一種子癇前期樣動物模型的構建方法及其應用
2024-04-16 07:43:05
1.本發明屬於醫藥生物技術領域，涉及一種子癇前期樣動物模型的構建方法及其應用，尤其涉及一種具有子癇前期典型臨床特徵的動物模型的構建方法及其應用。
背景技術：
2.子癇前期(preeclampsia,pe)是一種嚴重威脅孕產婦及胎兒健康的妊娠期特有疾病，以妊娠20周後出現高血壓和蛋白尿為主要臨床特徵，同時累及多器官並影響胎兒生長發育，嚴重時可引起孕產婦及胎兒的死亡。但對於pe的治療，目前尚無有效的幹預藥物，終止妊娠是有效的治療手段。而過早的終止妊娠又帶來了大量的早產兒、低出生體重兒的出現，圍產兒發病率和嬰幼兒致殘率增高，由此造成了大量的社會負擔和公共衛生成本支出。
3.pe被認為是多病因、多機制、多階段發展的複雜病理過程。目前認為其發病機制與胎盤功能不良、子宮螺旋動脈重塑障礙、氧化應激、免疫耐受、全身炎症反應、血管生成失衡、內皮功能障礙等有關。根據國內外研究，pe發病機制主要包括兩階段假說。第一階段是由母體面螺旋動脈重鑄不良和胎兒面血管生成受限導致的胎盤血管異常，繼而造成胎盤血氧供應不足造成氧化應激，誘導滋養細胞凋亡和內皮細胞損傷，再度阻礙胎盤血管生成，形成惡性循環；第二階段是由於胎盤氧化應激釋放大量的炎症介質和抗血管生成因子進入體循環導致全身的多臟器內皮損傷、血管痙攣，產生各種pe臨床症狀。胎盤血管源性失調被認為是pe發病及發生病理生理變化的主要原因。在妊娠早期母體滋養細胞侵襲障礙，使子宮螺旋動脈重塑失敗，可引發胎盤血流灌注不足繼發不良胎盤形成。胎盤源性的抗血管生成因子可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fins-like tyrosine kinase receptor-l,sflt-1)和可溶性內皮糖蛋白(soluble endoglin,seng)與促血管內皮生成因子(vascular endothelial growth factor,vegf)及胎盤生長因子(placental growth factor,plgf)的失衡被認為是是導致胎盤血管生成異常和母胎循環失調的重要原因。
4.因此構建出高血壓、蛋白尿、肝腎功能障礙、血管生成相關因子紊亂、胎盤血管新生障礙、胎兒發育受限等具有pe典型臨床特徵的理想動物模型，對pe的病因學研究和臨床治療都顯得尤為重要。
5.cn112941102a公開了一種子癇前期小鼠動物模型的構建方法及其應用，所述構建方法為降低小鼠中m6a修飾水平，獲得rna m6a修飾水平降低的突變體小鼠即為子癇前期小鼠動物模型；具體通過es打靶技術構建了mettl3+/-雜合突變小鼠，所述突變體小鼠對pe誘導劑敏感性增加，呈現pe的特點。cn114451358a公開了一種子癇前期疾病動物模型，以sirt1+/-全身敲除雜合子孕鼠為子癇前期疾病動物模型。該模型能比較完整還原子癇前期疾病發生。
6.現有技術中呈現的子癇前期樣動物模型的構建方法相對複雜，且缺乏對pe模型構建前的篩選以及對pe模型系統的評價體系，這局限了對pe的進一步深入研究，因此建立具有pe典型臨床特徵的動物模型，並完善相關評價體系，對深入研究pe的病因、發生發展機制和治療方案均具有重要意義。
技術實現要素：
7.針對現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種子癇前期樣動物模型的構建方法及其應用，尤其提供一種具有子癇前期典型臨床特徵的動物模型的構建方法及其應用。
