青蒿醛雙鍵還原酶DBR1及其重組菌在製備二氫‑β‑紫羅蘭酮中的應用的製作方法
2023-12-12 07:22:42
本發明屬於天然芳香單體物質製備領域，具體涉及一種青蒿醛雙鍵還原酶dbr1及其重組菌在製備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用。
背景技術：
紫羅蘭酮類化合物作為調香中不可缺少的原香料，大量的使用於幾乎所有的日用香精配方中。據相關資料統計，紫羅蘭酮類香料我國生產能力相對較弱，且品種規格單調，絕大多數為紫羅蘭酮和甲基紫羅蘭酮，遠不能滿足市場需求。二氫-β-紫羅蘭酮，俗稱「桂花王」，是桂花精油中一種主要的香氣物質，其香味醇厚、甘甜，具有新鮮柏木香型。目前二氫-β-紫羅蘭酮的生產大多來自於化學合成，不僅生產成本較高，效益低，而且不能作為一種天然的產品進行銷售，其合成產物的效果和「非天然性」的安全性則難以滿足食品和天然日化行業的需求。而從芳香植物中提取則存在成本高、缺乏有效的產物分離手段，並且極大的受限於農業種植以及所有能對農業種植產生影響的諸多因素。通過現代合成生物學生產諸如二氫-β-紫羅蘭酮等芳香類物質是一個嶄新的可持續生產方式。該法是模擬天然植物代謝過程生產出芳香化合物，這些化合物已被歐洲和美國定義為「天然的」並被認為是生產較安全的、高生物活性的香味化合物及其複合物最有前途的方法。
以β-紫羅蘭酮為底物，利用現代合成生物學製備二氫-β-紫羅蘭酮核心的關鍵技術就是需要找到高效的轉化酶，國內外還沒有相關的研究報導。僅僅是有一些轉化不飽和醛酮的相關酶及其基因方面的研究報導，但是酶具有專一性，且有些酶屬於絕對專一性，底物的結構不同，甚至有細微的差異都會影響到酶學的特性及轉化的效率。而且，天然產物的合成生物學或生物催化轉化來源的酶可以打破種的界限，可以來源於本身植物中酶，也可以來源於其它植物的酶，甚至是來源於微生物的酶。二氫-β-紫羅蘭酮俗稱「桂花王」，是植物桂花中的特徵的香氣物質，桂花植物中存在一種生物酶，可以將β-紫羅蘭酮轉化為二氫-β-紫羅蘭酮。但通過大量的篩選和研究，有望能獲得顯著高於原來植物中的轉化水平。2006年美國加州大學伯克利分校的keasling實驗室將來源於不同生物的基因進行設計、組裝，最後在酵母中構建了一條非天然的代謝途徑用於大量合成青蒿素的前體—青蒿酸。2010年ajikumar等在大腸桿菌中重建紫杉二烯的合成途徑，成功獲得了這一紫杉醇的中間體。
本發明模擬天然植物代謝過程，在植物體外生物轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮，並首次發現了一種具有較高轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮能力的非桂花植物來源的雙鍵還原酶基因，在此基礎上，通過基因工程技術獲得催化性能穩定的基因重組菌pet-28a-dbr1。該重組菌及其分泌的酶對β-紫羅蘭酮環外雙鍵有較強的催化加氫能力。本發明建立了一種能在植物體外高效生物轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮的方法。
技術實現要素：
解決的技術問題：本發明提供一種青蒿醛雙鍵還原酶dbr1及其重組菌在製備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用，突破了在植物體外生物轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮技術瓶頸，從大量的雙鍵還原酶中篩選獲得了一種能高效轉化β-紫羅蘭酮製備二氫β-紫羅蘭酮的生物酶。同時，首次建立了全細胞轉化及酶法轉化β-紫羅蘭酮製備二氫β-紫羅蘭酮技術體系，實現了體外製備二氫β-紫羅蘭酮的可持續、低成本、高得率的綠色生產方式。
技術方案：青蒿醛雙鍵還原酶dbr1或其重組菌在體外轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用。
上述青蒿醛雙鍵還原酶dbr1的核酸序列如seqidno:2所示。
應用方案之一，步驟為：稱取0.484gβ-紫羅蘭酮用無水乙醇定容到10ml，配成250mmol/lβ-紫羅蘭酮溶液；向5mllb培養基中加入50μl50mg/ml卡那黴素，接入500μl含有青蒿醛雙鍵還原酶dbr1基因的工程菌；37℃培養至od600為0.4-2.0，加入50-300μlβ-紫羅蘭酮溶液；加入1mol/liptg0-50μl；在22-42℃下培養6-27小時；加入1ml氯仿萃取。
應用方案之二，步驟為：稱取0.0481gβ-紫羅蘭酮，用無水乙醇溶解定容到10ml，配成25mmol/lβ-紫羅蘭酮溶液；總反應體系500μl，加入20μl25mmol/lβ-紫羅蘭酮，加入360μl50mmol/l20-50℃ph6.5tris-hcl緩衝液，再加入10μl100mmol/ldtt以及10μl50mmol/l還原輔酶nadph，最後加入100μl青蒿醛雙鍵還原酶dbr1酶液，酶添加量為20-50u/mg；45℃反應10-60min；1ml氯仿終止反應並萃取。
