一株自西藏當雄奶拉中分離的產香保加利亞乳桿菌及應用的製作方法
2024-04-15 23:26:05
1.本發明屬於微生物發酵領域，具體涉及一株自西藏當雄奶拉中分離的產香保加利亞乳桿菌及應用。
背景技術：
2.酸奶發酵劑的菌株是酸奶製品生產最核心的技術。其中保加利亞乳桿菌作為酸奶發酵劑的主要成分對酸奶風味的形成至關重要，其中產生風味物質乙醛、雙乙醯主要賦予酸奶清香的滋味。
3.德氏乳桿菌保加利亞亞種(lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)通常稱其為保加利亞乳桿菌(lactobacillus bulgaricus)是用於酸奶生產的主要乳酸菌菌種之一。保加利亞乳桿菌對人體有非常重要的保健作用，具有促進有益菌的生長定殖、清腸、抗腹瀉，維持胃腸道健康，促進消化吸收的作用，增加免疫及抗癌、抗腫瘤等重要的生理功能。在食品發酵、工業乳酸發酵、飼料行業和醫療保健領域均有比較廣泛的應用。
技術實現要素：
4.現有技術中發酵酸奶的菌株產風味物質性能較差，不能滿足人們對食品營養和口味的要求。針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種保加利亞乳桿菌。
5.第一方面，本發明提供一株保加利亞乳桿菌(lactobacillus bulgaricus)dangxiong lbⅲ菌株，其保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏單位地址中國武漢武漢大學，保藏編號為cctcc no:m 2022316。
6.優選地，所述菌株的16sr dna序列如seq id no.1所示。
7.第二方面，本發明還提供所述保加利亞乳桿菌菌劑的發酵製備方法，所述方法包含如下步驟：培養所述的保加利亞乳桿菌菌株。
8.優選地，所述製備方法包括如下步驟：
9.(1)將所述的保加利亞乳桿菌菌株放大培養；
10.(2)將步驟(1)得到的產物加入到液體培養基中，在32-34℃條件下發酵培養。
11.第三方面，本發明還提供一種菌劑，所述菌劑中含有所述的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株。
12.優選地，所述菌劑通過所述的發酵製備方法得到。
13.第四方面，所述的保加利亞乳桿菌或所述的菌劑在食品或食品添加劑中的應用。
14.優選地，所述食品為發酵乳製品，優選為酸奶、奶酪、發酵乳飲料中的一種或兩種以上的組合。
15.第五方面，本發明提供一種發酵乳製品，所述發酵乳製品的發酵劑中含有所述的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株。
16.優選地，所述發酵乳製品中含有糠醛。
17.優選地，所述發酵乳製品中還含有乙醛和/或丁二酮，
18.優選地，所述發酵乳製品中含有糠醛、乙醛和丁二酮。
19.優選地，所述發酵乳製品中含有2.9-3.0mg/l丁二酮，或者優選地，所述發酵乳製品中含有29-30mg/l乙醛。
20.優選地，所述發酵乳製品中含有縮水甘油、4-甲基-2-己酮、3-甲基-2-丁酮、4-乙基辛烷、十二烷、3-甲基-3-丁烯-1-醇、甲氧基丙酮、4-甲基辛烷、乙烯基乙醚、正壬醛、順-2-甲基環己醇、糠醛、乙醛、丁二酮、3-對甲苯基四氫呋喃、苯甲醛、苯乙醛、松油醇、3-甲基-2-(5h)-呋喃酮、γ-巴豆醯內酯、正戊醇、2,5-二甲基苯甲醛、n-n-二苄氧羰基-l-精氨酸、二甲基碸、2-甲基丁基己酸酯和(+)-二苄氧基-l-酒石酸酐中的一種或兩種以上的組合，
21.優選地，所述發酵乳製品中含有縮水甘油，4-甲基-2-己酮，3-甲基-2-丁酮，4-乙基辛烷，乙酸丁酯，2-庚酮，十二烷，3-甲基-3-丁烯-1-醇，甲氧基丙酮，4-甲基辛烷，乙烯基乙醚，二甲基三硫，2-壬酮，正壬醛，順-2-甲基環己醇，乙酸，糠醛，乙醛、丁二酮、鄰二氯苯，異丙醇，3-對甲苯基四氫呋喃，苯甲醛，正辛醇，亞硝酸戊酯，2-十一酮，異戊酸，苯乙醛，二甲基矽烷二醇，正壬醇，異戊酸.，松油醇，3-甲基-2-(5h)-呋喃酮，萘，異戊酸，γ-巴豆醯內酯，正戊醇，2,5-二甲基苯甲醛，2-十三烷酮，乙酸苯乙酯，3-甲基戊酸，n-n-二苄氧羰基-l-精氨酸，二甲基碸，苯乙醇，2-甲基丁基己酸酯，2-十五酮，辛酸，3-甲基戊酸，丁位癸內酯，癸酸，丁位十二內酯和(+)-二苄氧基-l-酒石酸酐中的一種或兩種以上的組合，
22.優選地，所述發酵乳製品中含有縮水甘油，4-甲基-2-己酮，3-甲基-2-丁酮，4-乙基辛烷，乙酸丁酯，2-庚酮，十二烷，3-甲基-3-丁烯-1-醇，甲氧基丙酮，4-甲基辛烷，乙烯基乙醚，二甲基三硫，2-壬酮，正壬醛，順-2-甲基環己醇，乙酸，糠醛，乙醛、丁二酮、鄰二氯苯，異丙醇，3-對甲苯基四氫呋喃，苯甲醛，正辛醇，亞硝酸戊酯，2-十一酮，異戊酸，苯乙醛，二甲基矽烷二醇，正壬醇，異戊酸.，松油醇，3-甲基-2-(5h)-呋喃酮，萘，異戊酸，γ-巴豆醯內酯，正戊醇，2,5-二甲基苯甲醛，2-十三烷酮，乙酸苯乙酯，3-甲基戊酸，n-n-二苄氧羰基-l-精氨酸，二甲基碸，苯乙醇，2-甲基丁基己酸酯，2-十五酮，辛酸，3-甲基戊酸，丁位癸內酯，癸酸，丁位十二內酯和(+)-二苄氧基-l-酒石酸酐。
