一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法
2023-06-04 14:53:06
專利名稱：一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法
技術領域：
本發明涉及金剛石薄膜電極和生物傳感器領域，特別是一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法。
背景技術：
多巴胺(dopamine，簡稱DA，)作為下丘腦和腦垂體腺中的重要兒茶酚胺類神經遞質，在健康和疾病的控制、預防中起著重要的作用。其含量的改變可導致一些疾病如精神分裂症和帕金森氏症。此外，多巴胺具有興奮心臟、增加腎血流量的功能，可用於治療失血性、 心源性及感染性休克。因此，對其測定方法的研究在臨床應用和相關疾病的診斷方面都具有重要的意義。
傳統檢測多巴胺的方法主要有微透析法、氣相色譜-質譜法、分光光度法、離子色譜法、化學發光法、高效液相色譜法，這些方法一般需要樣品的預處理，體積較大，不便於實現體內的在線監測。
DA分子內含有2個容易被氧化的酚羥基，因而具有電化學活性，可用電化學方法測定其含量。
化學修飾電極是指在電極表面塗敷單分子的、多分子的、離子的或聚合物薄膜，從而改變或改善電極原有性質，實現對電極的功能設計，提高電極作為分析敏感元件的選擇性和靈敏度。利用其製作的電化學傳感器易於操作、價格低廉，倍受分析工作者關注。
生物傳感器是一門由生物、化學、物理、醫學和電子技術等多種學科相互滲透成長起來的高新技術。區別於電化學傳感器的是利用具有分子識別能力的生物活性物質如細胞膜、酶、抗體和核酸修飾電極，以生物活性單元等作為生物敏感基元，通過各種物理、化學型信號轉換器捕捉目標物與敏感基元之間的反應，然後將反應的程度用離散或連續的電信號表達出來，從而對目標檢測物具有高度選擇性的檢測，優點是修飾電極具有更強的生物兼容，選用適當修飾物還可降低檢測電位，提高選擇性。並且蛋白質(酶)與電極之間的直接電子傳遞過程更接近生物氧化還原系統的原始模型，可實現更快的電子傳遞反應。生物傳感器的結構一般由兩個部分組成。其一是生物分子識別元件(感受器)，是具有分子識別能力的生物活性物質如組織切片、細胞、細胞器、細胞膜、酶、抗體和核酸；其二是信號轉換器， 主要有電化學電極(如電位、電流的測量)、光學檢測元件、熱敏電阻、場效應電晶體及表面等離子共振器件。
傳統的生物傳感器電極包括玻碳(glassy carbon，GC)、碳纖維、碳納米管、碳糊和無定形碳及熱解石墨(highly ordered pyrolytic graphite，H0PG)等，在生物傳感器領域有著很廣泛的應用，尤其是GC電極。這是因為碳素類電極具有低廉、容易製備、形狀可控及較寬的電化學勢窗等優點。但是這些碳素類電極材料其本身或反應產物易吸附於電極表面，導致電極鈍化，靈敏度低、及由於表面處理的不一致性造成的低重複性等缺點。
近年來，硼摻雜的金剛石(boron-doped diamond, BDD)膜以其突出的電化學特性和各種潛在的應用前景引起了科學家們的密切關注。硼摻雜的金剛石(BDD)薄膜電極除了具有金剛石的優異性能如高的物理、化學穩定性和良好的生物兼容性外，還擁有一系列突出的電化學特性寬電化學視窗、低背景電流、高阻抗和很好的電化學穩定性。這些優勢使得BDD可以彌補傳統電極在檢測多巴胺上的不足。BDD電極符合理想的電流型生物傳感器的基底材料的要求。然而，到目前為止，有關利用BDD電極作為電流型生物傳感器的基底材料的研究很少。
另外，目前人工合成高純度、納米級摻硼金剛石薄膜多採用MPCVD法，且多數採用 MPCVD在二維平面襯底上沉積薄膜，這在一定程度上限制了薄膜電極形狀，因此傳統摻硼金剛石做電極用於檢測受其形貌、大小限制，不利於檢測的靈活性和靈敏度。主要表現在不利於在腦內植入電極，從而限制了電極檢測多巴胺在臨床上的應用。發明內容
本發明的目的是針對上述存在問題，提供的一種靈敏度高、穩定性好的一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法。