8.為達到此發明目的，本發明採用以下技術方案：
9.第一方面，本發明提供一種子癇前期樣動物模型的構建方法，所述構建方法包括：在雌鼠妊娠期間給予n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽，得到所述子癇前期樣動物模型。
10.本發明所涉及的子癇前期樣動物模型的構建方法創造性地採用給予妊娠雌鼠n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽的方式，構建過程簡單可行，經過系統的子癇前期樣動物模型評價方法驗證後，該方法構建的子癇前期樣鼠具有高血壓、蛋白尿、肝腎功能障礙、血管生成相關因子紊亂、胎盤血管新生障礙、胎兒發育受限等子癇前期典型臨床特徵，和子癇前期患者的表現高度相似，具有很好的臨床症狀模擬性，這對深入研究pe的病因、發生發展機制和治療方案均具有重要意義。
11.優選地，所述雌鼠選自雌大鼠或雌小鼠。
12.優選地，所述大鼠包括sd大鼠、wistar大鼠或lewis大鼠；所述小鼠包括c57bl/6小鼠或balb/c小鼠。
13.優選地，所述給予n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽的方式包括皮下注射、皮內注射、腹腔注射。
14.所述n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽示例性地可以以生理鹽水溶液的方式進行注射給予，注射部位可以選擇頸部、腋下、前肢、後肢、後背、腹腔等。
15.優選地，所述給予n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽的起始時間點選自雌鼠妊娠第7-9天，例如第7天、第8天、第9天；結束時間點選自雌鼠妊娠第9天至妊娠結束，例如第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天等。
16.所述n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽自雌鼠妊娠第7-9天開始直到妊娠第9天-妊娠結束持續每天給予，在第9天至妊娠結束期間模型均構建成功。
17.優選地，所述n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽的給予劑量為50-80mg/kg/d，例如50mg/kg/d、52mg/kg/d、54mg/kg/d、55mg/kg/d、56mg/kg/d、58mg/kg/d、60mg/kg/d、65mg/kg/d、70mg/kg/d、75mg/kg/d、80mg/kg/d等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
18.選擇n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽的給予劑量為50-80mg/kg/d，構建得到的動物模型的子癇前期樣病變程度比較適中，既具有明顯的子癇前期病變症狀，也能在藥物的治療下逐漸好轉。
19.第二方面，本發明提供根據第一方面所述的子癇前期樣動物模型的構建方法在篩選子癇前期治療候選藥物中的應用。
20.第三方面，本發明提供根據第一方面所述的子癇前期樣動物模型的構建方法在子癇前期發生發展機制研究中的應用。
21.相對於現有技術，本發明具有以下有益效果：