一種體外轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮的方法，製備體系中含有青蒿醛雙鍵還原酶dbr1或其重組菌。
取萃取液進行氣相檢測。氣相條件：美國安捷倫6890氣相色譜，毛細管柱hp5，氫火焰離子化檢測器，進樣口溫度250℃，檢測器溫度250℃。升溫程序：50℃恆溫2min，50到120℃10℃/min。120℃恆溫2min,線性升溫從120-200℃，5℃/min,200℃恆溫5min。
有益效果：篩選獲得一種來源於青蒿的青蒿醛雙鍵還原酶dbr1，該酶可以高效轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮。在試驗最佳條件下，來源於青蒿的青蒿醛雙鍵還原酶dbr1轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮產量是來源於青蒿的青蒿醛雙鍵還原酶dbr2的270倍，是來自於一種芽孢桿菌的雙鍵還原酶產量的770倍，是來自於桂花並與dbr2有78％相似性的一種還原酶產量的256倍。在加入40μl1mol/liptg，初始od600為1.8，加入250μl250mmol/lβ-紫羅蘭酮-乙醇溶液在27℃條件下轉化18小時，二氫-β-紫羅蘭酮產量達308.3mg/l。酶轉化反應體系為500μl，其中β-紫羅蘭酮濃度為1mmol/l，酶添加量約為30u/mg，反應在ph6.5，45℃下反應60min，二氫β-紫羅蘭酮濃度為76.49mg/l，底物有效轉化率為78.77％。
附圖說明
圖1為不同iptg終濃度對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；
圖2為考察不同溫度對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；
圖3為考察不同初始od600對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；
圖4為考察不同催化轉化時間對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；
圖5為考察不同溶劑對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；
圖6為考察不同底物加入量對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；
圖7為基因工程菌pet-28a-dbr1轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖；
圖8為基因工程菌pgex-4t1--dbr2轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖；
圖9為基因工程菌pet-28a-bacoye1轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖；
圖10為基因工程菌pgex-4t1-2687轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖；
圖11為空白對照試驗萃取液氣質檢測總離子圖；
圖12為青蒿醛雙鍵還原酶1最適反應溫度的測定圖；
圖13為青蒿醛雙鍵還原酶1最適ph測定圖；
圖14為青蒿醛雙鍵還原酶1溫度穩定性測定；
圖15為青蒿醛雙鍵還原酶1ph穩定性測定；
圖16為測定上清液中青蒿醛雙鍵還原酶1活力以及產物二氫β-紫羅蘭酮的產量來評價不同表達條件的效果圖；
圖17為考察溫度對誘導產酶活力的影響圖；
圖18為考察初始od600對誘導產酶活力的影響圖；
圖19為考察時間對誘導產酶活力的影響圖；
圖20-1為0min的樣品利用gc進行成分檢測圖。
圖20-2為10min的樣品利用gc進行成分檢測圖。
圖20-3為20min的樣品利用gc進行成分檢測圖。
圖20-4為30min的樣品利用gc進行成分檢測圖。
圖20-5為60min的樣品利用gc進行成分檢測圖。
具體實施方式
實施例1
1、重組質粒pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687的獲得
全基因合成並通過大腸桿菌密碼子偏好性優化芽胞桿菌老黃酶2基因(bacoye1)、青蒿醛雙鍵還原酶1基因(dbr1)以及青蒿醛雙鍵還原酶2基因(dbr2)，以及在桂花轉錄組(sraaccessionnumbersrp057917)中所得到的與青蒿醛雙鍵還原酶2有最高78％的相似性的unigene(cl2687.contig2_all)。其核苷酸序列如seqidno:1-4，將其連接到pet-28a以及pgex-4t1質粒上，獲得重組質粒命名為pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687。
sequence1：pet-28a-bacoye1核酸序列
sequence2：pet-28a-dbr1核酸序列