本發明的技術方案
一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法，以尖端狀鎢絲作為基底，在鎢絲上沉積摻硼金剛石薄膜，並對金剛石薄膜表面氨基化處理，然後在摻硼金剛石薄膜上直接製備絡氨酸酶修飾層，鎢絲通過銀膏與導線相連。
所述鎢絲尖端的製備方法，通過將鎢絲一端進行腐蝕而產生尖端，步驟如下
1)將0. 8mm的鎢絲用800#砂紙打磨至表面光滑，在丙酮溶液中超聲清洗5min ；
2)將清洗後的鎢絲放置於體積比為1 1的HF酸與硝酸的混合溶液中進行腐蝕， 鎢絲垂直懸空放置，避免於容器壁接觸，保持時間IOmin ；
3)將腐蝕處理後的鎢絲懸空在丙酮溶液中進行超聲處理5min，氮氣下吹乾；
4)將上述鎢絲置於含有0. 25 μ m金剛砂的丙酮懸濁液中，金剛沙與丙酮的用量比為0. 5mg/ml，超聲Ih進行預處理，然後用去離子水超聲清洗5min，氮氣下吹乾待用。
所述沉積摻硼金剛石薄膜的方法，將預處理後的鎢絲基底放入微波等離子 CVD(MPCVD)反應室，反應室的真空抽至5 XKT4I^a以下，基底溫度為500-600°C，以氫氣作為主氣源，把氫氣分兩路，一路通入混氣室，另一路作為載氣源，通入丙酮和甲醇的混合溶液中作為碳源，混合溶液中丙酮與甲醇的體積比為9 1，同時將化03溶於混合溶液作為硼源， 化03和混合溶液的質量比為1 100，氫氣通過緩慢鼓泡的方式，將含碳、含硼的蒸汽隨氫氣帶入混氣室內，氬氣和氨氣分別進入混氣室，沉積工藝步驟如下
1)形核過程為在鎢絲表面形成金剛石原子核，微波功率為3. 5kW，H2與丙酮和甲醇的混合氣體的體積比為110 1，壓強為20Torr，時間ailin，；
2)生長過程為在鎢絲基底上製備摻硼金剛石薄膜，微波功率5kW，Ar^H2和丙酮與甲醇的混合氣體的體積流量比為40 10 1，反應總壓強為20Torr，時間60Min ；
3)氨基修飾過程經上述步驟後，將功率降至700W，關閉氫氣閥，腔室壓強抽至 lPa，打開Ar、氨氣閥，Ar流量500sccm，氨氣流量3sccm，氣壓201 ，該過程保持IOmin ；
4)降溫過程關閉氨氣閥，在氬氣氣氛下保持IOOTorr真空冷卻到室溫後取出樣片，冷卻至室溫即可得到BDD電極。
所述在摻硼金剛石薄膜電極表面製備絡氨酸酶修飾膜，包括以下步驟
1)將製得的BDD電極在質量百分比濃度為20%的三氟乙酸與二氯甲烷溶劑的混合液中浸泡lh，然後在質量百分比濃度為15%的氨水中浸泡5min，再用去離子水清洗，得到含活化的氨基BDD電極；
2)取0. 3mg酪氨酸酶溶解於10 μ L0. IM磷酸鹽緩衝液(PBS)中，溶液ρΗ為7，將該溶液緩慢地滴加到氨基化的BDD電極表面，直至滴完為止，持續約20min ；
3)在上述電極表面滴定10 μ L濃度為4%的戊二醛水溶液，持續lOmin，將其置於冰箱中4°C下保持12小時；
4)取出電極後用濃度為0. 1M、ρΗ為7的PBS衝洗，將樣品放在冰箱中0°C保存備用。
一種所述摻硼金剛石薄膜電極的應用，用作生物傳感器的生物探針，利用循環伏安法測定多巴胺含量，實現實時檢測多巴胺的活體濃度。
本發明的出發點在於，硼摻雜的金剛石(boron-doped diamond, BDD)薄膜電極具有優異性能如高的物理、化學穩定性和良好的生物兼容性，還擁有突出的電化學特性如寬電化學視窗、低背景電流、高阻抗和很好的電化學穩定性，具備製作高性能檢測電極的優勢；將電極的結構改良做成絲狀，進行適當修飾可應用於體內多巴胺得檢測，有望實現臨床應用。
本發明的創新之處在於，實現了檢測活體多巴胺的濃度。具體表現在以鎢絲做基底，在其上生長摻硼金剛石薄膜，利用了摻硼金剛石特性如寬電化學視窗、低背景電流、高阻抗。摻硼金剛石薄膜電極同時具有生物兼容性好，抗汙染，高穩定性等優點。用絡氨酸酶修飾製作生物電極，可以提高響應時間，還可以降低多巴胺的氧化電位，避開了抗壞血酸 (ascorbic acid, AA)的氧化電位，從而降低幹擾，提高了靈敏度高。通過對BDD表面進行氨基化處理，使得絡氨酸酶更易固化在電極表面，重複檢測效果更好。該探針可置於大腦內部，達到對多巴胺實時原位檢測，植入大腦內部可以對帕金森患者體內多巴胺濃度進行實時檢測。