23.第六方面，本發明提供所述的發酵乳製品的製備方法，所述製備方法包括如下步驟：利用包含所述的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株或所述的菌劑製備發酵劑，然後將發酵劑加入到乳液中進行發酵。
24.優選地，所述乳液為動物乳液或者植物乳液；
25.優選地，所述動物乳液為牛奶、羊奶或馬奶中的一種或兩種以上的組合；
26.優選地，所述植物乳液為豆乳。
27.本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株，分離自從西藏當雄縣(海拔4350m)牧民家自製奶製品中。該菌株已於2022年3月25日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctcc no:m 2022316。本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株在酸奶發酵中代謝產生豐富的醛、酮、醇、酯類等風味物質，並且與市售酸奶發酵劑相比，獨產番茄風味特徵物質之一糠醛，賦予酸奶獨特、明顯的番茄風味；該菌株同時高產酸奶特徵風味物質乙醛，賦予酸奶清爽可口的特徵風味。可以滿足廣大消費者對於發酵酸奶營養價值及風味口感要求的不斷提高，利用本發明提供的菌株製備得到的酸奶發酵劑可賦予酸奶愉悅風味併兼具營養功能。
28.菌種保藏信息
29.本發明提供的保加利亞乳桿菌(lactobacillus bulgaricus)dangxiong lbⅲ菌株於2022年3月25日保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctcc no：m 2022316，保藏地址：中國.武漢.武漢大學，郵政編碼：430072；電話：027-68754052。
附圖說明
30.圖1所示為保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株鏡檢圖；
31.圖2所示為對保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株構建的系統發育樹；
32.圖3所示為不同菌株發酵酸奶的乙醛和雙乙醯含量；
33.圖4所示為不同菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖，其中，圖4(a)所示為本發明的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖，圖4(b)所示為hs-2菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖，圖4(c)所示為yr-4菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖。
具體實施方式
34.本發明提供的菌株dangxiong lbⅲ為保加利亞乳桿菌，該菌株已於2022年3月25日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctcc no:m 2022316。本發明提供的菌株能夠滿足廣大消費者對於發酵酸奶營養價值及風味口感不斷提高的要求。
35.本發明提供的乳酸菌從西藏當雄縣(海拔4350m)牧民家自製的奶拉中分離獲得，經16sr rna鑑定其為德氏乳桿菌保加利亞亞種，為天然野生型微生物菌株，屬於衛生部2010年頒布的《可用於食品的菌種名單》的食品微生物，可廣泛應用於各種發酵乳製品，具有食品安全屬性。
36.在本發明的一種實施方式中，應用本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵製備發酵乳製品包括步驟如下：
37.(1)保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株的活化；
38.(2)發酵乳製品發酵劑製備；
39.(3)發酵乳製品的製作。
40.本發明提供的具體實施方式中以gc-ms方法檢測發酵乳製品中風味物質。通過gc-ms對酸奶進行風味物質檢測發現保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株代謝產生風味物質達50種，含有豐富的醛、酮、醇、酸、酯等風味物質，而2株對照菌株(市售酸奶發酵劑)風味物質分別是36和39種；並且只有保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵酸奶中檢測含有番茄特徵風味的關鍵物質-糠醛；該菌株同時高產酸奶特徵風味物質乙醛，其乙醛含量是市售發酵劑製作酸奶的1.2倍，賦予酸奶更加清爽可口的特徵風味。
41.本發明實施例中所用的試劑及儀器來源信息如下表1所示。
42.表1
[0043][0044][0045]
