南瓜蛋白2及其製備方法和用途的製作方法

2023-10-23 00:58:22 5

專利名稱：南瓜蛋白2及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，特別是涉及到生物化學中一種新的核糖體失活 蛋白--南瓜蛋白2的分離純化，晶體生長技術及其應用。
背景技術：
從高等植物中提取的核糖體失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein, 簡稱RIP)， RIP是一類能使真核生物細胞的核糖體失活，從而抑制細胞內蛋 白質合成的細胞毒素，其作用機制是具有RNA N-糖苷酶或叫多核苷酸 腺苷糖 苷酶[EC3.2.2.22]活性。根據蛋白分子及其基因的結構，RIP可以分為3類，類 型l RIP是具RNA N-糖苷酶活性的單肽鏈蛋白，例如，來自葫蘆科植物栝樓塊 根的天花粉蛋白(Trichosanthin,簡稱TCS)，苦瓜種子的α，β-苦瓜子蛋 白(α，β-Momorcharin，簡稱α，β-MOM)和絲瓜種子的絲瓜蛋白a， b(Luff in a， b)。類型2 RIP是雙肽鏈蛋白，例如，來自大戟科植物蓖麻種子的蓖麻毒 素(Ricin)和豆科植物相思樹種子的相思子毒素(Abrin)，它是由一條具有RNA N-糖苷酶活性的A鏈和一條具凝集素活性的B鏈通過二硫鍵連接而成的。類型3 RIP是一類茉莉酮誘導的蛋白(jasmonate-induced protein),它是由具有RNA N-糖苷酶功能的N端結構域和一個未知功能的C端結構域組成，例如來自大麥 的JIP60。從葫蘆科植物中分離出來的類型1 RIP，例如天花粉蛋白、苦瓜子蛋 白、絲瓜子蛋白、白瀉根蛋白等，均具有抗腫瘤，抗病毒活性，特別是抗愛滋病 毒活性。關於類型l RIP和類型2 RIP已有很多的專利和文獻報導。
南瓜(Cucurbita moschata (Duch. )Poiret)，又叫中國南瓜，是葫蘆科
植物南瓜屬的一個種。CN1263107提供了從南瓜瓜瓤中分離出的類型1 RIP——
南瓜蛋白，並公開了它的製備方法。SDS-PAGE顯示它的分子量為27kDa.
CN1603340提供了南瓜蛋白的糖苷酶活性和抗腫瘤活性。中國專利
2007100084026提供了南瓜蛋白245個胺基酸順序。Barbieri等人(Biochimica
et Biophysica Acta 1760 (2006) 783 — 792)提供了從南瓜瓜瓤中提取一種
新的RIP: C.moschata RIP，它的分子量為30665Da，並測定了它的N端30個
胺基酸順序。Xia等人(Cell Research (2003)13:369-374)從南瓜子中提取出
moschatin，它的分子量為29kDa，並測定了它的N端10個胺基酸順序。關於南
瓜果中的其它核糖體失活蛋白，未見報導。

發明內容
本發明的目的是基於上述現有技術基礎，尋找一種新的核糖體失活一南瓜蛋 白2，探討其製備技術，以及晶體生長技術，為南瓜蛋白2的結構與功能研究及
應用提供物質基礎和實驗數據。
本發明的技術方案是從南瓜中提取南瓜蛋白的同時分離純化出新的RIP，通 過包括以下四個步驟快速分離純化得到南瓜蛋白2:
(1) .去掉皮和種子的南瓜瓜瓤加pH4. 5 , lOmM醋酸緩衝液進行勻漿。
(2) .勻漿液用50%的冰醋酸調pH 3.5-4.5，最佳為pH 4.0，然後在4°C 條件下，16000Xg離心30，，收集上清液。
(3) .加樣到pH4.5 ， 20mM醋酸緩衝液平衡的強陽離子柱上，280nM實時 檢測，用pH4. 5， 20mM醋酸緩衝液洗至基線，再用p朋.5 ， 20mM磷酸鹽緩衝 液洗至基線，然後用0 - 0. 6M NaCl在pH 6. 5， 20mM磷酸鹽緩衝液進行梯 度洗脫，收集第1峰。 一般情況下，洗脫出的第2峰就是先前報導的南瓜蛋白。
(4) .合併峰1，用50%的冰醋酸調pH4. 0，同時加2倍體積的pH4. 5， 20mM 醋酸緩衝液，再加樣到用pH4.5， 20mM醋酸緩衝液平衡的強陽離子柱上，280nM 實時檢測，用pH4. 5， 20mM醋酸緩衝液洗至基線，再用pH7. 5， lOmM磷酸鹽
緩衝液洗至基線，然後用0 - 1 MNaCl在pH7.5， lOmM磷酸鹽緩衝液中進 行梯度洗脫，收集主要的峰，該峰就是高度純化的南瓜蛋白2。