與現有技術相比，本發明所述的基於摻硼金剛石薄膜電極檢測多巴胺的傳感器具有明顯的優勢，具體表現在以下幾點
1)該摻硼金剛石薄膜電極用於檢測多巴胺具有更好的重複性和電化學穩定性。
2)靈敏度高，線性範圍內檢測極限可達2.0X10_6mol/L。
3)選擇性強，修飾後的BDD電極可以在含有數倍於DA的AA溶液中，把DA、AA的氧化峰有效分離開(ΔΕ可達0. 5V)，且在比較寬的範圍內得到了理想的線性響應關係。
4)極好的抗汙染能力及較長的壽命，摻硼金剛石由於其高的電化學析氧電位，具備自淨化功能，不會產生鈍化汙染現象
5)針狀電極更利於外科手術對傳感器的植入性操作。
圖1為MPCVD製備摻硼金剛石薄膜的氣路示意圖。
圖2為摻硼金剛石薄膜SEM照片。
圖3為W電極上BDD的金相顯微鏡照片，(a)、(b)、(c)分別為倍數100、500、1000 下的照片。
圖4 為 BDD、碳纖維在 0. 5^ei2S04 緩衝溶液中對 ImMpe (CN)6]2V [Fe (CN)6F 的在循環伏安曲線。
圖5為生物探針結構示意圖。
圖中1. BDD電極 2.銀漿 3.環氧樹脂 4.導線具體實施方式
實施例
一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法，以尖端狀鎢絲作為基底，在鎢絲上沉積摻硼金剛石薄膜，並對金剛石薄膜表面氨基化處理，然後在摻硼金剛石薄膜上直接製備絡氨酸酶修飾層，鎢絲通過銀膏與導線相連，具體製備方法如下。
1.製作尖端鎢絲基底結構
1)將8mm的鎢絲用800砂紙打磨至表面光滑，在丙酮溶液中超聲清洗5min ；
2)將鎢絲放置於HF酸與濃硝酸的混合溶液中(V/V = 1 1)，鎢絲垂直懸空放置， 避免於容器壁接觸，保持時間IOmin ；
3)將鎢絲懸空在丙酮溶液中進行超聲處理5min，用氮氣吹乾；
4)鎢絲表面預處理在含0. 25 μ m金剛砂懸濁液的丙酮中超聲lh，金剛沙與丙酮比例為0. 5mg/ml，再用去離子水超聲波清洗5min，在氮氣下吹乾，上述過程避免鎢絲尖端與容器壁的直接接觸。
2、摻硼金剛石薄膜的沉積
將預處理後的燈絲框架結構放入微波等離子CVD(MPCVD)反應室，反應室的氣體真空抽至5 X KT4Pa以下，襯底溫度500°C -600°C,以氫氣作為氣源，把氫氣分兩路，流量均可控，一路通入匯氣室，另一路通入丙酮和甲醇的混合溶液(9 1，V/V)作為碳源，化02和混合溶液的質量比為1 100，氫氣通過緩慢鼓泡的方式，將含硼的蒸汽隨氫氣帶入反應室內，圖1為沉積過程中氣路示意圖，沉積工藝包括
1)形核過程用3. 5kW微波功率在吐和丙酮與甲醇的混合氣體中在鎢絲基底上形核，體積比為110 1，氣體壓強為20Torr，形核時間^iin ；
2)生長過程用5kff微波功率在Ar，H2和丙酮與甲醇的混合氣氛中，在鎢絲基底上製備摻硼金剛石薄膜，流量比為40 10 1，反應總壓強為20Torr，生長時間為60min;
3)氨基修飾過程經上述步驟後，功率降至700W，關閉氫氣閥，Ar閥，打開真空泵， 抽至lPa，打開Ar、氨氣閥，Ar流量500sccm，氨氣流量3sccm，氣壓20Pa，該過程保持IOmin ；
4)降溫過程關閉氨氣閥，在氬氣氣氛下保持IOOTorr真空冷卻到室溫後取出樣片，逐漸冷卻。
摻硼金剛石薄膜的沉積過程中各階段的工藝參數匯總見表1。
表 權利要求
1.一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法，其特徵在於以尖端狀鎢絲作為基底，在鎢絲上沉積摻硼金剛石薄膜，並對金剛石薄膜表面氨基化處理，然後在摻硼金剛石薄膜上直接製備絡氨酸酶修飾層，鎢絲通過銀膏與導線相連。