sequence3：pgex-4t1-dbr2核酸序列
sequence4:pgex-4t1-2687核酸序列
2、重組基因工程菌的構建
分別將重組質粒pgex-4t1-2687、pgex-4t1-dbr2、pet-28a-dbr1以及pet-28a-bacoye1轉化大腸桿菌bl21(de3)宿主菌(購自novagen公司)，分別在含有氨苄黴素(100μg/ml)和卡那黴素(50μg/ml)的lb平板(lb培養基：胰蛋白腖10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，瓊脂15g/l)上經過37℃培養過夜，挑轉化子到5ml含有抗性的lb培養基中37℃，200rpm振蕩培養。
3、基因工程菌轉化β-紫羅蘭酮製備二氫-β-紫羅蘭酮系列條件優化
(1)適宜的iptg加入量：稱取0.484gβ-紫羅蘭酮用無水乙醇溶解定容到10ml，配成250mmol/lβ-紫羅蘭酮溶液。向5mllb培養基中加入5μl50mg/ml卡那黴素，分別接入500μl基因工程菌pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687，37℃培養至od600為0.6，加入200μlβ-紫羅蘭酮溶液，分別加入終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/liptg，32℃條件下轉化12小時，加入1ml氯仿萃取，取萃取液進行氣相檢測，考察不同iptg終濃度對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結果圖1，iptg終濃度分別為0.6、0.4和0.8和0.8mmol/l時效果最好。
(2)適宜催化轉化溫度。分別按最適的iptg添加量加入iptg誘導轉化12小時，加入1ml氯仿萃取，取萃取液進行氣相檢測，溫度設置分別為22、27、32、37和42℃，考察不同溫度對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結果見圖2，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687最適轉化溫度分別是32、27、37和37℃。
(3)適宜初始od600濃度。分別按最適的iptg添加量、最適的催化轉化溫度等最優條件誘導轉化12小時，加入1ml氯仿萃取，取萃取液進行氣相檢測，考察不同初始od600對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結果見圖3，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687最適初始od600分別是1.4、1.8、1.6和0.6。
(4)適宜催化轉化時間。分別按最優條件誘導轉化後加入1ml氯仿萃取，取萃取液進行氣相檢測，考察不同時間對二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結果見圖4，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687最適時間分別是12、18、15和21h。
(5)適宜的溶劑。按最優條件誘導轉化後加入1ml氯仿萃取，取萃取液進行氣相檢測，考察不同溶劑的影響。結果見圖5，當底物用無水乙醇作為溶劑時效果最好。
(6)適宜的底物加入量。按最優條件誘導轉化後加入1ml氯仿萃取，取萃取液進行氣相檢測，考察不同底物加入量的影響。結果見圖6，當用無水乙醇作為溶劑時，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687的最適底物加入量分別為150、250、250和200μl。
上述催化轉化後的產物經用氣相色譜質譜聯用儀tracedsq檢測確證。色譜條件：tr-5ms毛細管色譜柱，柱長30m，內徑0.25mm，膜厚0.25μm，載氣為高純度氦氣(he)，氦氣流速為1ml/min，進樣口溫度250℃。升溫程序：起始溫度為50℃，保持2min，以10℃/min升至120℃，保持2min。以5℃/min升至200℃，保持5min。質譜條件：接口溫度250℃，電離方式ei，離子電離能量70ev，質量掃描範圍(m/z)50-450。轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖如下：
(1)基因工程菌pet-28a-dbr1轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖7；
(2)基因工程菌pgex-4t1-dbr2轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖8；
(3)基因工程菌pet-28a-bacoye1轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖9；
(4)基因工程菌pgex-4t1-2687轉化β-紫羅蘭酮氣質檢測總離子圖10；