實施例1菌株的分離與鑑定
[0046]
保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株的分離與鑑定，步驟如下：
[0047]
(1)菌株富集：取5g西藏當雄縣(海拔4350m)牧民家自製的奶拉樣品粉碎後加入45ml無菌生理鹽水分散均勻，取2ml上述分散液加入到20ml滅菌的石蕊牛乳培養基中，置於37℃培養箱靜置培養，待培養基酸化凝固並呈現粉紅色時取出。
[0048]
(2)培養單菌落：將石蕊牛乳培養基菌液稀釋到10-5
，吸取100μl塗布於bl固體培養基平板上，置於37℃培養箱培養，待菌落形成。在bl平板上，菌落呈光滑微微凸起，溼潤，邊緣不光滑，無色到微白色，直徑1-3mm，菌落背面為微黃色。
[0049]
(3)篩選產酸菌種：將初篩得到的單菌落，在含0.2％caco3的bl固體培養基平板上劃線培養，37℃培養箱培養36h，結束培養後觀察菌落周圍有無透明圈產生，選擇透明圈大
的單菌落做進一步分離純化。
[0050]
(4)革蘭氏染色初步鑑定：對復篩菌株進行革蘭氏染色，如果菌體染色呈紫色，則為革蘭氏陽性菌，留下來進行後續研究，如果染色呈現紅色，該菌株是革蘭氏陰性菌直接淘汰。鑑定結果顯示：所得復篩菌株為革蘭氏陽性菌，不運動，無芽孢，無鞭毛，無莢膜，菌體呈細杆狀，呈現單杆或成鏈，此菌株即為目標菌株。菌株鏡檢形態特徵如圖1所示。
[0051]
(5)分子生物學鑑定16s rrna：使用高保真酶對待鑑定菌株進行16s rdna測序及菌種鑑定。採用的引物信息及pcr擴增反應體系和條件如表2和表3所示。
[0052]
表2引物信息
[0053][0054]
表3 pcr擴增反應體系和條件
[0055][0056]
pcr產物檢測合格後送測序公司進行測序，測得的16s rrna基因序列如seq id no.1所示，具體為：
[0057]
gatttgttggacgctagcggcggatgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctaaagactgggataccacttggaaacaggtgctaataccggataacaccatgaatcgcatgattcaagtttgaaaggcggcgcaagctgtcactttaggatgagcccgcggcgcattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcaatgatgcgtagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggtcttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaggatagaggcagtaactggtctttatttgacggtaatcaaccagaaagtcccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggaatgataagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggaactgcatcggaaactgtcattcttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagcgctaggtgttggggactttccggtcctcagtgccgcagcaaacgcattaagcgctccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaaaaaccttaccaggtcttgacatcctgcgctacacctagagataggtggttcccttcggggacgcaaagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtctttagttgccatcattaagttgggc
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[0058]
將測序結果進行ncbi-blast比對，並構建的系統發育樹如圖2。根據圖2所示的系統發育樹鑑定該菌株為保加利亞乳桿菌(lactobacillus bulgaricus)，命名為保加利亞乳桿菌(lactobacillus bulgaricus)dangxiong lbⅲ菌株，得到的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株於2022年3月25日保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctcc no:m 2022316。
[0059]
實施例2保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌粉的製備
[0060]