本發明所分離純化的南瓜蛋白2，在SDS-PAGE上呈現一條帶，分子量為 27kDa， ESI-MS測定其分子量為27183Da。在強陽離子預裝柱Mono-S柱(購自 Pharmacia公司)表現為單一峰見圖1。高純度的南瓜蛋白2已經用汽相擴散 技術包括懸滴法和坐滴法，蛋白質母液配成12-20mg/ml，池液為磷酸鹽緩衝液 (0. 05M-0. 2M， pH6. 0-pH7. 8)、擰檬酸緩衝液(0. 05M-0. 2M， pH4. 2-6. 0)，或 Tris-HC1緩衝液(0. 05M-0. 2M， pH7. 3-pH8. 9)， 以聚乙二醇為沉澱劑 (10%-40%(W/V))長出可供X-射線衍射用的單晶。該單晶體在同步輻射光源上收 集到一套1.8A的衍射數據，該晶體屬P2JA晶型，晶胞參數為a =55.853A b=65.507A，c=91.754A。以天花粉蛋白為結構模版，用分子置換法構建了南瓜 蛋白2的結構模型，表明南瓜蛋白2與天花粉蛋白一樣具有典型的核糖體失活 蛋白摺疊(RIP fold)和活性中心，屬於類型1RIP，與天花粉蛋白一樣具有抗 腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒的功能。用X—ray sequencing的方法根據 電子云密度圖及殘基周圍的化學環境，測定出南瓜蛋白2 (簡寫CUS2)的N端 順序為BVSFRLSSATSSSYGTFISNLRFALPKERKLY (B表示N/D)，該順序與南瓜蛋白 (簡寫CUS)的N端32個胺基酸順序，C. moschata RIP (簡寫CmRIP) N端31 個胺基酸順序，謹chatin (簡寫M0S) N端10個胺基酸順序，p印ocin (簡寫 PEP,從西葫蘆Cucurbita p印o中提取的RIP) N端20個胺基酸順序以及天花 粉蛋白(簡寫TCS)的N端32個胺基酸順序比較如下
相同性
CmRIPDIALDLSTAT KATYSAFLRQ LRNAFDPTKA T32%
CUS2BVSFRLSSATSSSYGTFISN LRFALPKERKLY(100%)
TCSDVSFRLSGATSSSYGVFISN LRKALPNERKLY87. 5%
CUS臓FDLSSATSSSYKTFIKN LREALPKDGKVT68. 7%
PEPNVRFDLSGATSSSYKTFI腦85%
M0S證FDLSGAT80%
南瓜蛋白2與天花粉蛋白，西葫蘆蛋白的N端順序相同性超過85X，但與 C.moschataRIP相同性只有32X，與南瓜蛋白相同性只有68. 7%，上述N端順 序比較表明南瓜蛋白2是從南瓜中提取的一種新的RIP。
MTS法測試表明，南瓜蛋白2對人結腸癌細胞株HCT116增殖抑制活性較強， 其半數抑制濃度(IC5。)為1.48X10—7mol/L。
本發明與現有技術相比，具有以下積極效果-
1. 本發明的分離純化技術，不經硫酸銨分級沉澱等步驟，省卻許多人工繁 瑣操作，可以分離到南瓜蛋白2，同時可以得到南瓜蛋白。
2. 本發明優選用於分離純化的緩衝液濃度、pH值，並選用了強陽離子交換 劑，省卻透析的繁瑣步驟。
3. 本發明所得出的南瓜蛋白2的純度高，在離子交換預裝柱表現為一個單 峰，並已在磷酸鹽緩衝液(0.05M，0.2M，pH6.0-pH7.8)、檸檬酸緩衝液 (0. 05M-0. 2M， pH4. 2-6. 0)，或Tris-HCl緩衝液(0. 05M-0. 2M， pH7. 3-pH8. 9) 條件下，以聚乙二醇為沉澱劑(10。/。-40。/。(V/V))長出晶體。
4. 南瓜蛋白2對人結腸癌細胞株HCT116增殖抑制活性較強。


附圖為南瓜蛋白2在Mono-S HR5/5柱上洗脫圖
橫坐標為洗脫液ml數，縱坐標為mAU,南瓜蛋白2在洗脫液達6. 27ml處即 在O. 16MNaCl(pH7. 5 10mM磷酸鹽緩衝液)時出峰，圖中折線滿標為1MNaCl。
具體實施例方式
實施例l:南瓜蛋白2的製備技術
取500g去掉皮和種子的南瓜瓜瓤，加500ml pH4. 5 ， lOmM醋酸緩衝液， 在勻漿機上勻漿二次，然後用50%的冰醋酸調pH4. 0，再在4t:條件下16000X g，離心30，，收集上清液，上清液加樣到2. 6X 1 3 c m的Sp-S印harose Fast Flow柱上(該柱已用pH4. 5 ， 2 0 mM醋酸緩衝液平衡)，繼續用pH4.5， 2 0 mM醋酸緩衝液洗出一個雜峰後，用pH6.5， 2 0 mM磷酸鹽緩衝液繼續洗