22.本發明所涉及的子癇前期樣動物模型的構建方法創造性地採用給予妊娠雌鼠n-硝基-l-精氨酸甲酯或其鹽的方式，構建過程簡單可行，經過系統的子癇前期樣動物模型評價方法驗證後，該方法構建的子癇前期樣鼠具有高血壓、蛋白尿、肝腎功能障礙、血管生成
相關因子紊亂、胎盤血管新生障礙、胎兒發育受限等子癇前期典型臨床特徵，和子癇前期患者的表現高度相似，具有很好的臨床症狀模擬性，這對深入研究pe的病因、發生發展機制和治療方案均具有重要意義。
附圖說明
23.圖1是模型構建前兩組雌鼠體重對比統計圖；
24.圖2是模型構建前兩組雌鼠收縮壓對比統計圖；
25.圖3是模型構建前兩組雌鼠24h尿蛋白濃度對比統計圖；
26.圖4是雌鼠陰道塗片圖；
27.圖5是雌鼠陰道栓圖；
28.圖6是對照組和子癇前期組胎鼠、胎盤生長發育情況統計圖。(a)對照組和子癇前期胎鼠數量對比；(b)對照組和子癇前期組胎盤重量對比；(c)對照組和子癇前期組胎鼠重量對比；(d)對照組和子癇前期組胎鼠頂臀長對比；
29.圖7是對照組與子癇前期組不良妊娠結局對比圖；
30.圖8是對照組和子癇前期組孕鼠血清中vegf-a、plgf、sflt1濃度變化統計圖；
31.圖9是對照組與子癇前期組胎盤、腎臟、肝臟結構he染色圖(200倍)；
32.圖10是兩組孕鼠胎盤組織cd34免疫螢光表達情況對比圖，藍色：dapi，紅色：cd34，標尺：50μm；
33.圖11是兩組孕鼠cd34免疫螢光染色陽性細胞量化分析統計圖；
34.圖12是western blotting檢測兩組孕鼠胎盤組織中cd34表達情況圖；
35.圖13是灰度值分析兩組孕鼠cd34表達水平統計圖；
36.圖14是妊娠期對照組和子癇前期模型組體重變化情況統計圖；
37.圖15是妊娠期對照組和子癇前期模型組收縮壓變化情況統計圖；
38.圖16是妊娠期對照組和子癇前期模型組24h尿蛋白濃度變化情況統計圖。
具體實施方式
39.下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
40.下述實施例中涉及的n-硝基-l-精氨酸甲酯為購自於麥克林型號為n814751的產品，用生理鹽水配製成溶液進行使用。
41.實施例1
42.模型構建前雌鼠的篩選，步驟如下：
43.(1)以未交配的7-8周齡c57bl/6j雌鼠和雄鼠為研究對象，適應性餵養一周後，雌鼠隨機分為正常對照組(control，con)和子癇前期模型組(preeclampsia，pe)(n＝7)。
44.(2)雌鼠在與雄鼠合籠前對其體徵進行評價，包括尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，sbp)、24小時尿蛋白濃度以及體重。將尾靜脈收縮壓穩定且小於130mmhg、24小時尿蛋白濃度和體重與正常對照組相比無統計學差異的雌鼠納入實驗。
45.(2.1)其中，在合籠前一周開始每天訓練雌鼠測量尾動脈收縮壓，以確保在實驗期間測量收縮壓時，雌鼠可以保持較長時間安靜不動。雌鼠收縮壓測定方法如下：
46.打開智能無創血壓計(bp-2010a)，將保溫筒溫度設為37℃後，預熱10分鐘；將雌鼠放入鼠袋中，露出鼠尾，頭部裝入鼠網，將包裹好的雌鼠置於37℃保溫筒內，舒適體位，安撫其情緒，儘量保持安靜；將感應器置於鼠尾根部，監測雌鼠尾部的血流；待脈波穩定時開始測量，並於10min內測完，期間注意安撫雌鼠，可適當撫摸小鼠尾部；記錄測得收縮壓，每隻雌鼠記錄5個數值以上，取雌鼠安靜狀態下連續3組組內差異小於6mmhg的收縮壓值，計算其均值作為當日該鼠所測血壓值。