(1)保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株的活化：取-80℃冷凍甘油管保藏的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株於mrs液體培養基中，37℃培養12h，連續轉接2次完成菌株活化；
[0061]
(2)保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株的擴培：將活化菌種按2％接種至70mlmrs液體培養基，37℃培養12h；
[0062]
(3)保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株的培養：將擴培菌種按2％接種至3500mlmrs液體培養基，37℃培養12h；
[0063]
(4)保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌體分離：將培養液採用5000rpm離心10min，倒掉上清，保留沉澱；
[0064]
(5)凍幹液配備：10g脫脂奶粉，5g麥芽糊精，5g海藻糖，3g甘油，12g菌體沉澱，65g純水，混勻製備成菌體凍幹液，轉入凍幹瓶，-40℃預凍2h。
[0065]
(6)保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌粉凍幹：採用labconco真空冷凍乾燥機進行凍幹，凍幹程序如下:
[0066]
步驟溫度(℃)時間(h)真空度(pa)1-101002-81003-6804-360504063407640
[0067]
實施例3應用保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵製備酸奶
[0068]
(一)酸奶的製備
[0069]
取新鮮牛乳，加入重量比為6.5％的食用蔗糖，混勻後預熱，均質和殺菌；冷卻至40-50℃後加入發酵罐中，分別將實施例2中製備的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株凍乾粉以及市售酸奶發酵劑yr-4和hs-2(天貓網購家用酸奶發酵劑)按50mg/l接種，37℃發酵12h；發酵結束置於4℃冷藏24h後即得酸奶。
[0070]
(二)酸奶的感官評價
[0071]
酸奶的感官評價參照《中國乳製品工業行業規範rhb 103-2004酸牛乳感官質量評鑑細則》，邀請7人對不同菌株發酵的酸奶樣品品嘗後進行評分，最終結果取平均值。酸奶的評價指標及評分標準如表4所示。
[0072]
表4酸奶的感官評分標準
[0073][0074][0075]
上述酸奶發酵所述不同的菌株如表5所示，各菌株酸奶製備的步驟及工藝與保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵製備酸奶的相同。
[0076]
表5不同菌株發酵酸奶感官得分
[0077]
dangxionglbⅲhs-2yr-4色澤9.7110.009.43酸甜比10.009.578.86風味39.2934.7134.00口感和組織狀態39.0038.7137.86綜合得分9892.9990.15
[0078]
如表5實驗結果顯示：採用本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵的酸奶綜合評分最高，尤其在風味方面本發明保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株得分遠高於對照菌株。
[0079]
對應用保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵製作的酸奶進行了7人小組感官評價，反饋其具有番茄風味，並且具有酸奶清爽可口的特徵，採用本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵的酸奶綜合評分最高，尤其在風味方面本發明保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株得分遠高於對照菌株(市售酸奶發酵劑)。
[0080]
(三)酸奶中主要風味物質乙醛和雙乙醯含量的檢測
[0081]
1.乙醛含量的測定
[0082]
(1)試劑配製：稱取12.70g碘於500ml燒杯中，加入40g碘化鉀，加適量的水溶解，移至1 000ml棕色容量瓶，定容搖勻，配製成0.1mol/l碘標準溶液。然後準確量取10.00ml的0.1mol/l碘標準溶液於100ml棕色容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，兩種溶液現用現配。
[0083]
(2)樣品測定：取1％nahso3溶液5ml置於250ml錐形瓶中，加入6000rpm，離心20min的試樣((一)中製備的酸奶)上清液25ml，混勻後在室溫下放置1h，然後加入1％澱粉溶液1ml，用0.1mol/l碘液滴定至接近淡藍紫色，再用0.01mol/l碘液滴定至淡藍紫色，並且在30s內淡藍紫色不褪去，以上滴定均不計數。然後加入20ml 1mol/l的nahco3溶液，充分振蕩混勻，使溶液藍紫色消失，最後用0.01mol/l碘液滴定至藍紫色終點，記錄消耗標準碘液的體積，每個樣品有2個平行，並同時做空白實驗。