柱，又會洗出一個雜峰，然後用0 - 0.6M NaCl (在pH6. 5， 2 0 mM磷酸鹽 緩衝液中)梯度洗脫，收集第一峰。混合第一峰收集液，用5 0%冰醋酸調 pH4，再加上2倍體積的pH4. 5， 20mM醋酸緩衝液，混勻後加樣到1.6X13cm 的Sp-S印harose Fast Flow柱上(該柱己用pH4. 5， 2 0 mM醋酸緩衝液平 衡)，同樣再用pH4.5， 2 OmM醋酸緩衝液洗柱後，用pH7. 5， 10mM磷酸鹽 緩衝液洗柱達到基線後，最後用0 - 1M NaCl(在pH7. 5， lOmM磷酸鹽緩衝液 中)進行梯度洗脫，收集洗脫尖峰，就是南瓜蛋白2。 實施例2:強陽離子預裝柱Mono-S分析
本發明分離純化的南瓜蛋白2在Mono-S HR5/5柱上洗脫圖(見附圖) A液為pH7. 5， 10mM磷酸鹽緩衝液，B液為A液+lM NaCl，流速lml/min， Mono-S 柱用A液平衡後，加樣，A液洗柱3ml， 0 - 30% B液線性梯度洗脫6ml，然 後100% B液洗3ml後，再用A液平衡5ml。南瓜蛋白2在洗脫液達6. 27ml即 NaCl濃度為0. 16M時出峰。 實施例3:南瓜蛋白2的晶體生長
將本發明提純的南瓜蛋白2濃縮為14mg/ml，池液用pH5. 4， 0. 1M檸檬酸緩 衝液pH 6. 0-7. 8或0. 1M磷酸緩衝液，28% PEG6K為沉澱劑，用懸滴法長出單 晶體。該單晶體在同步輻射光源上收集到一套1. 8A的衍射數據，該晶體屬P2A2i 晶型，晶胞參數為a =55. 853A b=65. 507A， c二91. 754A。
權利要求
1. 一種從南瓜中提取的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白2，其特徵在於分子量為27183Da，其N端胺基酸順序為BVSFRLSSATSSSYGTFISNLRFALPKERKLY
2. 根據權力要求1的一種南瓜蛋白2的製備技術，包括緩衝液抽提、調酸 和強陽離子柱梯度洗脫，其特徵在於通過包括以下四個步驟快速分離純化得 到南瓜蛋白2:(1) 去掉皮和種子的南瓜瓜瓤加pH4. 5 ， lOmM醋酸緩衝液進行勻漿。(2) 勻漿液用50%的冰醋酸調pH 3.5-4.5，最佳為pH 4.0，然後在4°C 條件下，16000Xg離心30，，收集上清液。(3) 加樣到pH4.5 ， 20mM醋酸緩衝液平衡的強陽離子柱上，280nM實時 檢測，用pH4.5， 20mM醋酸緩衝液洗至基線，再用p朋.5 ， 20mM磷酸鹽緩衝 液洗至基線，然後用0 - 0. 6M NaCl在pH 6. 5， 20mM磷酸鹽緩衝液進行梯 度洗脫，收集第1峰。(4) 合併峰1，用50%的冰醋酸調pH4. 0，同時加2倍體積的pH4. 5， 20mM 醋酸緩衝液，再加樣到用pH4.5， 20mM醋酸緩衝液平衡的強陽離子柱上，280nM 實時檢測，用pH4,5， 20mM醋酸緩衝液洗至基線，再用pH7. 5， lOmM磷酸鹽 緩衝液洗至基線，然後用0 - 1 MNaCl在pH7.5， 10mM磷酸鹽緩衝液中進 行梯度洗脫，收集主要的峰，該峰就是高度純化的南瓜蛋白2。
3. —種南瓜蛋白2的晶體生長技術，其特徵在於該生長技術是在磷酸緩 衝液，檸檬酸緩衝液，Tris-HCl緩衝液中，用聚乙二醇為沉澱劑進行晶體生長。
4. 根據權力要求1的一種南瓜蛋白2，其特徵在於該蛋白可作為製備治療 結腸癌藥物的應用。
全文摘要
南瓜蛋白2及其製備方法和用途，涉及生物化學領域。本發明公開了從南瓜(Cucurbita moschata)瓜瓤中提取的一種新的核糖體失活蛋白--南瓜蛋白2(2型南瓜核糖體失活蛋白cucurmosin 2)，ESI-MS測定其分子量為27183Da。南瓜蛋白2已在磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液和Tris-HCl緩衝液中，以聚乙二醇為沉澱劑長出可供X-射線衍射的單晶體，晶體結構初步分析表明它是類型1核糖體失活蛋白，具有抗腫瘤，抗病毒，特別是抗愛滋病毒作用，為獲得藥用蛋白質或製備免疫毒素打下物質基礎。
文檔編號C07K1/14GK101386644SQ20081000131
公開日2009年3月18日 申請日期2008年1月3日 優先權日2007年1月4日
發明者陳明晃 申請人:中國科學院福建物質結構研究所