47.(2.2)其中，雌鼠24h尿蛋白濃度測定方法如下：
48.將雌鼠置於組裝好的相對無菌的小鼠代謝籠中，期間禁食確保雌鼠可以自由飲水；用封口膜封閉尿杯，減少與代謝籠的連接處尿液蒸發；收集雌鼠24h尿液，將尿杯中的尿液轉移到無菌的離心管中；收集的尿液在3000rpm，4℃，10分鐘離心後，上清液轉移到新的高壓滅菌離心管中，記錄總尿量並做好標記。
49.取0.8ml蛋白標準配置液加入到20mg蛋白標準品中，充分溶解後配置成25mg/ml的蛋白標準品溶液；取20μl 25mg/ml蛋白標準品，加入980μl生理鹽水配製成0.5mg/ml蛋白標準品；按50:1體積配置bca工作液，50體積bca試劑a加入1體積bca試劑b；將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的標準品孔中，加入生理鹽水補足到20μl，相當於標準品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；小鼠尿液提前從冰箱取出復溫溶解，使用生理鹽水稀釋20倍充分混勻後置於冰上，向樣品孔中每孔加入20μl稀釋後的樣品；在標準品孔和樣品孔中每孔各加入200μl bca工作液，37℃孵育箱中孵育30min；酶標儀於562nm處讀取吸光光度值(od值)，根據標準曲線和樣品稀釋倍數計算樣品的蛋白濃度。
50.結果如圖1、圖2、圖3所示，兩組雌鼠在模型構建前體重、收縮壓、24h尿蛋白濃度均無統計學差異(p＜0.05)，兩組雌鼠收縮壓均小於130mmhg，收縮壓正常且穩定，可以進行後續實驗。
51.(3)雌鼠陰道塗片判斷發情周期，將處於發情期的雌鼠與雄鼠進行合籠：
52.(3.1)雌鼠適應性餵養1周後，晚上20點使用一次性無菌棉籤對雌鼠陰道分泌物進行塗片；
53.(3.2)棉籤用生理鹽水潤溼後，插進雌鼠陰道旋轉3次後取出，棉籤頭不宜過大，潤溼前可將棉花拆掉一部分，操作時動作應儘量輕柔；
54.(3.3)儘量將棉籤上脫落的細胞全部均勻塗抹在在載玻片上，稍微晾乾後，蓋上蓋玻片；
55.(3.4)在螢光顯微鏡下進行觀察，判斷雌鼠是否處於發情期。
56.結果如圖4所示，根據小鼠發情周期陰道塗片狀況，發現塗片中有很多無核的角化鱗狀細胞，邊緣不整齊，視野中有很少白細胞和上皮細胞。此時小鼠接受交配，卵巢上濾泡生長迅速。
57.(4)將處於發情期的雌鼠和雄鼠按照2:1進行合籠，次日早晨8點，觀察雌鼠陰道栓出現情況，將檢查到陰栓的雌鼠(如圖5所示)記為妊娠第零天(gd0)，並與未懷孕的小鼠分籠。
58.(5)每日對孕鼠體重進行稱量，記錄孕鼠體重變化。
59.(6)每3天測定孕鼠收縮壓，收集孕鼠24h尿液，監測孕鼠收縮壓和尿蛋白濃度變化。
60.實施例2
61.子癇前期樣動物模型的構建及評價，步驟如下：
62.(1)自妊娠第七天起，每日對雌鼠頸部皮下注射n-硝基-l-精氨酸甲酯60mg/kg/d，根據孕鼠每日體重調整給藥劑量，直至妊娠第十七天結束。
63.(2)每日對孕鼠體重進行稱量，記錄孕鼠體重變化。
64.(3)每3天測定孕鼠收縮壓，收集孕鼠24h尿液，監測孕鼠收縮壓和尿蛋白濃度變化。
65.(4)於妊娠第十八天，眼眶取血，收集孕鼠血清，酶聯免疫吸附法檢測孕鼠血清中vegf-a、plgf、sflt1表達水平，具體如下：
66.(4.1)將內徑為0.9-1mm的玻璃毛細管，臨用前折斷為長1-1.5cm的段，浸入1％的肝素溶液中，乾燥後使用；