[0084]
m＝(v1-v2)*0.022*c*106/25
[0085]
式中：m為乙醛質量濃度/(mg/l)；v1為滴定樣品消耗碘標準溶液體積/ml；v2為滴定空白消耗碘標準溶液體積/ml；c為碘標準溶液的濃度/(mol/l)；25為樣品稱樣量/ml；0.022為乙醛反應化學基本單位/g。
[0086]
2.雙乙醯含量的測定
[0087]
(1)丁二酮標準曲線的繪製：取15μl丁二酮溶於蒸餾水中，定容至500ml。分別量取丁二酮標準溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml於編號的12支雙排放置試管中，並用蒸餾水補足至10ml。向前排6支試管中加1％的鄰苯二胺溶液0.5ml，後排6支試管不加鄰苯二胺溶液，充分混勻後於黑暗處反應30min。反應完全後加4.0mol/l鹽酸進行終止反應(前排試管加2.0ml，後排試管加2.5ml，搖勻後以後排試管為空白對照，用紫外分光光度計在335nm波長下測定吸光度。以丁二酮濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製標準曲線。根據標準曲線回歸方程y＝0.116 2x+0.040 7，r2＝0.9999，計算雙乙醯含量。
[0088]
(2)丁二酮含量的測定：取待測酸乳樣品((一)中製備的酸奶)，用16％三氯乙酸溶液等體積與其混合，混勻後靜置10min，5500rpm離心10min。取上清液20ml，等體積加入2個
試管中，向1號試管中加入1％的鄰苯二胺溶液0.5ml，2號試管不加，充分混勻後於黑暗處使其反應30min，然後向2個試管中加入4.0mol/l的鹽酸終止反應(1號試管加2.0ml，2號試管加2.5ml)，混勻後以2號試管作為對照液，在335nm波長測定吸光度。如果樣品中丁二酮含量較高，測得的吸光度超過0.2～1.0範圍，可用8％三氯乙酸對樣品進行適當的稀釋處理。
[0089]
實驗結果：如圖3所示，採用本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株(圖3中db-3為本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株)發酵酸奶中乙醛和雙乙醯含量比市售酸奶菌劑hs-2和yr-4發酵得到的酸奶中的乙醛和雙乙醯含量高。本發明提供的菌株發酵得到的酸奶中乙醛含量達到29.11mg/l，雙乙醯含量達到2.993mg/l。高含量的乙醛賦予酸奶濃鬱風味；有研究表明乙醛與雙乙醯含量比值大於3∶1時，酸乳的風味較好。
[0090]
本發明保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株以及市售酸奶發酵劑菌株發酵的酸奶中乙醛：雙乙醯都大於3:1。
[0091]
(四)酸奶的其他風味物質檢測
[0092]
樣品前處理：採用頂空固相微萃取headspace solid-phase microextraction(hs-spme)對樣品的揮發性氣味化合物進行提取和富集，通過gc-ms進行揮發性氣味化合物的全鑑定(原理：當氣味化合物注入氣相色譜，經色譜柱分離後的物質由分子分離器進入電離室，被電子轟擊成離子，其中部分離子進入離子檢測器。經過質譜快速掃描後導出組分的質譜圖，以此作為定性、定量分析的依據)，檢測參數如下表6所示。稱取製備的酸奶3g，加入2g水，1.5g氯化鈉，以及內標鄰二氯苯1μl(濃度185μg/ml)。將稱取好的樣品立即用帶有矽橡膠墊的瓶蓋密封，放入旋轉振蕩器中，50℃平衡30min，用dvb/car/pdms複合萃取頭在50℃下萃取30min，然後進樣，250℃解析5min。圖4所示為不同菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖，其中，圖4(a)所示為本發明的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖，圖4(b)所示為hs-2菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖，圖4(c)所示為yr-4菌株發酵酸奶的風味物質檢測峰圖。風味物質的檢測結果如表7所示。
[0093]
表6風味檢測gc-ms參數
[0094][0095]
表7
[0096]
[0097]
[0098][0099]
如上表7所示檢測結果：本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵酸奶產生50種風味物質，對照菌株hs-2、yr-4發酵酸奶分別產生30種和34種代謝風味物質；並且只有本發明提供的保加利亞乳桿菌dangxiong lbⅲ菌株發酵酸奶中含有番茄特徵風味的關鍵物質-糠醛。
[0100]
以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。