2.根據權利要求1所述用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法，其特徵在於所述鎢絲尖端的製備方法，通過將鎢絲一端進行腐蝕而產生尖端，步驟如下1)將0.8mm的鎢絲用800#砂紙打磨至表面光滑，在丙酮溶液中超聲清洗5min ；2)將清洗後的鎢絲放置於體積比為1 1的HF酸與硝酸的混合溶液中進行腐蝕，鎢絲垂直懸空放置，避免於容器壁接觸，保持時間IOmin ；3)將腐蝕處理後的鎢絲懸空在丙酮溶液中進行超聲處理5min，氮氣下吹乾；4)將上述鎢絲置於含有0.25 μ m金剛砂的丙酮懸濁液中，金剛沙與丙酮的用量比為 0. 5mg/ml，超聲Ih進行預處理，然後用去離子水超聲清洗5min，氮氣下吹乾待用。
3.根據權利要求1所述用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法，其特徵在於所述沉積摻硼金剛石薄膜的方法，將預處理後的鎢絲基底放入微波等離子CVD(MPCVD) 反應室，反應室的真空抽至5X 10_4Pa以下，基底溫度為500-600°C，以氫氣作為主氣源，把氫氣分兩路，一路通入混氣室，另一路作為載氣源，通入丙酮和甲醇的混合溶液中作為碳源，混合溶液中丙酮與甲醇的體積比為9 1，同時將B2O3溶於混合溶液作為硼源，化03和混合溶液的質量比為1 100，氫氣通過緩慢鼓泡的方式，將含碳、含硼的蒸汽隨氫氣帶入混氣室內，氬氣和氨氣分別進入混氣室，沉積工藝步驟如下1)形核過程為在鎢絲表面形成金剛石原子核，微波功率為3.5kW，H2與丙酮和甲醇的混合氣體的體積比為110 1，壓強為20Torr，時間aiiin，；2)生長過程為在鎢絲基底上製備摻硼金剛石薄膜，微波功率5kW，Ar、H2和丙酮與甲醇的混合氣體的體積流量比為40 10 1，反應總壓強為20Torr，時間60Min;3)氨基修飾過程經上述步驟後，將功率降至700W，關閉氫氣閥，腔室壓強抽至IPaJT 開Ar、氨氣閥，Ar流量500sccm，氨氣流量3sccm，氣壓20Pa，該過程保持IOmin ；4)降溫過程關閉氨氣閥，在氬氣氣氛下保持IOOTorr真空冷卻到室溫後取出樣片，冷卻至室溫即可得到BDD電極。
4.根據權利要求1所述用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法，其特徵在於所述在摻硼金剛石薄膜電極表面製備絡氨酸酶修飾膜，包括以下步驟1)將製得的BDD電極在質量百分比濃度為20%的三氟乙酸與二氯甲烷溶劑的混合液中浸泡lh，然後在質量百分比濃度為15%的氨水中浸泡5min，再用去離子水清洗，得到含活化的氨基BDD電極；2)取0.3mg酪氨酸酶溶解於10 μ L0. IM磷酸鹽緩衝液(PBS)中，溶液ρΗ為7，將該溶液緩慢地滴加到氨基化的BDD電極表面，直至滴完為止，持續約20min ；3)在上述電極表面滴定10μ L濃度為4%的戊二醛水溶液，持續lOmin，將其置於冰箱中4°C下保持12小時；4)取出電極後用濃度為0.1Μ、ρΗ為7的PBS衝洗，將樣品放在冰箱中0°C保存備用。
5.一種如權利要求1所述摻硼金剛石薄膜電極的應用，其特徵在於用作生物傳感器的生物探針，利用循環伏安法測定多巴胺含量，實現實時檢測多巴胺的活體濃度。
全文摘要
一種用於檢測多巴胺的摻硼金剛石薄膜電極的製備方法，以尖端狀鎢絲作為基底，在鎢絲上沉積摻硼金剛石薄膜，並對金剛石薄膜表面氨基活化處理，然後在摻硼金剛石薄膜上直接製備絡氨酸酶修飾層，鎢絲通過銀膏與導線相連；該摻硼金剛石薄膜電極用作生物探針，利用循環伏安法測定多巴胺含量，實現實時檢測多巴胺的活體濃度。本發明的優點是用於檢測多巴胺具有更好的重複性和電化學穩定性，靈敏度高、選擇性強，修飾後的BDD電極可以在含有數倍於DA的AA溶液中，把DA、AA的氧化峰有效分離且在比較寬的範圍內得到了理想的線性響應關係；極好的抗汙染能力及較長的壽命，不會產生鈍化汙染現象，針狀電極更利於外科手術對傳感器的植入性操作。
文檔編號G01N27/333GK102520042SQ20111042882
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者尹振超, 張喻, 張聰聰, 戴瑋, 曲長慶, 朱寧, 申鳳婷, 陳凱玉 申請人:天津理工大學