67.(4.2)根據孕鼠體重配置水合氯醛溶液，給藥量為500mg/kg，腹腔注射後，待孕鼠無瞳孔反射即為麻醉成功；
68.(4.3)左手抓住鼠兩耳間的頸背部皮膚固定頭部，輕輕壓迫頸部兩側引起頭部靜脈血流回流困難，使眼眶筋脈叢充血，右手持毛細管由內眥部插入結膜，輕輕向眼底部方向推進，旋轉毛細管以劃破筋脈叢，使血液順毛細管流出，接收入無菌的離心管內；
69.(4.4)20℃下靜置1h，待其凝固後，3000rpm，4℃，10分鐘離心，吸取上清至另一無菌的離心管中，酶聯免疫吸附法檢測孕鼠血清中vegf-a、plgf、sflt1表達水平。
70.(5)孕鼠頸部脫臼處死後，沿腹水平線剪開兩側皮膚，分離出胎珠，使用組織剪剪破子宮，暴露羊膜包裹的胎鼠和胎盤，小心分離胎盤和胎鼠，在遇冷的生理鹽水中衝洗乾淨，統計兩組孕鼠的妊娠結局，具體如下：
71.(5.1)自子宮遠端沿子宮血管網對側剪開子宮，依次取出胎仔和胎盤，記錄胎仔和胎盤個數。
72.(5.2)剔除胎盤上的胎膜和相連的臍帶，剪除於胎仔相連的臍帶，將胎仔和胎盤在吸水紙上吸乾血跡和羊水，分析天平進行稱重，精確至0.001g。
73.(5.3)觀察胚胎丟失情況，正常組小鼠的胚胎粗大，似串珠狀，胚胎顏色為淡紅色，小鼠宮內無明顯痕血；流產的胚胎，肉眼可見其顏色多呈黑褐色，部分小鼠子宮呈現竹節樣改變，宮內可以見到明顯痕血，胚胎有部分甚至完全的消失。
74.(5.4)胎仔外觀與大體畸形：觀察胎仔發育狀況。
75.(5.5)胎仔生長受限：低於同孕齡胎仔體重的第十百分位數。
76.(5.6)胎盤早剝：胎盤周圍有陳舊性血塊。
77.(5.7)頂臀長：將胎仔置於直尺上使其頭部、頂部和尾根部均位於一條直線上，其頭頂至尾根部的距離即頂臀長。
78.(6)留取孕鼠腎臟、肝臟、胎盤，4％中性甲醛固定24h以上，石蠟包埋，5μm連續切片，he染色。
79.(7)對胎盤組織進行cd34免疫螢光試驗，採用western blotting(wb)檢測胎盤組織中cd34表達情況。
80.子癇前期樣小鼠模型的評價結果如下：
81.(1)兩組平均胎鼠數量(a)、胎盤重量(b)、胎鼠重量(c)和胎鼠頂臀長(d)對比統計
結果如圖6所示，對照組相比，子癇前期組胎鼠數量、胎鼠重量、胎盤重量和胎鼠頂臀長均小於對照組，差異有統計學意義(p＜0.05)。
82.(2)兩組孕鼠不良妊娠結局如圖7所示，與對照組相比，子癇前期組出現流產胚胎，胎珠可見黑褐色竹節樣改變，子宮內可見明顯血痕，部分胚胎可見完全消失，胎鼠和胎盤也出現發育不良狀況，胎鼠顏色較正常胎鼠偏白，未發育成形，出現宮內生長受限的情況，胎盤較正常胎盤小，顏色發白，血管稀疏。
83.(3)兩組孕鼠血清vegf-a、plgf、sflt1表達水平統計圖如圖8所示，與對照組相比，子癇前期組模型組體循環內血管生成因子vegf-a和plgf水平明顯降低，差異有統計學意義(p《0.01)，而抗血管生成因子sflt1顯著升高，差異有統計學意義(p《0.001)。子癇前期組體循環內血管生成相關因子表達顯著失衡。
84.(4)兩組孕鼠胎盤、腎臟、肝臟組織病理變化如圖9所示，兩組孕鼠胎盤組織he染色(200倍)顯示正常組組織胎盤各層結構清晰，蛻膜組織內蛻膜細胞數量豐富、分布均勻，滋養層可見胞核較大的滋養細胞，迷路層毛細血管數量豐富，毛細血管腔內紅細胞數量豐富，而子癇前期組胎盤蛻膜層血管腔內偶見纖維蛋白團，迷路層多見鈣化灶，偶見滋養細胞團。