(5)空白對照試驗萃取液氣質檢測總離子圖11。
4、本發明所述青蒿醛雙鍵還原酶1的定性測定
(1)酶活的測定方法
反應體系500μl，20μl25mmol/lβ-紫羅蘭酮中加入360μl50mmol/ltris-hcl緩衝液(ph6.5)，45℃預保溫3min，再加入10μl100mmol/ldtt以及10μl50mmol/l還原輔酶nadph，最後加入100μl酶液(稀釋到合適的倍數)45℃反應10min。1ml氯仿終止反應並萃取。萃取液用氣相色譜檢測。酶活力單位(u)定義為：在測定條件下，每分鐘產生1nmol二氫β-紫羅蘭酮所需要的酶量為1個酶活力單位。
(2)最適反應溫度的測定
在20-55℃範圍內，每隔5℃，分別測定酶活。緩衝為50mmol/ltris-hcl緩衝液，ph7.5，結果如圖12所示。結果表明，本發明所述青蒿醛雙鍵還原酶1的最適反應溫度為45℃。
(3)最適ph測定
在不同的ph(5.0-9.0，50mmol/ltris-hcl緩衝液)條件下，分別測定酶活(反應溫度45℃)，結果如圖13所示。結果表明，本發明所述青蒿醛雙鍵還原酶1的最適反應ph為6.5。
(4)溫度穩定性測定
在ph6.5下，使酶在40℃，45℃，50℃溫度下分別保溫不同的時間(0，20，40，60，80，100，120min)，再測定相對酶活，以未保溫(4℃保存)的酶活性為100％，結果如圖14所示。結果表明，本發明所述本發明所述青蒿醛雙鍵還原酶1在40℃下保溫2h殘餘酶活力高於75％。
(5)ph穩定性測定
將純化的重組酶在不同的ph(5.0-9.0，50mmol/ltris-hcl緩衝液)下40℃處理1h，與不保溫酶的酶相比，結果如圖15所示。結果表明，本發明所述青蒿醛雙鍵還原酶1在ph5-7.5條件下，40℃保溫1h後仍能具有90％以上的殘餘酶活力。
5、本發明所述青蒿醛雙鍵還原酶1優選製備方法
將重組質粒pet-28a-dbr1轉化大腸桿菌bl21(de3)宿主菌(購自novagen公司)，在含有卡那黴素(50μg/ml)的lb平板(lb培養基：胰蛋白腖10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，瓊脂15g/l)上經過37℃培養過夜，挑轉化子到200ml的lb培養基中(50μg/ml卡那黴素)37℃，200rpm振蕩培養至od600為0.6時，加入終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mmol/liptg誘導劑，32℃培養18h。用高速冷凍離心機分別將200ml培養液在4℃下，以13,000rpm離心15min，收集菌體。在菌體中加入一定體積緩衝溶液，重懸後，超聲波破碎細胞，獲得全細胞裂解液，取一定體積全細胞裂解液以13,000rpm離心15min，獲得上清液可溶性蛋白溶液，沉澱即為不溶性蛋白—包涵體。我們通過測定上清液中青蒿醛雙鍵還原酶1活力以及產物二氫β-紫羅蘭酮的產量來評價不同表達條件的效果，結果如圖16所示。結果表明，當iptg濃度為0.6mmol/l時，本發明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。
誘導劑終濃度為0.6mmol/l，分別在22、27、32、37、42℃培養18h。考察溫度對誘導產酶活力的影響，結果如圖17所示。結果表明，當誘導溫度為27℃時，本發明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。
誘導劑終濃度為0.6mmol/l，在27℃培養18h。考察初始od600對誘導產酶活力的影響，結果如圖18所示。結果表明，當重組菌od600為1.8時，本發明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。
od600為1.8，誘導劑終濃度為0.6mmol/l，在27℃分別培養12、15、18、21、24h。考察時間對誘導產酶活力的影響，結果如圖19所示。結果表明，當培養基因重組菌18h時，本發明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。
6、本發明所述青蒿醛雙鍵還原酶1轉化β-紫羅蘭酮製備二氫β-紫羅蘭酮反應歷程
酶轉化反應體系為500μl，其中β-紫羅蘭酮濃度為1mmol/l，酶添加量約為30u/mg，反應在ph6.5，45℃下進行，分別對不同反應時間(0，10，20，30，60min)的樣品利用gc進行成分檢測，結果見圖20-1～圖20-5。檢測結果表明，隨著反應時間的延長，轉化率逐漸提高。在反應60min後，二氫β-紫羅蘭酮濃度為76.49mg/l，底物有效轉化率為78.77％。
以上僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
sequencelisting
南京林業大學
青蒿醛雙鍵還原酶dbr1及其重組菌在製備二氫-β-紫羅蘭酮中的應用
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