C型肝炎病人的活體肝移植時的肝炎復發。
本說明書中所引用的所有出版物、專利和專利申請均直接作為參考而納入本說明書中。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1：編碼e2d066(和e2d081)的VH區的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 2：e2d066(和e2d081)的VH區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 3：編碼e2d066的VL區的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 4：e2d066的VL區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 5：e2d066(和e2d081)的VH區的CDR1的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 6：e2d066(和e2d081)的VH區的CDR2的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 7：e2d066(和e2d081)的VH區的CDR3的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 8：e2d066的VL區的CDR1的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 9：e2d066的VL區的CDR2的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 10：e2d066的VL區的CDR3的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 11：編碼e2d073的VH區的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 12：e2d073的VH區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 13：編碼e2d073的VL區的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 14：e2d073的VL區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 15：e2d073的VH區的CDR1的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 16：e2d073的VH區的CDR2的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 17：e2d073的VH區的CDR3的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 18：e2d073的VL區的CDR1的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 19：e2d073的VL區的CDR2的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 20：e2d073的VL區的CDR3的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 21：編碼e2d081的VL區的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 22：e2d081的VL區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 23：e2d081的VL區的CDR1的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 24：e2d081的VL區的CDR2的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 25：e2d081的VL區的CDR3的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 26：e2d066的IgG抗體(e2d066 IgG)重鏈全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 27：e2d066的IgG抗體(e2d066 IgG)輕鏈全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 28：e2d073的IgG抗體(e2d073 IgG)重鏈全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 29：e2d073的IgG抗體(e2d073 IgG)輕鏈全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 30：e2d081的IgG抗體(e2d081 IgG)重鏈全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 31：e2d081的IgG抗體(e2d081 IgG)輕鏈全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 32：e2d066 scFv全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 33：e2d073 scFv全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 34：e2d081 scFv全長的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 35：接頭的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 36：TH株的E2蛋白的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 37：來源於TH E2蛋白的肽的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 38：e2d066的CL區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 39：e2d073的CL區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 40：e2d081的CL區的胺基酸序列；
SEQ ID NO: 41：TH株與JFH-1株的嵌合HCV顆粒(TH/JFH-1 HCVcc)的前體蛋白的胺基酸序列。