85.腎臟組織he染色顯示正常組組織腎臟組織表面被膜由厚薄均勻的緻密結締組織構成，腎實質為淺層皮質和深層髓質，皮質髓質分界明顯，皮質中腎小球分布均勻，腎小球中細胞數量以及基質均勻，腎小管上皮細胞圓潤、飽滿，刷狀緣排列整齊規則，髓質未見明顯異常，泌尿小管之間結締組織為腎間質，間質無明顯增生，而子癇前期組腎臟少見腎小管上皮細胞變性，細胞腫脹，胞質疏鬆淡染，腎小囊內少見嗜酸性物。
86.肝臟組織he染色顯示正常肝臟組織被膜由厚薄均勻的富含彈性纖維緻密結締組織構成，肝小葉中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細胞和肝血竇，肝細胞圓潤、飽滿；肝板排列規則、整齊，肝竇無明顯擴張或擠壓，相鄰肝小葉之間的門管區無明顯異常，而子癇前期組肝臟可見肝臟組織局部可見壞死灶，呈無結構的嗜酸性物，壞死灶內肝細胞胞核固縮深染、碎裂或溶解消失，周圍並伴有較多的粒細胞浸潤。
87.(5)免疫螢光染色檢測孕鼠胎盤cd34表達結果，cd34用於標記血管內皮細胞的細胞膜，可形成著色陽性的環狀管腔，能夠清楚地反映新生血管的狀態，檢測微血管密度的變化。如圖10所示，子癇前期組胎盤cd34表達較對照組明顯減低；cd34免疫螢光染色陽性細胞量化分析結果如圖11所示，與對照組相比子癇前期組cd34陽性細胞數顯著低於對照組(p＜0.05)。
88.(6)western blotting檢測孕鼠胎盤cd34表達結果，如圖12所示，子癇前期組孕鼠胎盤組織cd34表達較對照組減少；灰度值分析cd34相對表達量，如圖13所示，發現子癇前期組胎盤組織cd34表達量較正常組顯著減低(p＜0.05)。
89.(7)兩組在雌鼠妊娠期間持續監測體重、收縮壓、24h尿蛋白濃度變化，記錄gd1(妊娠第1天)、gd5、gd9、gd13和gd17的上述各項指標變化，兩組孕鼠孕期體重變化情況如圖14所示，與對照組相比，模型組孕鼠體重增長較慢，但兩組孕鼠孕期體重變化無統計學意義(p＞0.05)。
90.兩組孕鼠孕期收縮壓變化情況如圖15所示，兩組孕鼠在gd7皮下注射n-硝基-l-精氨酸甲酯前收縮壓無統計學意義(p＞0.05)，子癇前期組自gd7皮下注射n-硝基-l-精氨酸甲酯後，gd9血壓即開始升高並持續至gd17，明顯高於對照組和自身gd1收縮壓水平(p＜
0.01)。
91.小鼠代謝籠留取孕鼠24小時尿，bca法測24小時尿蛋白，兩組孕鼠孕期尿蛋白濃度變化情況如圖16所示，對照組與子癇前期組在gd7皮下注射n-硝基-l-精氨酸甲酯前，24小時尿蛋白差異無統計學意義(p》0.05)，子癇前期組在gd7給藥後，尿蛋白濃度明顯增加，較對照組和自身未給要藥前尿蛋白濃度顯著升高，差異有統計學意義(p＜0.01)。
92.綜上所述，本發明所涉及的方法構建的動物模型能夠出現高血壓、蛋白尿、宮內生長受限、肝腎、胎盤功能異常、胚胎丟失、體循環血管生成相關因子表達紊亂、胎盤血管新生障礙等臨床子癇前期臨床特點，是進行子癇前期研究的理想模型。
93.申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的一種子癇前期樣動物模型的構建方法及其應用，但本發明並不局限於上述實施例，即不意味著本發明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
94.以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。
95.另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。